紫錐菊提取物對大鼠濕熱泄瀉的療效及其機制

池幸子，楊詩靖，楊泊文，孫 晗，姚麗麗，顧達星，郭世寧,2，石達友,2，武 力,2，劉 翠,2*

(1.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642； 2.廣東省獸用中藥與天然藥物工程技術研究中心，廣州 510642)

隨著現代養殖集約化、規模化及畜禽流動性的增加，內外濕熱侵襲畜禽機體導致脾胃、腸道功能紊亂的濕熱泄瀉相關疾病時有發生，給養殖業帶來巨大損失。濕熱泄瀉主要有“濕熱氣盛，是以溫厲大行”的病理特點，濕熱壅滯，損傷脾胃傳化失常，導致腸道傳導功能紊亂，臨床表現為腹痛、腹瀉、肛門灼熱、里急后重、苔黃膩，大便黏膩、色黃且臭[1]。臨床實踐表明，采用化學藥物控制炎癥反應以治療畜禽濕熱泄瀉，其療效不佳，且藥物不合理使用易致耐藥性及藥物殘留，對人類健康構成潛在威脅[2]。

濕熱泄瀉的發展與飲食、環境、生物因素等密切相關，目前，濕熱泄瀉證常以“內濕+外濕+客邪”為原則建模，即喂養高脂高糖飼料以制造內濕，置于高溫高濕環境以制造外濕，給予病原體以制造客邪[3]。本研究根據參考文獻[4]，在高溫高濕環境下給予大鼠高糖高脂飲食后，腹腔注射大腸桿菌菌液建立大鼠濕熱泄瀉模型,通過對其臨床體征、體重、采食、飲水量的監測進行模型評價，其中，臨床體征主要為精神狀態、糞便含水量與色澤等宏觀證候指標的監測[5]。

紫錐菊(Echinaceapurpurea)屬菊科紫錐花屬植物，也稱“松果菊”，味辛、苦，性涼，歸肺、脾經，有清熱解毒，益氣扶正的功效[6]。紫錐菊含有菊苣酸、咖啡酸、多糖等多種活性物質，在抗感染和提高免疫力方面有顯著作用[7]。此前已有研究發現，紫錐菊在結腸炎模型的治療中具有抗炎作用[8]，本研究通過建立大鼠濕熱泄瀉模型，探討紫錐菊提取物對濕熱泄瀉大鼠的療效，為紫錐菊提取物防治濕熱泄瀉疾病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

豬油購自頓蒿特食品有限公司；營養瓊脂購自青島高科園海博生物技術有限公司；大鼠 IL-6、IL-10、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒購自江蘇酶免生物科技有限公司；大鼠TGF-β、IL-2 ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；葡萄糖、甲醛、氯仿、無水乙醇購于天津市大茂化學試劑廠；異丙醇購于天津市富宇精細化工有限公司；RNALaterTM動物組織RNA穩定保存液購于上海碧云天生物科技有限公司。RNaze-free ddH2O、RNA isolater Total RNA Extraction Reagent、Hiscript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

全自動生化分析儀(BS-320，WS-49002086)、離心機(湖南湘儀，L420)、酶標儀(Thermo，357-701660)、恒溫水浴鍋(常州澳華)、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進)、臺式高速冷凍離心機(艾本德，5425R)、PCR儀(美國伯樂，BIOT100)。

1.2 藥物與菌種

紫錐菊提取物(EPE)，由華南農業大學獸醫學院中獸醫實驗室與廣州華農高科生物科技有限公司研制，廣州華農高科生物科技有限公司中試生產，批號：20191201，含單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的總量≥2.0%，100 g·袋-1。

