副豬格拉瑟菌5型細胞致死性膨脹毒素CdtB破壞豬呼吸道上皮屏障的機制

陳 敏，劉明星，張鵬云，藺輝星，范紅結

(南京農業大學動物醫學院/農業農村部動物細菌學重點實驗室，南京 210095)

副豬格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis，GPS)是革蘭陰性細菌，分布于世界各地，包含15種血清型，其中血清4型和血清5型在世界流行最為廣泛[1-2]。臨床上以體溫升高、關節腫脹、呼吸困難、多發性漿膜炎、關節炎和高死亡率為特征，給養豬業造成巨大的經濟損失[3-4]。在環境應激、機體免疫力下降以及其他病原共感染時，該菌可突破呼吸道屏障，經血液循環引起豬系統性感染，其中肺組織損傷最為嚴重[5]。黏膜屏障是宿主抵御呼吸道病原菌的第一道防線，其中黏膜上皮細胞間形成的頂部連接復合體(apical junctional complexes, AJC)可作為物理屏障阻擋病原菌。AJC包括緊密連接(tight junction, TJ)、黏附連接(adherens junction，AJ)和橋粒(desmosome)[6]。TJ位于極化上皮的頂端部分，調節單層上皮細胞的細胞旁通透性[7]。

細胞致死性膨脹毒素(cytolethal distending toxin, CDT)是一種由革蘭陰性細菌所產生的AB2型毒素，被編碼在具有3種蛋白質CdtA、CdtB和CdtC的單個操縱子中[8]。其中CdtB是活性毒性單位，對宿主細胞的損傷起主要作用，兩個亞基CdtA和CdtC構成CDT與靶細胞結合以及將CdtB遞送到細胞內部所需的“B2”單位[9]。在目前所知的GPS的15個血清型參考株中，均能表達CdtB[10]。細菌的外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是細菌特有的一種生理結構，可通過與質膜融合或通過內吞途徑攝取而將其內容物遞送至宿主細胞，在細菌與宿主的相互作用、免疫應答等方面發揮著重要的生物學功能[11]。另外，Zhang等[12]對GPS H45菌株的外膜囊泡做了蛋白組學分析，發現其表面存在許多GPS毒力因子，如CdtA、CdtB、CdtC、vtaA9、tbpA、manB、ompP5和Tbp。然而，CDT在GPS5-SQ菌株中是否以OMVs的形式存在未見報道。另外，目前對GPS OMVs的研究僅局限于OMVs蛋白組學分析，至于OMVs在GPS致病機制中的作用亦鮮有報道。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，它可以引起DNA損傷反應，導致特征性的G2/M細胞周期停滯、細胞腫脹和細胞核增大[13]。據報道，GPS的CDT蛋白全毒素會導致新生仔豬氣管上皮細胞(newborn piglet tracheal cell, NPTr)出現明顯的細胞膨脹和細胞凋亡[14]。在細胞凋亡過程中，Caspase可以裂解細胞骨架結構，包括緊密連接成分和黏附連接成分[15]。并且在誘導上皮細胞凋亡之后，跨上皮電阻值顯著降低，最終導致通透性的增加[16]。然而，副豬格拉瑟菌是否可以通過OMVs轉運CdtB蛋白引起豬呼吸道上皮細胞凋亡，進而破壞呼吸道上皮屏障未見報道。

本研究以豬呼吸道上皮細胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)為細胞模型，通過檢測OMVs和CdtB蛋白處理STEC后凋亡相關蛋白cleaved-caspase3的表達水平、緊密連接蛋白TJ的表達水平和細胞旁通透性，研究GPS通過OMVs傳遞CdtB蛋白引起STEC的細胞凋亡，進而突破細胞屏障的機制，其研究結果有助于進一步闡明GPS感染的致病機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及細胞 豬氣管上皮細胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)采用DMEM培養基(含10%胎牛血清)于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中進行培養。副豬格拉瑟菌5型GPS5-SQ菌株由本實驗室分離、鑒定并保存。pET-28a載體、pET-32a載體、大腸桿菌DH5α菌株、大腸桿菌BL21(DE3)菌株均由本實驗室保存；大腸桿菌Rosetta gami(DE3)plysS感受態細胞購自上海生工公司。

