非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定

齊艷麗，劉桃雪，于海深，張 超，魯維飛，王 江，褚貝貝*，張改平*

(1.河南農業大學 農業部動物生化與營養重點開放實驗室，鄭州 450046；2.河南農業大學 河南省動物生長發育調控重點實驗室，鄭州 450046；3.河南農業大學 動物免疫學國際聯合研究中心，鄭州 450046)

非洲豬瘟(African swine fever， ASF)是一種復雜和高度致命的出血性疾病，能夠感染不同品種和年齡的家豬和野豬。已被世界動物衛生組織(OIE)定義為最危險和最持久的動物疾病之一[1]，臨床癥狀主要表現為持續性發熱，伴隨有呼吸困難、心跳加速、分泌物增加、胃腸道黏膜和淋巴結出血等表現[2]。非洲豬瘟疫情最早于20世紀20年代在肯尼亞暴發，目前在中歐、東歐和亞洲廣泛流行，給全球養殖業造成了嚴重經濟損失[3-4]。盡管對非洲豬瘟已進行了廣泛的研究，但是仍然缺乏有效的疫苗或抗病毒策略[5]。

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是唯一已知的DNA蟲媒病毒[6]。ASFV具有20面體形態，由中心核仁、核殼、內層包膜和衣殼及外包膜組成[7-8]，基因組是一個線性雙鏈DNA分子，長度為170～193 kb，有151～167個開放閱讀框[9-10]，編碼54種結構蛋白和100多種非結構蛋白，參與病毒基因組的復制、DNA修復、轉錄、病毒組裝及免疫逃逸等[11-12]。

p54蛋白是ASFV的重要結構蛋白之一，由E183L基因編碼，位于病毒的內囊膜，在病毒感染細胞時，與細胞質動力蛋白輕鏈結合，參與病毒的運輸[13]。p54蛋白是ASFV的主要抗原蛋白之一，被鑒定為潛在的血清學診斷抗原。血清中的p54抗體抑制病毒對豬巨噬細胞的黏附，抑制率約為60%[14-16]。因此，p54蛋白具有較好的抗原性，是理想的免疫抗原，可制備針對ASFV的中和抗體。

本研究對ASFV p54蛋白膜外區域序列(53—184 aa)進行原核密碼子優化，利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性重組p54蛋白，將其作為抗原免疫BALB/c小鼠，制備了6株針對p54蛋白的單克隆抗體，具有良好的特異性，對其抗原表位進行鑒定，并在預測的三級結構中進行標注。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)為本實驗室保存、人宮頸癌細胞(HeLa，CRM-CCL-2)、人胚胎腎細胞(HEK 293T/17，CRL-11268)購自美國ATCC。感受態細胞BL21 (DE3) 購自北京全式金公司；ASFVE183L基因由金斯瑞公司優化并合成；引物由上海生工生物工程有限公司合成。pET-30a-His-p54和pCAGGS-Flag-p54為本實驗室構建保存。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自Millipore公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、IPTG、HAT/HT培養基、融合劑PEG1450、小鼠抗Flag單抗、FITC標記的山羊抗鼠IgG均購自Sigma公司；小鼠抗His單抗購自中杉金橋公司；滅活ASF標準陽性血清購自中國獸醫藥品監察所；DAPI染色試劑購自Servicebio；HRP標記山羊抗鼠、豬IgG購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；蛋白質Marker購自Thermo Fisher公司；Ni-NTA Agarose購自QIAGEN公司；ProteinIso?Protein G Resin購自北京全式金生物技術有限公司；IgG抗體亞型鑒定試劑盒購自Sino Biological公司。