產腸毒素性大腸桿菌(O78)購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 模型建立及其判斷標準

廣州南方醫科大學實驗動物管理中心購進40只SPF級Wistar大鼠，體重180～220 g，雌雄各半，動物生產許可證號：SYXK(粵)2019-0136。40只Wistar大鼠隨機均分為5組：空白組、模型組、EPE低劑量組、EPE高劑量組及陽性藥物組，雌雄各半。除空白組外，其余各組大鼠單日灌胃豬油(20 mL·kg-1)，并給予充足飼料，雙日禁食，且自由飲用30%的葡萄糖水，并放置于高溫高濕環境中，維持室內溫度33 ℃±2 ℃，濕度90%±5%，每日持續8 h，共10 d。10 d后，除空白組外，其余各組大鼠腹腔注射2 mL·kg-1劑量產毒性大腸桿菌菌液(1.8×109CFU·mL-1)，間隔24 h后，再次注射1 mL·kg-1劑量大腸桿菌菌液，自然適應1 d，空白組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模后，EPE低、高劑量組每日分別灌胃1與3 g·kg-1EPE，陽性藥物組每日灌胃0.1 g·kg-1柳氮磺吡啶，空白組與模型組大鼠給予等量生理鹽水，持續6 d(圖1)。

實施特深井(13 000 m以深)科學鉆探工程之前，建立結晶巖鉆探施工必要的理論基礎和構建初步的技術體系是非常必要的，只有在具備較完備的理論基礎和完善的施工技術體系的前提下，才能安全、高效地完成特深井科學鉆探任務。

圖1 模型建立與藥物治療Fig.1 Model establishment and drug therapy

根據臨床癥狀評分評價各組大鼠濕熱泄瀉臨床癥狀變化程度，評分標準參考王濤[4]方法，見表1。根據表1中糞便形狀評分標準評價大鼠腹瀉程度。

表1 大鼠臨床癥狀評分標準Table 1 Scoring standard of clinical symptoms in rats

1.4 觀察大鼠臨床體征變化

觀察各組大鼠臨床體征，記錄體重、飲水量與采食量。

1.5 大鼠血常規指標檢測

各組大鼠進行腹主動脈采血，采抗凝血液約1 mL。進行血常規指標測定，主要檢測白細胞數目(white blood cell count, WBC)、中性粒細胞數目(neutrophil count, NEU)、單核細胞數目(monocytes count, MON)、淋巴細胞數目(lymphocyte count, LYM)、紅細胞壓積(hematocrit, HCT)、紅細胞數目(red blood cell count, RBC)、血紅蛋白濃度(hemoglobin, HGB)和血小板數目(platelet count, PLT)。

1.6 大鼠主要血清生化指標檢測

各組大鼠進行腹主動脈采全血4 mL，靜置2～3 h，室溫下3 500 r·min-1離心10 min，取上清備用。使用全自動生化分析儀，檢測血清中總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、葡萄糖(glucose，GLU)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、肌酐(creatinine，CREA)和尿素(urea，UREA)。

1.7 大鼠主要血清因子含量檢測

ELISA法檢測各組大鼠血清中TGF-β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23含量。

1.8 大鼠主要臟器指數測定

剖取大鼠心、肝、脾、肺、腎、胸腺以及盲腸至肛門段腸道，剝除臟器表面被膜及脂肪后，稱量各臟器質量，并計算大鼠臟器指數：

臟器指數=臟器質量/大鼠體質量(mg·g-1)

1.9 大鼠主要臟器的病理組織學觀察

取各組大鼠心、肝、脾、肺、腎、胸腺置于10%中性甲醛溶液中固定后，雙蒸水沖洗干凈，然后乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片并HE染色，顯微鏡下進行各組大鼠主要臟器的病理組織學觀察。

1.10 大鼠結腸TGF-β1、Foxp3、RORγt mRNA表達水平測定

取各組大鼠結腸組織，采用實時熒光定量PCR擴增法檢測大鼠結腸組織中轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid acid-related orphan receptor gammat，RORγt)、叉頭框蛋白P3(forkhead box protein P3，Foxp3) mRNA相對表達量。