1.1.2 實驗動物 30只體重20～25 g的6周齡SPF級雌性ICR小鼠購自揚州大學實驗動物中心。

1.1.3 主要試劑 副豬格拉瑟菌適用培養基為胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(Tryptic Soy Broth，TSB)，購自美國BD公司；NAD(輔酶I)和瓊脂Agar購自德國BioFROXX生物試劑公司；T4 DNA連接酶和快切酶均購自大連TaKaRa生物工程公司；HRP-山羊抗小鼠IgG H&L和HRP-山羊抗兔IgG H&L二抗購自美國Invitrogen公司；Cleaved Caspase3單抗、ZO-1單抗、claudin-1單抗和occludin單抗購自美國CST公司；DiO染料購自MCE生物科技有限公司；TRITC Phalloidin 羅丹明鬼筆環肽和DAPI溶液購自北京索萊寶科技有限公司；2-嗎啉乙磺酸(MES)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHC)購自上海吉至生化科技有限公司；磁性聚合物納米微球購自上海奧潤微納新材料科技有限公司；Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建 以GPS5-SQ基因組為模板，設計特異性擴增hbpA、ompP2、cdtA、cdtB和cdtC基因的引物(見表1)，設計好的引物由南京金斯瑞生物公司進行合成。PCR反應體系為：DNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL，2×PrimeStar Max 25 μL，ddH2O 25 μL。擴增反應條件為：預變性95 ℃2 min；變性98 ℃ 10 s、退火55 ℃ 15 s、延伸72 ℃ 1 min，30個循環，終延伸72 ℃ 10 min。PCR產物經瓊脂糖電泳后回收。載體和PCR產物經內切酶進行雙酶切，反應結束后回收酶切產物，經T4 DNA連接酶連接并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于卡那或氨芐抗性的LB平板，37 ℃倒置培養過夜，挑取單克隆菌落培養后提取質粒進行酶切鑒定并送于南京擎科生物技術有限公司測序。

表1 本試驗所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this experiment

1.2.2 重組蛋白的表達及純化 提取的重組質粒經測序后轉化至大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta gami(DE3)plysS感受態細胞中，并在含有100 μg·mL-1氨芐抗生素的LB培養基中37 ℃培養。待OD600 nm為0.6時加入終濃度1 mmol·L-1的IPTG，然后放入16 ℃搖床中繼續過夜誘導12 h，次日超速破碎菌體并收集上清和沉淀，經SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色。利用His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂對重組蛋白進行純化。

1.2.3 多克隆抗體的制備 30只體重20～25 g的6周齡SPF級雌性ICR小鼠購自揚州大學實驗動物中心，隨機分為6組，每組5只，分別為Omp2組、HbpA組、CdtA組、CdtB組、CdtC組及PBS組。將純化后的重組蛋白與弗氏佐劑以體積比1∶1混勻后進行乳化。采用小鼠背部多點皮下注射的方式免疫小鼠3次。各免疫組小鼠的注射劑量為每只50 μg，首次免疫14 d后進行第二次免疫，首次免疫28 d后進行第三次免疫，分別在二免與三免后第7天收集小鼠血清保存于-80 ℃。另外，通過Mab Traap Kit抗體純化試劑盒對CdtB組多克隆抗體進行純化。

1.2.4 生長曲線測定 將凍存的GPS5-SQ菌液于TSA平板上復蘇，待平板長出單菌落后，挑取單菌落于2 mL TSB培養基(0.03 g·mL-1的TSB, 10%的FBS, 終濃度為0.1 mg·mL-1的NAD)中37 ℃，180 r·min-1過夜培養。將菌液按照1∶100轉接到新的20 mL的TSB液體培養基中，在37 ℃，180 r·min-1的恒溫搖床中培養14 h，每隔2 h取樣測定其在600 nm處的吸光值OD600 nm。

