PA-X基因的長度變化對H3N2犬流感病毒復制能力和致病性的影響

李 舜，李桂珍，原耀賢，李康健，馬春全，李守軍，黃良宗*，馬 駿*

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528225； 2.廣東科貿職業(yè)學院動物科技學院，廣州 510430；3.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642; 4.佛科院附屬動物醫(yī)院，佛山 528225)

甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)是指屬于正黏病毒科A型流感病毒屬的病毒。該類病毒的基因組是由8個負鏈的RNA節(jié)段組成，根據其表達的蛋白功能，8個基因節(jié)段分別被命名為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS1[1]。IAV可在包括人在內的多個物種間進行跨宿主傳播，這既對公共衛(wèi)生安全造成了威脅，也增加了對該疫病防控的難度[2]。犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)是一種適應犬類宿主的IAV，是引起犬流感(canine influenza, CI)的主要病原[3]，其感染可引起犬的咳嗽、流鼻涕、打噴嚏、發(fā)熱等臨床癥狀。CIV感染對犬的危害不大，少有死亡的案例，但感染后易繼發(fā)其他病原微生物感染，使患病犬的病情加重，嚴重時可致死亡[4-5]。

目前在犬群中流行的CIV主要有H3N8和H3N2兩種亞型，H3N8 CIV主要在美洲犬群中流行，而H3N2 CIV主要在亞洲的犬群中流行[6]。2004年，研究者自美國佛羅里達州一只患有CI的賽犬身上成功分離出了一株CIV，經驗證，該病毒與H3N8馬流感病毒的基因組高度相似，這是H3N8 CIV在世界范圍內的首次報道[7]。隨后經調查發(fā)現，H3N8 CIV已在美國多個州的犬群中廣泛流行[8-9]。2007年，韓國研究者首次報道了H3N2 IAV感染犬的案例，經系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現，該病毒的基因組與H3N2禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)的相似度最高，說明H3N2 CIV可能是由H3N2 AIV感染犬而形成的[10-13]。2010年，李守軍等[14]在中國地區(qū)分離并報道了H3N2 CIV，說明H3N2 CIV已在東亞地區(qū)廣泛傳播。

PA-X蛋白是近期發(fā)現的具有獨特合成機制的一種新型IAV蛋白。研究表明，有多種IAV的PA片段在翻譯蛋白質的時候，由于其mRNA連續(xù)使用了稀有密碼子UCC UUU CGU C(絲氨酸、苯丙氨酸和精氨酸)，導致核糖體在該位置的翻譯出現延遲，從而有概率跳過一個核糖核苷酸U，使核糖體將該序列翻譯為UCC UUC GUC(絲氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸)，并繼續(xù)合成多肽鏈，從而形成PA-X蛋白[15-16]。因此，這些IAV的PA序列在宿主細胞中既可以正常表達PA蛋白，也可以錯位表達具有232或252個氨基酸(amino acid, aa)的PA-X蛋白[16-18]。經研究發(fā)現，PA-X蛋白具有核苷酸切割活性和抑制宿主細胞的蛋白質合成的功能[19-21]。并且在IAV由禽類動物向哺乳類動物傳播的過程中，PA-X基因很多都發(fā)生了長度的改變，其編碼的多肽發(fā)生了大小由252 aa向232 aa的轉變[19]。因此，PA-X基因可能在IAV跨宿主感染的過程中發(fā)揮了重要作用。

犬作為人的伴侶動物，其既能感染哺乳動物流感，也能感染禽流感，這增加了犬將動物流感重組并傳播給人的風險[8]。但在CIV的研究中，少有涉及PA-X基因的研究。因此，本研究利用CIV的反向遺傳操作平臺分別拯救了3株表達不同長度PA-X基因的H3N2 CIV重組病毒，并通過比較3株重組病毒的聚合酶活性、復制效率及對小鼠的致病性，初步探索了PA-X基因的長度變化對H3N2 CIV的影響，為H3N2 CIV與宿主的相互作用及致病機制的研究提供了初步的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞、質粒和菌株

H3N2 A/canine/Guangdong/02/2011(H3N2 CIV) (GenBank No.:JX195340-JX195347)；犬腎上皮細胞(MDCK)、人胚胎腎細胞293T(293T)、H3N2 CIV 8質粒操作系統(tǒng)(pCIV-PB2、pCIV-PB1、pCIV-PA(本研究中也稱pCIV-PA-X-232)、pCIV-HA、pCIV-NP、pCIV-NA、pCIV-M、pCIV-NS)為華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院外產科教研室饋贈。