1.11 數據處理與分析

2 結 果

2.1 大鼠臨床體征變化

試驗期間空白組大鼠被毛光潔，精神狀態良好，活潑好動，采食飲水，以及糞便、尿液、肛門情況均正常。與空白對照組相比，模型組大鼠精神沉郁，被毛粗糙泛黃(圖2A)，蜷縮懶動，食欲明顯下降，糞便稀薄黏膩、色黃而臭(圖2B)，符合濕熱泄瀉證候的整體特征。采用紫錐菊提取物和柳氮磺吡啶治療6 d后，與模型組相比，各治療組的癥狀明顯減輕，被毛恢復光澤(圖2D)，飲食與活動增加，糞便逐漸成形且顏色加深，肛門狀態良好(圖2 C)，個別大鼠的糞便仍黏軟呈黃褐色，提示紫錐菊提取物對濕熱泄瀉證具有緩解效果。

A、B. 治療前濕熱泄瀉大鼠糞便情況與被毛狀態；C、D.紫錐菊提取物低劑量組治療后大鼠的肛門與精神狀態。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖A, B. Hair state and the feces of rats with dampness-heat diarrhea before treatment; C, D. The anal and mental state of rats in the low-dose group of Echinacea purpurea extract after treatment. The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖2 治療前后濕熱泄瀉大鼠臨床癥狀Fig.2 Clinical symptoms of rats with Intestine amp-heat syndrome before and after treatment

第12天造模結束時，與空白組相比，模型組大鼠臨床癥狀評分顯著升高(P<0.05)，腹瀉程度評分顯著升高(P<0.05)。第13～18天評分持續降低且顯著高于空白組(P<0.05)。與模型組相比，各治療組臨床癥狀評分在第13～17天無顯著差異(P>0.05)，第18天時紫錐菊提取物低劑量組大鼠臨床癥狀評分與腹瀉程度評分顯著降低(P<0.05)(圖3A、B)。

A.臨床癥狀評分；B.腹瀉程度評分；C.體重；D.飲水量；E.采食量。*.與空白組相比，模型組P<0.05， #. 與模型組相比，治療組P<0.05。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖A. Clinical symptom scores; B. Diarrhea scores; C. Body weight; D. Water consumption; E. Feed intake. * indicates that compared with the blank group, the model group P<0.05, # indicates that compared with the model group, the treatment group P<0.05. The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖3 各組大鼠臨床體征變化情況Fig.3 Changes of clinical signs of rats in each group

第12天造模結束時，與空白組相比，模型組大鼠體重顯著降低(P<0.05)。第13～18 d治療過程中模型組與各治療組體重逐漸升高，第18天時紫錐菊提取物高劑量組與陽性藥物組的大鼠體重高于模型組，但無顯著差異(P>0.05)(圖3C)。

第12 天造模結束時，與空白組相比，模型組大鼠飲水量升高但差異不顯著(P>0.05)，第13～18天模型組與各治療組大鼠飲水量逐步恢復至正常水平(圖3D)。

第12天造模結束時，與空白組相比，模型組大鼠采食量顯著降低(P<0.05)。第13～18天模型組與各治療組大鼠采食量逐步恢復至正常水平(圖3E)。

2.2 大鼠血常規指標變化

與空白組相比，模型組大鼠血液中RBC、HGB、HCT含量均顯著降低(P<0.05)，WBC、NEU有增加的趨勢但差異不顯著(P>0.05)。與模型組相比，經紫錐菊提取物及陽性藥物治療后，各治療組大鼠血液RBC、HGB、HCT含量均有升高趨勢，其中，紫錐菊提取物高劑量組的HCT顯著增加(P<0.05)，紫錐菊提取物高、低劑量組與陽性藥物組大鼠血液WBC、NEU的含量均有降低的趨勢但差異不顯著(P>0.05)(表2)。