1.2.5 外膜囊泡的分離和標記 按照文獻報道的方法，經過密度梯度離心的方法提取外膜囊泡[17]。即將2 000 mL的GPS5-SQ菌液37 ℃、180 r·min-1的恒溫搖床中生長至對數生長期的后期(OD600 nm=1.2～1.4)，在4 ℃下以8 000×g離心15 min去除細菌細胞。通過0.22 μm過濾器過濾滅菌后，使用100 ku超濾管通過超濾濃縮上清液，最后通過在4 ℃下以150 000×g超速離心3 h(轉子類型50.2 Ti，Beckman-Coulter)收集OMVs。在用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)懸浮顆粒狀OMVs后，通過密度梯度離心用20%、25%、30%、35%和40%的OptiPrep [60%碘克沙醇(w/v)]進行純化。

將純化的OMVs進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色觀察OMVs中蛋白質的大小。透射電子顯微鏡(TEM，負染)和納米粒子直徑(NTA)分析OMVs粒子形態和數目，并測定蛋白濃度。用制備的多克隆抗體進行Western blot驗證，確定GPS OMVs中是否含有CDT蛋白。最后將純化的CdtB蛋白以及OMVs分別在SDS-PAGE中進行電泳分離，用CdtB多克隆抗體進行Western blot驗證，以便對OMVs進行定量。

將純化的OMVs與蛋白酶K一起孵育，驗證OMVs結構保護蛋白質免受蛋白酶降解的能力。對于標記，將OMVs與5 μg·mL-1的DiO孵育30 min，使用100 ku超濾管去除未摻入的染料，將40 μg·mL-1DiO標記的外膜囊泡在37 ℃下與STEC共孵育5 h。隨后用PBS洗滌，用4%多聚甲醛固定并依次用100 nmol·L-1的TRITC Phalloidin和100 nmol·L-1的DAPI避光孵育20 min，通過熒光顯微鏡對細胞進行成像。

1.2.6 細胞凋亡檢測 將STEC接種于6孔板中，待細胞生長至90%時，用不同濃度CdtB(50、100、500 ng·mL-1)和OMVs(20 μg·mL-1)分別與細胞共孵育36 h，陰性對照組加入無血清DMEM，陽性對照組加入1 μmol·L-1Staurosporine。待細胞處理36 h后，收集細胞并用500 μL的Annexin-V結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL異硫氰酸熒光素(FITC)和PI避光孵育15 min，流式細胞儀檢測凋亡細胞百分比。

將細胞與CdtB(500 ng·mL-1)和OMVs(20 μg·mL-1)分別孵育36 h，裂解細胞收集細胞總蛋白。定量后將pNA(10 mmol·L-1)用標準品稀釋液稀釋后用酶標儀檢測405 nm處的吸光度，制作pNA濃度標準曲線。取50 μL待檢樣品的細胞裂解上清液加入40 μL檢測緩沖液和10 μL的Ac-DEVD-pNA，37 ℃下避光反應l h。Caspase3的相對活性以凋亡誘導細胞與空白對照細胞的吸光度值(A405 nm)的比值表示(Staurosporine作為陽性對照，1 μmol·L-1，溶于DMSO)。

1.2.7 細胞毒性檢測 細胞凋亡后，細胞漿內酶活性較為穩定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)會釋放到培養液中，通過檢測細胞培養上清液中LDH的釋放量從而對細胞毒性進行分析[18]。將STEC以每孔103個細胞接種于96孔細胞板，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2細胞恒溫培養箱中培養。試驗設置空白對照組與實驗組，分別于6、12、24、36和48 h收集細胞培養上清液，LDH法測定細胞存活率，每個處理組設置3個重復孔，試驗共進行3次獨立重復。

1.2.8 上皮屏障完整性的測定 為了在體外建立STEC單層模型，將250 μL的細胞懸液接種在Transwell的上室中[19]。用移液管將600 μL含10% FBS的DMEM培養基加入下室，置于37 ℃，5% CO2條件下的細胞培養箱中。每天更換培養基提供營養；并用細胞電阻儀檢測電阻值，實時記錄，待數值穩定后進行后續試驗。

為評價CdtB蛋白和OMVs介導的屏障完整性調節的意義，單獨用CdtB和OMVs處理STEC，分別于處理0、6、12、24和36 h后測定細胞的電阻值。

同上處理細胞36 h后將上室的培養基換成FD4溶液(1 mg·mL-1，用HBSS緩沖液稀釋)，下室換成HBSS緩沖液，未處理的細胞單層用作對照。并于0和4 h取下室100 μL液體用熒光酶標儀中在490 nm的激發波長和520 nm的發射波長下測定基底外側小室的熒光強度；FD-4通量值(FI)的計算：每個樣本的熒光強度減去0 h測得的熒光強度，數據表示為與未感染對照細胞相比的倍數變化。