1.2 實驗動物和主要試劑

9日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術公司；SPF級4～6周齡雌性BALB/c小鼠，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。TRIzol和轉染試劑LipofectamineTM3000 Transfection購自Invitrogen公司。雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。

1.3 引物的設計合成和質粒的測序

根據參考文獻[22]中IAV的8個節(jié)段的擴增引物對，以PA序列的擴增引物對為基礎，利用Primer Premier 6.0軟件設計2對突變引物(下劃線表示突變位置)。PA-X_Knock-F：TATGGGATTCCTTCAGACAGTCCGAAAGA；PA-X_Knock-R：TCTAAGGAATCCCATAGCCCCCTGCTG；PA-X_252 W-F：TTAGAGCCTATGTGGATGGATTTGAAC；PA-X_252 W-R：CCACATAGGCTCTAAAATTTTCAAGGC。8質粒操作系統(tǒng)在使用前進行測序驗證，測序及引物合成由上海生工生物技術服務有限公司完成。測序正確的質粒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組病毒CIV_PA-X_252及CIV_PA-X_Knock的拯救

以操作質粒pCIV-PA為模板，利用PA-X_252 W-F/R引物對，將PA片段+1編碼區(qū)的第232位氨基酸由終止密碼子突變?yōu)樯彼?W)，從而使H3N2 CIV的PA-X基因表達大小為252 aa的PA-X蛋白。將突變后的PA質粒進行測序并與原序列對比，確認獲得目的突變質粒，命名為pCIV-PA-X-252。根據參照文獻[23]的反向遺傳操作技術，將質粒pCIV-PA-X-252與其他7個操作質粒共轉染至293T細胞，隨后置于37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h。收取細胞培養(yǎng)液，并將其接種至9日齡SPF雞胚，37 ℃培養(yǎng)48 h。隨后，收取尿囊液，用1%雞紅細胞進行血凝試驗(hemagglutination test, HA)驗證。提取有血凝效果的尿囊液RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板擴增出病毒的全基因組。測序并與原序列進行比對，確認結果無誤后，將重組病毒命名為CIV_PA-X_252。

以操作質粒pCIV-PA為模板，利用PA-X_Knock-F/R引物對進行操作，在不改變編碼氨基酸的前提下，將PA片段編碼區(qū)的第191、192位氨基酸的稀有密碼子替換為常用密碼子，使H3N2 CIV的PA片段不再因存在稀有密碼子而表達PA-X蛋白。將突變后的PA質粒測序并與原序列比對，確保獲得目的突變質粒，并命名為pCIV-PA-X_Knock。使用質粒pCIV-PA-X_Knock和其他7個操作質粒，以相同的操作拯救出重組病毒，而后擴增其全基因組，進行測序鑒定，確定結果無誤后將該重組病毒命名為CIV_PA-X_Knock。

使用pCIV-PA-X-232和其他7個操作質粒，以相同的操作拯救出重組病毒，而后擴增其全基因組，進行測序鑒定，確定結果無誤后將該重組病毒命名為CIV_PA-X_232。

1.5 重組病毒聚合酶活性的測定

分別將質粒pCIV-PA-X-232、pCIV-PA-X-252、pCIV-PA-X_Knock與操作質粒pCIV-PB2、pCIV-PB1，熒光素酶報告質粒pPolI-Luci-NP(各250 ng)以及作為內參的海腎熒光素酶表達質粒(25 ng)共轉染至12孔板中的293T細胞中，每組3個重復，轉染步驟按說明書進行。孵育48 h后按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進行檢測，按照公式(RLU1/RLU2)來計算雙熒光素酶的比值，其中RLU1為熒光素酶反應強度，RLU2為海腎熒光素酶熒光強度。

1.6 重組病毒在MDCK細胞中生長曲線的測定

以MOI=0.1的感染劑量將3株重組病毒分別接種到12孔板的MDCK細胞中，每組3個重復，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在感染后的第12、24、36、48小時收集細胞上清液。將收集的上清使用DMEM進行十倍倍比稀釋，以10-12～10-1稀釋度分別接種到96孔板上的MDCK細胞中，每孔接種100 μL。孵育48 h后通過HA進行驗證，根據Reed-Muench算法測定病毒的TCID50，并繪制重組病毒的生長曲線。