表2 血常規檢測結果Table 2 The results of blood routine test(n=8,

2.3 大鼠主要血清生化檢指標變化

與空白組相比，模型組大鼠血清UREA、ALT水平均顯著降低(P<0.05)，AST、TC、TG、TP、ALB水平降低，但差異不顯著(P>0.05)。與模型組相比，經紫錐菊提取物及陽性藥物治療后，紫錐菊提取物高、低劑量組與陽性藥物組大鼠UREA、ALT、AST、TC、TG、TP、ALB水平均有升高趨勢，其中，各治療組的TP顯著升高(P<0.05)，紫錐菊提取物高、低劑量組的UREA、TC、TP、ALB水平顯著升高(P<0.05)，陽性藥物組AST水平升高且差異顯著(P<0.05)(表3)。

表3 血生化檢測結果Table 3 The results of blood biochemical test(n=8,

2.4 大鼠主要血清炎性因子水平變化

與空白組相比，模型組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23水平均顯著升高(P<0.05)，血清TGF-β、IL-2、IL-10水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，紫錐菊提取物高、低劑量組與陽性藥物組大鼠血清IL-17、IL-23水平均顯著降低(P<0.05)，紫錐菊提取物高、低劑量組大鼠血清TGF-β水平升高，且顯著高于模型組(P<0.05)，其中，紫錐菊提取物低劑量組IL-2、IL-10、IL-17、IL-23效果優于紫錐菊提取物高劑量組與陽性藥物組(圖4)。

C.空白組；M.模型組；L.紫錐菊提取物低劑量組；H.紫錐菊提取物高劑量組；S.陽性藥物組。圖中字母不同表示各組間差異顯著(P<0.05)C. Control group; M. Model group; L. Low-dose group of E. purpurea extract; H. High-dose group of E. purpurea extract; S. Positive medicine control group. The columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter mean no significant difference (P>0.05)圖4 大鼠血清炎性細胞因子水平的變化Fig.4 Changes of serum inflammatory cytokines in rats

2.5 大鼠主要臟器指數變化

與空白組相比，模型組大鼠心、脾與肺指數顯著升高(P<0.05)，胸腺指數升高但差異不顯著(P>0.05)。與模型組相比，紫錐菊提取物高、低劑量組與陽性藥物組大鼠心、脾、肺與胸腺指數均有降低的趨勢，其中，紫錐菊提取物高劑量組大鼠的心指數顯著降低(P<0.05)，紫錐菊提取物低劑量組的肺、脾指數顯著降低(P<0.05)，陽性藥物組的肺指數顯著降低(P<0.05)。各治療組大鼠胸腺指數降低但差異不顯著(P>0.05)(表4)。

表4 大鼠臟器指數的變化Table 4 Changes of organ index in rats(n=8,

2.6 大鼠主要臟器的病理組織學變化

大鼠心、肝、脾、肺、腎、胸腺病理組織學檢查結果如圖5所示，空白組心肌纖維形態正常，無明顯病理變化；肝細胞均為正常形態，肝索排列整齊；脾組織、細胞形態正常，紅髓、白髓界限清晰；肺的組織界限清晰，肺泡隔、肺泡腔、肺間質均顯示形態正常，無異常細胞浸潤；腎小球、腎小囊、腎小管均形態正常；胸腺組織結構正常，無明顯病理變化。

C.空白組；M.模型組；L.紫錐菊提取物低劑量組；H.紫錐菊提取物高劑量組；S.陽性藥物組。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖C. Control group; M. Model group; L. Low-dose group of E. purpurea extract; H. High-dose group of E. purpurea extract; S. Positive medicine control group. The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖5 大鼠心、肝、脾、肺、腎、胸腺病理組織切片圖(HE，200×)Fig.5 Pathological sections of heart, liver, spleen, lung, kidney and thymus in rats(HE，200×)