1.2.9 免疫磁珠分離 通過先前報道的方法進行免疫磁性分離，并進行了一些改動[20]：用N3-dimethylpropane-1,3-diamine和N-hydroxysuccinimide活化磁珠，將純化后的500 μg CdtB多克隆抗體與2 mg磁珠偶聯。取5 mg超速破碎后的OMVs加入到偶聯后的磁珠中，37 ℃孵育30 min，置磁力架上2～3 min，待磁珠充分被吸附，分別收集上清(IMC-CdtB)和其余液體(OMVs-ΔCdtB)。

1.2.10 蛋白免疫印跡 將STEC接種于12孔板中培養，待細胞長至90%時用CdtB蛋白、OMVs、OMVs-ΔCdtB等處理細胞36 h。然后用RIPA細胞裂解液在冰上裂解細胞以提取細胞總蛋白，進而在SDS-PAGE中進行電泳分離(每孔10 μg)。然后通過半干轉的方法將蛋白轉印至0.22 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉，2 h后加入用封閉液稀釋的特定的一抗并以45 r·min-1轉速在4 ℃搖床孵育過夜。次日將膜與HRP-山羊抗小鼠IgG H&L或HRP-山羊抗兔IgG H&L在室溫下孵育1 h，經TBST洗膜用ECL發光液曝光、顯影，并用Image Lab軟件分析結果。

1.2.11 數據統計與處理 使用ImageJ軟件對Western blot結果進行灰度分析，并利用GraphPad Prism 8.4.3軟件ANOVA檢驗比較各組數據的差異性。

2 結 果

2.1 重組質粒的鑒定

使用限制性內切酶BamH I與SalI對pET-28a、pET-28a-hbpA和pET-28a-ompP2載體進行雙酶切，使用限制性內切酶BamH I與EcoR I對pET-32a、pET-32a-cdtA、pET-32a-cdtB和pET-32a-cdtC載體進行雙酶切。酶切鑒定結果如圖1所示：表明成功構建hbpA-pET28a載體、ompP2-pET28a載體、cdtA-pET32a載體、cdtB-pET32a載體和cdtC-pET32a載體。

M.DL5000相對分子質量標準；1.pET-28a載體；2.pET-28a-hbpA載體；3.pET-28a-ompP2載體；4.pET-32a載體；5.pET-32a-cdtA載體；6.pET-32a-cdtB載體；7.pET-32a-cdtC載體M.DL5000 DNA Marker; 1. pET-28a plasmid; 2.pET-28a-hbpA plasmid; 3.pET-28a-ompP2 plasmid; 4.pET-32a plasmid; 5.pET-32a-cdtA plasmid; 6. pET-32a-cdtB plasmid; 7. pET-32a-cdtC plasmid圖1 質粒雙酶切鑒定Fig.1 Enzymatic digestion of plasmid

2.2 重組蛋白的純化

利用His鎳柱純化5種蛋白，rHbpA、rOmpP2、rCdtA、rCdtB和rCdtC重組蛋白經SDS-PAGE電泳鑒定后，分別在60、40、40、47和21 ku附近出現蛋白條帶，與預期結果一致。BCA測定5種重組蛋白的濃度分別為0.32、2.12、0.85、1.21 和0.94 mg·mL-1(圖2A)。將純化后的5種蛋白進行Western blot鑒定，一抗為鼠源抗His單克隆抗體，鑒定結果如圖2B，進一步證明5種蛋白成功表達并純化。

A. SDS-PAGE鑒定重組蛋白；B. Western blot鑒定純化的重組蛋白；M.蛋白質相對分子質量標準；1～5.純化的HbpA、OmpP2、CdtA、CdtB和CdtC蛋白A. Identification of recombinant protein by SDS-PAGE; B. Identification of purified recombinant protein by Western blot; M.Protein molecular weight standard; 1-5. Purified HbpA, OmpP2, CdtA, CdtB, CdtC proteins圖2 純化的重組蛋白 SDS-PAGE 檢測及 Western blot 鑒定Fig.2 The purified recombinant protein analyzed by SDS-PAGE and Western blot