1.7 小鼠致病性試驗

按照“1.6”中方法測定重組病毒TCID50。將BALB/c小鼠隨機分成4組，每組15只。使用無菌DMEM將3株重組病毒分別稀釋至106TCID50·50 μL-1。使用CO2麻醉小鼠后，通過鼻腔接種50 μL病毒液，Control組接種同等量的無菌DMEM。每天定時稱量小鼠體重，并觀察各組小鼠的臨床癥狀。

在攻毒后第1、3、5天，每組隨機選擇3只小鼠進行安樂死，并通過剖檢獲取小鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，將其置于無RNA酶的離心管內；將獲得的組織樣品稱重，按照1 mL·g-1的劑量在無菌條件下加入含1%雙抗的DMEM進行研磨，而后放入-80 ℃進行反復凍融，隨后4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液并使用0.22 μm濾膜進行過濾，使用不含血清的DMEM對過濾后的上清液進行十倍倍比稀釋，以10-8～10-1稀釋度分別接種到96孔板上的MDCK細胞中，每孔接種100 μL，孵育48 h后收集上清液并進行HA驗證，根據Reed-Muench算法測定各組織器官中感染病毒的TCID50。

在攻毒后的第5天，每組隨機選擇3只小鼠，安樂死后進行解剖，采集其肺并觀察其剖檢病變，隨后用4%多聚甲醛對采集的肺固定24 h。處理好的樣品送由武漢塞維爾生物科技有限公司進行組織病理切片的制作。每組余下的3只小鼠稱量體重至第12天。在試驗過程中，若小鼠體重下降超過自身原本體重的20%，則判定為死亡。

1.8 數據分析

所有統(tǒng)計分析均使用GraphPad Prism 8.0進行。病毒聚合酶活性的測定采用Student’st-test方法進行比較；生長曲線的測定采用Two-way ANOVA方法進行兩兩比對。當P<0.05時，則認為具有統(tǒng)計學意義上的差異。

2 結 果

2.1 重組病毒的拯救及鑒定

使用“1.1”中的8質粒操作系統(tǒng)，以“1.4”中的操作流程拯救重組親本病毒CIV_PA-X_232。使用質粒pCIV-PA-X-252和其余7個操作質粒以相同流程拯救重組病毒CIV_PA-X_252。使用質粒pCIV-PA-X_Knock和其余7個操作質粒以相同流程拯救重組病毒CIV_PA-X_Knock。擴增3株重組病毒的全基因組序列進行測序，并與H3N2 CIV的基因組進行比對。結果顯示，CIV_PA-X_232與H3N2 CIV基因組相一致；CIV_PA-X_252的PA序列顯示，第807位堿基由A突變?yōu)镚，PA編碼區(qū)+1閱讀框的第232位氨基酸由終止密碼子突變?yōu)閃，其它序列與H3N2 CIV的一致；CIV_PA-X_Knock的PA序列顯示，第680、681、683位堿基分別由T、C、T突變?yōu)镃、A、A；其他序列與CIV_PA-X_232的一致(圖1)。結果表明，重組病毒CIV_PA-X_232，CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock拯救成功。

虛線部分表示PA蛋白的翻譯過程不受影響，不形成PA-X蛋白；下劃線處表示突變位點The dot line means the PA protein is normally expressed, thus not express the PA-X protein. The mutation sites were marked with underline圖1 重組病毒中PA-X蛋白長度的示意圖Fig.1 The PA-X protein length in different recombinant virus

2.2 重組病毒的聚合酶活性分析

為探究不同長度的PA-X基因對H3N2 CIV聚合酶活性的影響，以雙熒光素酶法測定3株重組病毒的聚合酶活性。結果顯示，CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock的聚合酶活性均顯著(P<0.05)高于CIV_PA-X_232，其中，CIV_PA-X_252約為CIV_PA-X_232的4倍，約為CIV_PA-X_Knock的2倍(圖2)。結果表明，PA-X基因的長度變化能影響H3N2 CIV的聚合酶活性，且表達大小為252 aa多肽的PA-X基因能顯著增強H3N2 CIV的聚合酶活性。

*.P<0.05；ns.差異不顯著*.P<0.05; ns.Not significant圖2 重組病毒的聚合酶活性Fig.2 Polymerase activity of recombinant viruses

2.3 重組病毒在MDCK細胞中生長曲線的測定

3株重組病毒均以MOI=0.1的感染量接種MDCK細胞。感染后每隔12 h收集12孔板中的細胞上清液，并測定病毒的TCID50。結果顯示，三個重組病毒在接種后12～36 h的病毒滴度均呈逐漸上升趨勢，但CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock病毒滴度均高于CIV_PA-X_232；而在36～48 h的病毒滴度則呈下降趨勢，其中CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock在48 h的病毒滴度均顯著(P<0.05)高于CIV_PA-X_232(圖3)。結果表明，PA-X基因表達大小為252 aa的PA-X蛋白或不表達PA-X蛋白時能增強H3N2 CIV在MDCK細胞中的復制能力。