SPF(Specific Pathogen Free, SPF)級BALB/c小鼠購自鄭州大學實驗動物中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 密碼子優化 基于NCBI(MK128995.1)中China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株E183L基因序列，通過在線軟件Racc (http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC)進行大腸桿菌稀有密碼子分析，根據原核表達密碼子偏嗜性進行優化，基因序列由南京金斯瑞公司合成，并克隆至pET-30a載體。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析 將pET-30a-His-p54轉化至大腸桿菌BL21中進行誘導表達，在37 ℃，220 r·min-1條件下的恒溫搖床上震蕩培養至OD600 nm達到0.6左右時，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1的IPTG，再分別置于140 r·min-1條件下37 ℃誘導4 h、15 ℃誘導16 h，確定誘導p54重組蛋白表達的最佳條件。將誘導的菌液富集菌體，在低溫條件下進行超聲破碎，10 000 r·min-1、4 ℃離心，分別收集上清和沉淀。用SDS-PAGE膠進行電泳后再經考馬斯亮藍染色鑒定其可溶性。

1.2.3 重組蛋白的純化及Western blot鑒定 最佳誘導條件大量誘導表達p54重組蛋白，參照Ni-NTA Agarose操作技術手冊進行純化，通過SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色鑒定蛋白純度。BCA法測定p54蛋白濃度，定量為1 mg·mL-1后分裝保存于-80 ℃備用。純化后的p54蛋白經Western blot，使用小鼠抗His單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、ASF標準陽性血清為一抗，HRP標記的山羊抗鼠、豬IgG(1∶5 000稀釋)為二抗進行孵育顯色，鑒定重組p54蛋白。

1.2.4 免疫小鼠 將p54蛋白按照100 μg·只-1的劑量與弗氏完全佐劑1∶1乳化，背部多點皮下注射6周齡BALB/c雌鼠。2周后，用弗氏不完全佐劑與p54蛋白1∶1乳化，按照100 μg·只-1劑量連續免疫小鼠2次，間隔2周免疫1次。第3次免疫后2～3 d，對免疫小鼠進行尾靜脈采血，選取血清抗體效價高的小鼠進行沖擊免疫1次。

1.2.5 間接ELISA方法的建立 采用方陣滴定法，將不同濃度(5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 μg·mL-1)的p54蛋白100 μL·孔-1包被于96孔酶標板，將免疫小鼠血清以不同比例(1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200)稀釋作為一抗加入酶標板，未免疫小鼠血清作為陰性對照，37 ℃孵育1 h；將HRP標記山羊抗鼠IgG(1∶5 000)作為二抗加入酶標孔，37 ℃孵育1 h；單組份TMB顯色液顯色10 min；終止液終止反應；用酶標儀測定各孔OD450nm值。確定ELISA檢測方法的抗原最佳包被濃度[17]，建立間接ELISA檢測方法。

1.2.6 細胞融合及篩選 分離沖擊免疫小鼠的脾細胞，與SP2/0細胞10∶1進行融合。用間接ELISA方法篩選分泌抗p54抗體的陽性雜交瘤細胞，對篩選到的陽性雜交瘤細胞通過有限稀釋法進行4次亞克隆，獲得分泌p54單克隆抗體的細胞株。

1.2.7 單克隆抗體亞型的鑒定 使用Sino Biological小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對p54單克隆抗體進行亞型鑒定。

1.2.8 腹水的制備及純化 取12周齡BALB/c雌鼠，腹腔注射0.3 mL弗氏不完全佐劑，1周后，取約5×106個處于對數增殖期的6株單克隆細胞分別注入小鼠腹腔。待小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水并10 000 r·min-1離心10 min收集上清，采用硫酸銨沉淀法對獲得的小鼠腹水進行純化。

1.2.9 Western blot檢測 以pCAGGS-Flag-p54轉染HEK 293T/17細胞，24 h后，收取蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h； p54單克隆抗體(1∶1 000稀釋)為一抗，4 ℃孵育12 h；HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗室溫孵育1 h，顯色并分析試驗結果。