2.3 多克隆抗體的Western blot分析

將純化后的5種蛋白以及GPS5-SQ菌體沉淀煮樣后進行Western blot鑒定，一抗為制備的多克隆抗體(均1∶5 000稀釋)。結果顯示，本研究制備的5種鼠抗HbpA、OmpP2、CdtA、CdtB和CdtC多克隆抗體具有良好的特異性(圖3A)。

A.多克隆抗體的Western blot分析。B. SDS-PAGE鑒定CdtB抗體的純度；M.蛋白質相對分子質量標準；1～6.純化的CdtB多克隆抗體A. Western blot analysis of polyclonal antibody. B. Identification of the purity of CdtB antibody by SDS-PAGE; M.Protein molecular weight standard; 1-6.Purified CdtB polyclonal antibody圖3 多克隆抗體的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of polyclonal antibody

用抗體純化試劑盒對CdtB多克隆抗體進行純化，純化后的抗體濃度為0.8 mg·mL-1。SDS-PAGE結果顯示純化后的抗體在55和25 ku左右出現兩條特異性條帶，與免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈大小一致(圖3B)。

2.4 副豬格拉瑟菌分泌的 OMVs 中可檢測到CdtB

根據生長曲線，GPS5-SQ菌株在2 h后開始進入對數期，8 h后進入平臺期，對數生長后期的OD600=1.2～1.4(圖4A)。在細菌生長的對數后期離心集菌，經透射電子顯微鏡(TEM)觀察，發現細菌周圍存在一些類似囊泡的結構(圖4B)。經密度梯度離心獲得純化后的OMVs，SDS-PAGE觀察到蛋白質主要集中在第4和第5泳道，即含有35%和40%碘克沙醇的密度層，OMVs的蛋白質大小集中在55 ～100 ku(圖4C)。將樣品進行TEM觀察，發現OMVs的粒徑在100～200 nm(圖4D)。納米粒子直徑分析(NTA)結果顯示，樣品在100～200 nm處的粒子數目最多(圖4E)。用制備的HbpA、OmpP2、CdtA、CdtB和CdtC多克隆抗體對外膜囊泡及不含外膜囊泡的細菌上清進行Western blot驗證，HbpA及OmpP2結果證明所提取的樣品為外膜囊泡；CDT結果證明CdtA、CdtB和CdtC在GPS中主要以外膜囊泡的形式存在(圖4F)。經Western blot驗證，100 μg的OMVs中含有2.5 μg的CdtB(圖4G)。

A. GPS5-SQ生長曲線；B. GPS5-SQ細胞外的OMVs(箭頭處)的透射電子顯微鏡圖片；C. SDS-PAGE分析OMVs各個密度梯度的蛋白大小。M. Maker；1～5分別為密度梯度20%、25%、30%、35%和40%的樣品；6. 超速離心后的細菌上清；7. 超濾濃縮后的細菌上清(<100 ku)；D. 透射電子顯微鏡觀察OMVs的大小, 箭頭指向OMVs；E. 納米粒子直徑分析粒子數目；F. 通過蛋白免疫印跡證明CdtB存在于OMVs中而非不含OMVs的上清中；1. 碘克沙醇濃度為35%的OMVs；2. 為碘克沙醇濃度為40%的OMVs；3. 為超速離心后的細菌上清(濃縮500倍)；4. 超濾濃縮后的上清(<100 ku，濃縮500倍)；G. 蛋白免疫印跡表明100 μg的OMVs中約含有2.5 μg的CdtBA. Growth curve of GPS5-SQ; B. Transmission electron micrographs (ultra-thin slices) image of OMVs (arrow) located at extracellular of GPS5-SQ; C. The protein size of each density gradient of OMVs was analyzed by SDS-PAGE. M. Marker; 1-5.OMVs samples with density gradients of 20%, 25%, 30%, 35% and 40% OptiPrep; 6. Bacterial supernatant after ultracentrifugation. 7.Bacterial supernatant after concentration by ultrafiltration (<100 ku); D. Transmission electron microscope observation of the size of OMVs (arrow); E. Nanoparticle diameter analysis of the number of particles; F. Distribution of CDT in OMVs and OMVs-free supernatants determined by Western blot with antibodies against Omp2 (an OMVs marker), HbpA, and CDT. 1. OMVs with iodixanol concentration of 35%; 2. OMVs with iodixanol concentration of 40%; 3. Bacterial supernatant after ultracentrifugation (concentrated 500 times); 4. Bacterial supernatant after ultrafiltration (concentrated 500 times). G. Western blot showed that 100 μg of OMVs contained approximately 2.5 μg of CdtB圖4 GPS5-SQ分泌的OMVs可檢測到CdtBFig.4 OMVs secreted by GPS5-SQ can carry CdtB