突變病毒與親本病毒之間的顯著性差異(P<0.05)用a、b、c進行標注，a表示CIV_PA-X_232與CIV_PA-X_252；b表示CIV_PA-X_252與CIV_PA-X_Knock；c表示CIV_PA-X_232與CIV_PA-X_KnockSignificant differences (P<0.05) between infected groups are marked by a, b, c (a. CIV_PA-X_232 and CIV_PA-X_252; b. CIV_PA-X_252 and CIV_PA-X_Knock; c. CIV_PA-X_232 and CIV_PA-X_Knock)圖3 重組病毒在MDCK細胞中的生長曲線Fig.3 The growth curve of recombinant viruses on MDCK cells

2.4 重組病毒對小鼠的致病性研究

2.4.1 小鼠攻毒后體重變化的測定 使用無菌的DMEM將CIV_PA-X_252，CIV_PA-X_232和CIV_PA-X_Knock分別稀釋至106TCID50·50 μL-1，并通過鼻腔攻毒小鼠。隨后，每天定時稱量各組小鼠的體重并觀察小鼠臨床癥狀。在12 d試驗期內，各組別小鼠均無死亡，存活率為100%。攻毒后的小鼠表現出被毛粗亂，精神不振，食欲減退等現象，Control組各小鼠均表現正常。體重變化曲線圖顯示，3株重組病毒小鼠體重在攻毒后5 d內總體呈下降趨勢，隨后體重逐漸增加；CIV_PA-X_252組的體重下降速率稍大于CIV_PA-X_Knock組和CIV_PA-X_232組(圖4)。結果表明，不同長度的PA-X基因對H3N2 CIV影響小鼠體重的變化較弱，且3株重組病毒對小鼠均不具有致死性。

圖4 攻毒后的小鼠體重變化曲線Fig.4 Body weight change of mice infected with recombinant viruses

2.4.2 小鼠感染重組病毒后各臟器病毒滴度的測定 通過對小鼠感染后不同臟器在感染不同時間的病毒滴度進行測定，結果表明，3株重組病毒感染小鼠后，僅有肺在1 dpi能檢測出病毒滴度(表1)；與CIV_PA-X_232感染小鼠后肺病毒滴度相比，重組病毒CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock感染小鼠后肺的病毒滴度均略有升高，但3組數據之間無顯著性差異(P>0.05)。說明在本研究中，PA-X基因的長度改變對H3N2 CIV在小鼠肺中復制能力的影響不存在顯著差異。

表1 攻毒后的小鼠肺的病毒滴度Table 1 Virus titers of recombinant viruses in infected mouse lung

2.4.3 重組病毒對小鼠肺造成的組織病理學變化 為比較3株重組病毒對小鼠肺所造成的病理損傷，在小鼠攻毒后的第5天，每組隨機選擇3只小鼠進行安樂死，采集其肺并制作病理切片。結果顯示，Control組無明顯的病理變化(圖5 A)；CIV_PA-X_252組能觀察到氣管、血管周邊的炎性細胞增多，肺泡壁增厚且能觀察到大量的紅細胞，同時還有肺泡融合現象的出現(圖5 B)；CIV_PA-X_232組觀察到肺泡間質增寬，炎性細胞增加且發(fā)現有肺泡融合現象(圖5C)；CIV_PA-X_Knock組觀察到有肺泡融合現象，并伴有少量的充血、出血的現象(圖5D)。結果表明，3株重組病毒均能對小鼠肺造成病理損傷，其中CIV_PA-X_252對小鼠肺的病理損傷強于CIV_PA-X_232，而CIV_PA-X_Knock弱于CIV_PA-X_232的致病性，表明PA-X基因的長度變化能夠影響H3N2 CIV對小鼠的致病能力。

病理變化用黑色箭頭標記Pathological changes were marked by black arrows圖5 攻毒后小鼠肺的病理組織變化Fig.5 Histopathological changes of mice lungs infected with recombinant viruses