1.2.10 間接免疫熒光(IFA)檢測 以pCAGGS-Flag-p54轉染HeLa細胞，24 h后棄上清，用預冷的4%多聚甲醛于室溫固定細胞20 min，0.1%Triton-X 100通透10 min；使用含10%胎牛血清的PBS于室溫封閉1 h； p54單克隆抗體(1∶1 000)為一抗室溫孵育1 h；FITC標記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000)為二抗室溫避光孵育1 h；DAPI避光染色10 min；PBS、ddH2O分別洗3次后加入封片劑封片，避光晾干；置于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.11 單克隆抗體效價測定 以每孔1.25 μg·mL-1p54蛋白包被于96孔酶標板，采用間接ELISA法測定單克隆抗體效價，將6株單克隆抗體分別進行倍比稀釋，作為一抗進行孵育[18]。酶標儀測定各孔OD450nm值，陰性對照OD450 nm<0.2時試驗成立，待檢抗體OD450 nm/陰性對照OD450 nm(S/N)≥2.1的最大稀釋倍數作為抗體效價。

1.2.12 交叉反應性試驗 將p54重組蛋白、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬細小病毒(PPV)、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(SADS-CoV)、豬圓環病毒2型(PCV2)1.25 μg·mL-1包被酶標板，以ASFV陰性血清、ASFV陽性血清作為對照，間接ELISA法對p54單克隆抗體進行交叉反應性檢測[19]。

1.2.13 抗原表位鑒定 利用NetSurfP Ver.1.1 (http://gps.biocuckoo.cn/online_full.php) 預測p54蛋白的二級結構，將p54蛋白進行逐步截短并克隆至pGEX-4T-3載體中，分別命名為Δ1、Δ2、Δ3、Δ4。以制備的單克隆抗體(1∶1 000)作為一抗，通過Western blot鑒定p54單克隆抗體所識別的抗原表位區域[20-22]。

1.2.14 ASFV p54蛋白三級結構預測 使用I-TASSER (https://zhanggroup.org/I-TASSER/) 在線預測ASFV p54蛋白三級結構[23]，在PyMOL軟件中標注出p54單克隆抗體所識別抗原表位區域。

2 結 果

2.1 原核密碼子優化

對優化后合成的E183L基因序列進行測序，與原始序列比對發現堿基序列發生改變(以紅色字體表示)，但氨基酸未改變(圖1)。

A. “Optimized”為E183L密碼子優化后序列，“Original”為E183L原始序列，優化的堿基標為紅色；B. “Optimized”為密碼子優化后p54蛋白的氨基酸序列，“Original”為原始p54蛋白氨基酸序列A. ‘Optimized’ refers to the optimized E183L gene sequence, ‘Original’ refers to the original E183L gene sequence, and the optimized bases are marked in red color；B. ‘Optimized’ refers to the p54 protein amino acid sequence encoded by optimized codon, and ‘Original’ refers to the p54 protein amino acid sequence encoded by original codon圖1 E183L基因優化后序列比對Fig.1 Sequence alignment after E183L gene optimization

2.2 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析

采用不同濃度IPTG和溫度誘導p54蛋白表達，經SDS-PAGE電泳分析，結果顯示19.9 ku的目的蛋白，IPTG濃度為0.6～0.8 mmol·L-1，溫度為37 ℃，4 h誘導效果最佳；p54蛋白大部分以可溶性的形式存在于上清液中(圖2)。

A. 37 ℃誘導4 h重組蛋白表達情況；B. 15 ℃誘導16 h重組蛋白表達情況；C. 重組蛋白的可溶性分析；M. PageRuler預染蛋白相對分子質量標準A. Expression of recombinant protein induced at 37 ℃ for 4 h; B. Expression of recombinant protein induced at 15 ℃ for 16 h; C. Solubility analysis of recombinant protein; M. PageRuler prestaining protein marker圖2 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析Fig.2 Induced expression and solubility analysis of recombinant protein