2.5 OMVs 可被STEC吸收

將純化的OMVs與STEC共孵育5 h，由熒光顯微鏡觀察可知，OMVs 可被STEC吸收至細胞核附近(圖5A)。另外，將純化的OMVs與蛋白酶K一起孵育，驗證OMVs 結構保護蛋白質免受蛋白酶降解的能力(圖5B)，結果顯示向囊泡中加入0.02% SDS對總蛋白質含量沒有影響(泳道2)，OMVs單獨與蛋白酶K(200 μg·mL-1)孵育顯示一些蛋白質降解(泳道3)，當樣品在SDS存在下與蛋白酶K一起孵育時，可以觀察到幾乎所有蛋白質的降解(泳道4)。

2.6 OMVs和CdtB可誘導STEC凋亡并增加氣管上皮屏障的通透性

單層細胞跨膜電阻值(TEER值)是評估細胞屏障完整性的指標[21]。體外構建STEC呼吸道上皮屏障模型，待TEER 值趨于穩定時構建成功(圖6A)。與對照組相比，CdtB(500 ng·mL-1)與OMVs(20 μg·mL-1)處理細胞36 h后電阻值顯著降低(圖6B)。

A.體外氣管上皮屏障模型的構建；B.CdtB和OMVs在與STEC共孵育36 h時降低了上皮屏障的 TEER；C.流式細胞儀分析細胞凋亡數目；D.細胞旁通透性的檢測，其中，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。下同A. Construction of tracheal epithelial barrier model in vitro; B. CdtB and OMVs reduced the TEER of the epithelial barrier when co-incubated with STEC for 36 h; C. Flow cytometry analysis of the number of apoptotic cells; D. The detect of paracellular permeability, in which * means P<0.05, ** means P<0.01, *** means P<0.001. The same as below圖6 OMVs和CdtB可誘導STEC凋亡并增加氣管上皮屏障的通透性Fig.6 OMVs and CdtB induce STEC apoptosis and increase the permeability of the tracheal epithelial barrier

由流式結果分析可知(圖6C)，Staurosporine、不同濃度CdtB(50、100、500 ng·mL-1)和20 μg·mL-1OMVs組處理STEC 36 h后細胞凋亡比例分別為27.36%、9.03%、11.17%、15.69%和13.2%；未處理單獨細胞凋亡比例為7.57%。

此外，通過檢測Transwell小室下層的FITC結合的葡聚糖來分析上皮屏障的完整性。相對于對照組，CdtB與OMVs處理36 h后下室的FD-4量顯著升高(圖6D)。上述結果表明OMVs和CdtB可誘導STEC凋亡并增加氣管上皮屏障的通透性。

2.7 OMVs和CdtB可誘導STEC凋亡并破壞STEC中的緊密連接

蛋白免疫印跡分析顯示，CdtB和OMVs處理STEC 36 h后cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著增加；TJ ZO-1和Occludin的表達水平降低，而claudin-1的表達水平與對照組相比無差異(圖7A、7B)。Caspase3活性檢測結果表明，與對照組相比，CdtB和OMVs組Caspase3活性均顯著增加，這與LDH測定結果相符(圖7C、7D)。以上結果表明，OMVs和CdtB可誘導STEC發生細胞凋亡，進而導致細胞間ZO-1和Occludin的蛋白表達水平下降，最終增加氣管上皮屏障的通透性。