模型組可見心組織出現出血瘀血現象(圖5中箭頭)；肝組織結構正常，部分肝細胞出現水腫現象，細胞界限不清；脾出現紅細胞沉積，顯示脾陳舊性出血(圖5中箭頭)；腎小球上皮細胞變性壞死，可見炎性細胞增生浸潤(圖5中箭頭)；肺與胸腺無明顯病理變化。

紫錐菊提取物高、低劑量組可見心肌纖維結構正常，肝、腎組織形態正常；脾出血情況有所好轉，趨于正常。陽性藥物組部分肝細胞出現變性壞死，可見組織水腫；脾淋巴細胞稀疏，出現水腫現象；腎組織間出現大面積蛋白尿的沉積(圖5中箭頭)。

2.7 大鼠結腸TGF-β1、Foxp3、RORγt mRNA相對表達量

與空白組相比，模型組的TGF-β1與Foxp3 mRNA表達量顯著下降(P<0.05)，而RORγt mRNA表達顯著上升(P<0.05)。與模型組相比，紫錐菊提取物高、低劑量組的TGF-β1與Foxp3 mRNA表達顯著上升(P<0.05)，紫錐菊提取物高、低劑量組與陽性藥物組的RORγt mRNA表達顯著下降(P<0.05)(表5)。

表5 各組大鼠結腸TGF-β1、Foxp3和RORγt mRNA表達水平Table 5 Colon TGF-β1, Foxp3 and RORγt mRNA expression level in each group (n=6,

3 討 論

畜禽濕熱泄瀉通常表現為機體津液黏膩，舌色赤黃且苔厚，小便短少，并伴隨著劇烈泄瀉，腹部腸鳴如雷，糞便質如稀粥且混有黏液，糞便味臭等。濕熱泄瀉動物模型的建立結合了現代獸醫學的“病”與中獸醫學的“證”，本研究中濕熱泄瀉模型大鼠不僅出現腹瀉和黏液便等病理變化，同時還出現精神沉郁、舌苔黃厚、糞便黏膩等臨床證候整體特征[5]。紫錐菊具有清熱涼血、疏風散邪的功效，現代藥理學研究證明，紫錐菊有免疫調節、抗炎、抗真菌、抗病毒和抗氧化等作用，并有研究表明，紫錐菊醇提取物有降血壓、降血脂的作用[9-10]。本研究采用紫錐菊提取物治療濕熱泄瀉大鼠，結果表明，紫錐菊提取物具有緩解濕熱泄瀉大鼠臨床癥狀的效果，各治療組在試驗過程中其臨床癥狀評分隨時間出現明顯下降的趨勢，且治療結束時各治療組評分均低于模型組，其中，紫錐菊提取物低劑量組的評分顯著低于模型組，且效果優于高劑量紫錐菊提取物與陽性藥物。紫錐菊提取物高、低劑量組與陽性藥物組大鼠體重在治療過程中緩慢增長，接近正常水平，飲水量與采食量也處于正常范圍內。提示大鼠經紫錐菊提取物治療后，其濕熱泄瀉癥狀與體征得到明顯改善，機體逐步恢復正常，且低劑量的紫錐菊提取物有更好的治療效果。

脾是淋巴細胞接受抗原刺激和發生免疫應答的重要場所，也是T、B細胞發育的重要場所，脾和胸腺重量的異常可導致動物免疫功能的降低[11-12]。本研究中，經紫錐菊提取物治療后，濕熱泄瀉大鼠心、肺、脾、胸腺指數回調，且紫錐菊提取物低劑量組的肺、脾指數顯著低于空白組，說明紫錐菊提取物對濕熱泄瀉大鼠的免疫機能和心肺功能具有調節作用。