2.3 重組蛋白的純化及Western blot鑒定

使用Ni-NTA Agarose純化重組p54蛋白，以不同濃度的咪唑進行洗脫，收集每步驟洗脫液進行SDS-PAGE電泳分析，得到高純度的p54蛋白，濃度為1 mg·mL-1，并進行Western blot鑒定。結果顯示p54重組蛋白的最佳咪唑洗脫緩沖液濃度為100 mmol·L-1；純化的His-p54重組蛋白能與His單克隆抗體、ASF標準陽性血清特異性結合，蛋白大小為19.9 ku(圖3)。

A.重組蛋白His-p54純化結果；B. His單克隆抗體；C. ASF標準陽性血清；M. PageRuler預染蛋白相對分子質量標準A. The purification results of recombinant His-p54 protein；B. His monoclonal antibody；C. ASF standard positive serum；M. PageRuler prestaining protein marker圖3 蛋白純化及鑒定結果Fig.3 Protein purification and identification results

2.4 抗原最佳包被含量的確定

以陽性血清OD450 nm接近于1、陰性血清OD450 nm<0.2、陽性血清OD450 nm/陰性血清OD450 nm(P/N)最大值組合的p54包被含量為最佳。結果顯示當抗原濃度為1.25 μg·mL-1，血清稀釋度為1∶1 600時，血清OD450 nm為1.020，陰性對照OD450 nm為0.091，抗體OD450 nm/陰性對照OD450 nm(P/N)為11.147，該組合為最佳，即抗原最佳包被濃度為1.250 μg·mL-1(表1)。

表1 ASFV p54蛋白最佳包被濃度Table 1 The optimal coating concentration of ASFV p54 protein

2.5 單克隆抗體亞型的鑒定

p54單克隆抗體28G12-1、31G7-1、31G7-2重鏈均為IgG2a型，35F10-1、35F10-2、38D3-1重鏈均為IgG1型；輕鏈均為κ鏈。

2.6 Western blot檢測

經Western blot檢測結果顯示pCAGGS-Flag-p54成功表達，獲得的6株p54單克隆抗體均能與p54蛋白發生特異性反應，蛋白大小約為25 ku(圖4)。

Vector. pCAGGS-Flag真核表達空載蛋白；Flag-p54. pCAGGS-Flag-p54真核表達p54蛋白Vector. pCAGGS-Flag eukaryotic expression of empty carrier protein；Flag-p54. pCAGGS-Flag-p54 eukaryotic expression of p54 protein圖4 Western blot鑒定p54單克隆抗體的特異性Fig.4 Western blot analysis of the specificity of monoclonal antibodies of p54 protein

2.7 間接免疫熒光(IFA)檢測

經IFA檢測，共聚焦顯微鏡結果顯示pCAGGS-Flag-p54成功表達，6株單克隆抗體均能與p54蛋白發生特異性反應，在顯微鏡下可見綠色熒光，定位于細胞質中(圖5)。

圖5 IFA鑒定p54單克隆抗體的特異性Fig.5 IFA analysis of the specificity of monoclonal antibodies against p54

2.8 單克隆抗體效價測定

經間接ELISA檢測p54單克隆抗體效價，結果顯示28G12-1、31G7-1、31G7-2單克隆抗體進行1∶409 600稀釋時仍為陽性，35F10-1、35F10-2、38D3-1單克隆抗體的效價分別達到1∶102 400、1∶51 200、1∶25 600(圖6)。

圖6 ASFV p54單克隆抗體效價Fig.6 Titer of monoclonal antibodies against ASFV p54

2.9 交叉反應性試驗

圖7 ASFV p54單克隆抗體交叉反應性試驗Fig.7 Cross reaction assay of monoclonal antibodies against ASFV p54

2.10 抗原表位鑒定

ASFV p54蛋白二級結構由無規卷曲、α螺旋、β折疊構成(圖8)；對p54肽段進行截短，保證每段α螺旋、β折疊的完整，進一步Western blot分析，結果顯示肽段53—184 aa、53—126 aa、108—184 aa、127—163 aa、147—184 aa表達成功，6株單克隆抗體可識別p54蛋白C端肽段Δ3(127—163aa)，不識別Δ4(147—184 aa)，故抗原表位區域為127—146 aa，氨基酸序列為“VMATGGPAAAPAAASAPAHP”(圖9)。