A.通過蛋白免疫印跡分析ZO-1、Occludin、claudin-1和cleaved-caspase3的蛋白質水平；CT.陰性對照；Sta.陽性對照(Staurosporine, 1 μmol·L-1)；B.蛋白質條帶強度由ImageJ軟件量化；C.用Caspase3活性檢測試劑盒檢測凋亡相關蛋白的活性；D.OMVs或CdtB與STEC孵育6、12、24、36、48 h，通過LDH檢測試劑盒評估STEC的細胞毒性。ns代表組間無差異。下同A. The protein levels of ZO-1, occludin, claudin-1 and cleaved caspase3 were analyzed by Western blot; B.The intensity of the protein bands was quantified by ImageJ software. The p values were calculated with one-way ANOVA; C.The activity of apoptosis-related proteins was detected by a Caspase3 activity detection kit; D. OMVs or CdB were incubated with STEC for 6, 12, 24, 36, and 48 hours, and the cytotoxicity of STEC was evaluated by LDH detection kit. ns indicates no significant difference between groups. The same as below圖7 OMVs和CdtB可誘導STEC凋亡并破壞STEC中的緊密連接Fig.7 OMVs and CdtB cause apoptosis and TJ disruption in STEC

2.8 OMVs和CdtB誘導STEC發生p53依賴的細胞凋亡

用Pifithrin-α(PFT-α，凋亡p53通路抑制劑，使用濃度為20 μmol·L-1)預處理后，Pifithrin-α+CdtB組、Pifithrin-α+OMVs組cleaved-caspase3蛋白的表達水平明顯低于CdtB與OMVs單獨處理組，與對照組相比，Pifithrin-α+CdtB組與Pifithrin-α+OMVs組ZO-1和Occludin的蛋白表達水平無差異(圖8)。上述結果表明，OMVs和CdtB誘導STEC發生p53依賴的細胞凋亡，進而破壞STEC中的緊密連接。

A.蛋白質印跡分析ZO-1、Occludin和cleaved-caspase3的蛋白表達水平；B.蛋白質條帶強度由 ImageJ 軟件量化A. The protein expression levels of ZO-1, Occludin and cleaved-caspase3 were analyzed by Western blot; B.Protein band intensities were quantified by ImageJ software圖8 OMVs和CdtB誘導STEC發生p53依賴的細胞凋亡Fig.8 OMVs and CdtB induce p53-dependent apoptosis in STEC

2.9 OMVs通過轉運CdtB破壞STEC中的緊密連接

用先前制備的CdtB多克隆抗體檢測OMVs(超聲破碎后的)、OMVs-ΔCdtB和IMC-CdtB，Western blot結果顯示成功從OMVs中分離出CdtB，并獲得OMVs-ΔCdtB和IMC-CdtB(圖9A)。用CdtB、OMVs(超聲破碎后的)和OMVs-ΔCdtB與STEC共孵育36 h，未處理的細胞作為陰性對照。結果顯示，與對照組相比，CdtB和OMVs組cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著增加，ZO-1和Occludin的表達水平降低；而OMVs-ΔCdtB組cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表達水平無差異(圖9B、9C)。以上所有研究結果表明，OMVs通過轉運CdtB誘導STEC發生p53依賴的細胞凋亡，并破壞STEC中的緊密連接，最終增加氣管上皮屏障的通透性。

A.蛋白免疫印跡分析OMVs、OMVs-ΔCdtB和IMC-CdtB中是否含有CdtA、CdtB和CdtC蛋白；B.蛋白免疫印跡分析cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表達水平；C.蛋白質條帶強度由ImageJ軟件量化A.OMVs, OMVs-ΔCdtB and IMC-CdtB were analyzed for the presence of CdtA, CdtB and CdtC proteins by Western blot; B.The protein expression levels of cleaved-caspase3, ZO-1 and occludin were analyzed by Western blot; C.Protein band intensities were quantified by ImageJ software圖9 OMVs通過轉運CdtB破壞STEC中的緊密連接Fig.9 OMVs cause TJ disruption in STEC by transporting CdtB