血常規指標檢測中，主要參與機體防衛功能的WBC具有免疫反應和吞噬作用，其中，NEU數目的異常提示可能發生急性感染或炎癥，RBC可以為機體輸送氧氣與二氧化碳，調節血液酸堿度，并起到免疫調節的作用[13-14]。有研究表明腹瀉會導致白細胞病理性的升高或降低，并出現血小板降低的現象[15]。本研究中紫錐菊提取物可以改善濕熱泄瀉大鼠顯著降低的RBC、HGB、HCT含量與降低的WBC、NEU含量，說明感染大腸桿菌的濕熱泄瀉模型大鼠機體引起炎癥反應。而紫錐菊提取物具有改善自身細胞的炎性損傷和緩解應激作用。

血液生化學的一些指標能夠對疾病的診斷起到輔助作用，其中，血清TP與ALB由肝合成，具有輸送各種代謝產物、維持機體膠體滲透壓等生理功能，從而對機體起到免疫調節作用[16]。ALT、AST、TG、TC等指標反映了肝功能情況，ALT是位于肝細胞胞質的胞質酶，而AST通常位于肝細胞線粒體中，當肝受損較輕時細胞膜通透性增加引起細胞質內ALT釋放，肝細胞受損嚴重時才釋放線粒體內AST[17]。UREA與CREA是反映腎功能的重要指標，當腎發生炎癥或腎功能不全時，UREA與CREA由于無法排出體外而累積過多[18]。本研究中，紫錐菊提取物能夠提高由于濕熱泄瀉造模過程造成的UREA、ALT、AST、TC、TG、TP、ALB水平的降低，說明造模過程中飲食過度肥甘厚膩損傷機體肝腎功能，引起血脂上升，而紫錐菊提取物能夠回調紊亂的血生化指標，具有一定的抗損傷保肝作用。

Th17分泌的IL-17可以調控下游細胞因子和趨化因子，與炎癥反應和自身免疫性疾病密切相關[19]。機體受到外源性抗原刺激時，樹突狀細胞以及巨噬細胞會被激活而產生IL-23[20]。TGF-β能上調Foxp3的表達，促進通過細胞接觸依賴機制Treg細胞的分化，發揮免疫調節功能[21-23]。經過紫錐菊提取物與陽性藥物的治療，各治療組血清IL-17、IL-23水平顯著降低，TGF-β水平顯著升高，說明紫錐菊提取物可抑制濕熱泄瀉大鼠分泌過多的炎性介質，減少炎性細胞因子的表達，使機體促炎與抑炎細胞因子逐步恢復平衡狀態[24-25]。促進Th17細胞增殖分化的RORγt通過抑制效應T細胞誘導機體炎癥，Foxp3通過誘導Treg細胞增殖分化調節機體的免疫系統，研究表明，Treg細胞能通過調控腸道T細胞的活化從而調節小鼠的腸道免疫反應[26-27]。本試驗中紫錐菊提取物可顯著上調濕熱泄瀉大鼠結腸TGF-β1、Foxp3 mRNA水平，降低RORγt mRNA水平，調節失衡的Th17/Treg，改善機體炎癥反應，從而發揮對濕熱泄瀉的治療效果[28-29]。

本研究中，濕熱之邪主犯胃腸道，但對其他臟腑也有一定損害，濕熱泄瀉模型大鼠的心、肝、脾、腎等臟器均有不同程度的病理學變化，心出現大面積瘀血，肝水腫，脾水腫，腎出現炎性細胞浸潤及蛋白尿的沉積。經紫錐菊提取物治療后，受損臟器的病理變化減輕或消失，基本恢復正常。提示紫錐菊提取物對濕熱泄瀉大鼠臟器水腫、炎性細胞浸潤及瘀血均有一定程度的緩解作用[30]。

4 結 論

紫錐菊提取物能夠通過降低血脂、調節血清炎性因子水平及改善臟器功能，以改善濕熱泄瀉大鼠的臨床癥狀，其中，低劑量的紫錐菊提取物在降低血清IL-17、IL-23水平與結腸TGF-β1 mRNA、RORγt mRNA表達方面對緩解大鼠濕熱泄瀉的效果更好。