圖8 ASFV p54蛋白二級結構預測Fig.8 Secondary structure prediction of ASFV p54 protein

A. ASFV p54蛋白截短示意圖；B. p54蛋白抗原表位鑒定A. Truncation schematic diagram of ASFV p54 protein; B. Identification of p54 protein epitopes圖9 ASFV p54蛋白抗原表位鑒定Fig.9 Epitopes identification of ASFV p54 protein

2.11 p54三級結構

在p54蛋白三級結構可視化的基礎上，標注出p54單克隆抗體識別抗原表位區域127—146 aa(圖10，以紅色區域表示)。

圖10 ASFV p54蛋白的三級結構Fig.10 Tertiary structure of ASFV p54 protein

3 討 論

ASFV是一種使家豬和野豬高度致命的病毒，自2007年傳入高加索地區以來，繼續在東歐和俄羅斯傳播，目前蔓延至西歐、中國和東南亞等多個國家和地區，對全球養豬業構成了嚴重的威脅[23-24]。針對非洲豬瘟的各種疫苗策略已經進行了研究，早期側重于以抗原為基礎的方法，旨在誘導中和血清學反應，以CD2v為抗原不能引起機體足夠的免疫保護，此后，許多亞單位疫苗的方法都集中在p54和p30，數據結果顯示p54和p30同時免疫機體可延緩ASF臨床癥狀，因此深入對ASFV蛋白質組和單個蛋白質功能的研究，對合理設計靶向疫苗方法具有重要意義[25-27]。

早期準確診斷ASFV具有重要的價值，目前檢測的方法大部分是以p72、p30等作為檢測對象，經研究發現p54蛋白也可以作為診斷抗原用于ASFV感染中期或者后期的血清學診斷。因此本研究通過原核表達系統，建立了獲得可溶性p54蛋白的體系，且蛋白純度高，經ASFV標準陽性血清鑒定，具有良好的反應原性，可用于間接ELISA來檢測ASFV的感染，對p54蛋白結晶的解析也具有潛在的研究價值[28]。進一步利用p54蛋白免疫小鼠，制備了高特異性的p54單克隆抗體，可用應用于阻斷ELISA方法的建立，為血清學檢測方法的進一步發展提供了材料[29-33]。

p54是位于病毒粒子內膜的II型跨膜蛋白，其C端具有多個糖基化和磷酸化位點，有動力蛋白結合域(DBD)，以往對p54抗原區域的研究僅限于DBD 中149—161 aa之間的一個線性表位[34]?，F已有研究證明p54蛋白的抗原表位區域還有：23—29 aa、36—45 aa、65—75 aa、72—94 aa、93—113 aa、114—120 aa、118—127 aa、137—150 aa、175—185 aa[35-36]。表位是決定病毒結構蛋白抗原性和誘導體液免疫反應的關鍵因素，表位的研究有助于提高檢測試劑的檢測效率及亞單位疫苗的研發，本研究鑒定出一個新的p54蛋白抗原表位區域127—146 aa，有望為改進ASFV檢測、監測和疾病控制提供有價值的新靶點，在ASFV疫情監測和控制中具有潛在的應用價值[37-39]，也為針對p54的表位疫苗的研制提供了基礎。目前已有研究報道ASFV病毒顆粒[8]和p72蛋白的結構解析[40]，但是沒有關于p54蛋白結構解析的報道，故本研究通過I-TASSER軟件在線預測ASFV p54蛋白三級結構，并標注出p54單克隆抗體識別的抗原表位區域，為ASFV p54蛋白結構的可視化提供了幫助。

4 結 論

本研究成功獲得p54重組蛋白和6株具有不同亞型的p54單克隆抗體，鑒定出p54抗原表位區域為127—146 aa，為后續p54蛋白在ASFV發病機制中功能的研究奠定了基礎，也為ASFV p54多肽疫苗的研發提供了幫助。