3 討 論

副豬格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis，GPS)是近年來嚴重危害養豬業發展的主要細菌性病原，可引起豬的格拉澤氏病[22]。作為一種呼吸道機會致病菌，副豬嗜血桿菌必須突破呼吸道上皮屏障進入血液才能誘發系統性感染。細菌穿透細胞屏障的3種方式包括直接穿透細胞、細胞旁途徑和“特洛伊木馬”形式。本實驗室前期研究發現，GPS菌株感染STEC，其侵襲能力較弱，并且可以下調TJ ZO-1、occludin和claudin-1的表達水平[23]。因此猜測，GPS菌株是通過細胞旁途徑破壞STEC中的緊密連接的。

有研究報道，GPS的CDT蛋白全毒素會導致豬腎上皮細胞(porcine kidney cells, PK-15)和豬肺泡巨噬細胞(pulmonary alveolar macrophage cells, PAMs)出現明顯的細胞膨脹和細胞凋亡，其中細胞G2阻滯和p53依賴性細胞凋亡主要是由CdtB引起的[24]，因此本研究從CdtA、CdtB和CdtC中選擇CdtB處理STEC，檢測細胞凋亡和屏障通透性之間的關系。本研究發現，副豬格拉瑟菌分泌的CDT蛋白在GPS培養物中以OMVs的形式存在，在細胞上清中未檢出游離的毒素，類似現象在腸致病性大腸桿菌EHEC O157中有相關報道，并且EHEC O157 OMVs通過將CdtB毒素依次轉運至腸上皮細胞的高爾基體、內質網，而后易位至細胞核，細胞DNA損傷，引起細胞周期停滯，最終通過Caspase9途徑誘導細胞凋亡[25]。

細胞凋亡主要由3種途徑引起：外源性或死亡受體途徑、內源性或線粒體途徑以及顆粒酶依賴性途徑[26]。研究報道，細菌分泌的OMVs均通過線粒體途徑引起宿主細胞凋亡。例如，淋病奈瑟氏菌、幽門螺桿菌、銅綠假單胞菌和尿道致病性大腸桿菌可通過分泌OMVs，通過線粒體途徑引起巨噬細胞發生凋亡[27-28]。本研究發現，GPS OMVs可通過將CdtB毒素轉運至STEC中引起細胞發生p53依賴的細胞凋亡。p53是一種腫瘤抑制基因，可通過上調Bax的表達水平，以及下調Bcl-2的表達共同完成促進細胞凋亡作用[14]。其中Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素c的釋放，促進細胞凋亡，而Bcl-2可阻止細胞色素c的釋放，具有抗凋亡作用。此外，p53還可通過死亡信號受體蛋白途徑誘導凋亡。但由于本研究發現CdtB引起的細胞凋亡是由OMVs轉運所引起的，故CdtB可引起線粒體依賴性的細胞凋亡。

氣管上皮細胞和細胞間連接結構是機體抵抗微生物入侵的重要物理屏障，其中緊密連接(TJs)對于構建上皮屏障和維持上皮極性至關重要[29]。例如豬鏈球菌2型(SS2)與豬圓環病毒2型(PCV2)混合感染STEC 48 h，TJ ZO-1蛋白表達水平顯著降低[30]；研究報道，牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)產生的OMVs可以降低人肺上皮細胞A549的細胞活力，同時誘導Caspase3活化和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的切割，引起細胞凋亡，進而破壞緊密連接蛋白claudin-1和occludin完整分布[31]。本研究發現OMVs及CdtB誘導細胞發生p53依賴的細胞凋亡，上皮細胞凋亡之后，跨上皮阻力顯著降低，構成上皮屏障的TJs ZO-1和occludin表達水平降低，最終導致通透性的增加和上皮屏障的破壞。

4 結 論

本研究建立了GPS5-SQ的體外感染模型，通過提取GPS OMVs，發現OMVs與STEC共孵育5 h后可被STEC膜融合內化至細胞核附近。另外，OMVs可以通過轉運CdtB誘導STEC發生p53依賴的細胞凋亡，并下調STEC中ZO-1、occludin的表達水平，最終增加氣管上皮屏障的通透性。研究結果有助于進一步闡明副豬格拉瑟菌的致病機制，可為相關疫苗的研發及新型藥物靶標的發掘提供理論依據，并對研究同類呼吸道病原菌突破氣管上皮屏障的機制提供參考價值。