3 討 論

IAV能夠通過突變或重組的方式改變自身的毒力，而PA-X蛋白是其毒力因子之一[24]。PA-X蛋白具有一定的宿主特異性，Shi等[21]通過對不同來源的IAV的PA-X氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現在10 164個PA-X氨基酸序列中有2 279條序列大小為232 aa，這些序列主要來源于人流感病毒pdm09、H1N1豬流感病毒、H3N2 CIV及H3N8 CIV等哺乳動物流感病毒，而大多禽源流感病毒的PA-X蛋白大小都為252 aa。這說明PA-X蛋白的縮小主要發(fā)生于AIV在豬群和犬群中進行傳播和適應的過程中，意味著PA-X基因的長度變化可能與IAV適應新宿主的過程相關，并且可能在病毒的跨宿主傳播的過程中發(fā)揮了重要作用[19]。

為明確PA-X基因的長度改變對IAV的影響，多位研究者通過反向遺傳技術對不同毒株的PA-X基因進行了延長或截短。Gao等[25]研究發(fā)現，表達大小為252 aa PA-X蛋白的IAV毒株在A549細胞中的復制效率高于不表達PA-X蛋白的IAV毒株；在另一個研究中，Gao等[26]發(fā)現不表達PA-X蛋白的pdm09毒株和H3N2 AIV毒株對小鼠和家禽有更強的致病力。李魯兆等[27]研究發(fā)現，在抑制H9N2亞型禽流感病毒的PA-X基因表達后，其病毒聚合酶活性顯著提高。Wang等[28]通過對A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)毒株的PA-X基因進行研究，發(fā)現表達252 aa PA-X蛋白的重組毒株，在多種細胞上的復制能力、聚合酶活性和致病性均顯著高于表達232 aa PA-X蛋白的重組毒株。以上研究說明了PA-X基因能影響IAV的致病力及復制能力，那么PA-X基因是如何產生這些作用的？Khaperskyy的研究表明，PA-X蛋白可以選擇性切割由宿主RNA聚合酶II轉錄的未成熟mRNA，從而降低宿主細胞表達蛋白質的效率，進而抑制宿主細胞的天然免疫反應，而IAV本身基因組的合成則受PA-X蛋白的影響較小，這一作用也稱為宿主細胞關閉作用(host shut off)[29]。然而，不同宿主，不同毒株，不同大小的PA-X蛋白所產生的“host shut off”的效果并不一致，其原因還有待進一步的研究。

H3N8 CIV和H3N2 CIV都是近期IAV成功實現跨宿主傳播的例子，但目前尚缺乏研究。Liu等[30]研究發(fā)現，在PA-X基因表達長為232 aa PA-X蛋白時，H3N8 CIV(A/canine/Colorado/6723-8/2008)和H3N2 CIV(A/canine/Beijing/362/2009)在MDCK細胞上的復制能力和對犬的致病能力均高于表達252 aa PA-X蛋白，而聚合酶活性變化卻不明顯。為進一步探究PA-X基因長度對H3N2 CIV的影響，本研究利用CIV的8質粒操作系統(tǒng)，通過反向遺傳技術拯救了3株表達不同長度PA-X蛋白的CIV重組病毒，并開展相關研究進行探索。結果顯示，PA-X基因的延長和不表達均能顯著(P<0.05)提高H3N2 CIV病毒在MDCK細胞上的復制能力和聚合酶活性。而在致病性試驗中，PA-X基因的延長略微增強了H3N2 CIV對小鼠的致病性，而PA-X基因的表達缺失則略微削弱了H3N2 CIV對小鼠的致病性。本研究的結果與Liu等[30]的結果并不一致，這可能是由PA-X基因的毒株特異性造成的。后續(xù)可進一步對這幾株CIV的PA-X基因序列進行比較研究，探索影響PA-X基因毒株特異性的因素。

犬的呼吸道內皮細胞內同時具有α-2,3-Gal和α-2,6-Gal受體，這表明犬具有成為流感病毒“混合器”的潛力[31-32]。因此，對犬流感病毒進行監(jiān)控與研究有助于流感的防控與治療。隨著H3N2 CIV在犬群中的快速傳播，PA-X基因發(fā)生突變的概率也會升高，若PA-X基因表達缺失，可能會增加H3N2 CIV對新宿主的適應性，若PA-X基因的長度延長，則可能增加H3N2 CIV的致病性。本研究的結果為探索PA-X蛋白對IAV的作用提供了參考，也為H3N2 CIV致病機制的研究提供初步的研究基礎。

4 結 論

PA-X基因的延長能夠提高H3N2 CIV在MDCK細胞中復制能力和對小鼠肺造成病理損傷的能力，但該變化可能對H3N2 CIV在小鼠肺內的復制能力沒有影響。