新疆地區腹瀉仔豬源大腸桿菌的分群、血清型鑒定及耐藥性分析

佟盼盼，黃順敏，王芋丹，施旭輝，陳文霞，宋鑫龍，張 毅，蘇戰強，謝金鑫

(新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

腸道致病性大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)可引起仔豬黃痢、白痢和水腫病，統稱為仔豬大腸桿菌病，發病率和死亡率較高，給養豬業造成嚴重的經濟損失[1-2]。根據毒力基因的攜帶情況可將這些大腸桿菌劃分為不同致病型，如產腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicE.coli，ETEC)可產生熱不穩定腸毒素(heat-labile enterotoxin，LT)和熱穩定腸毒素(heat-stable enterotoxin，ST)，產志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producingE.coli，STEC)產生志賀毒素(Shiga toxin，Stx)，EPEC攜帶由eae基因編碼的緊密黏附素[3-4]。除編碼Stx的stx基因通常整合在染色體的原噬菌體中，大部分編碼毒力因子的基因位于質粒上，通過水平基因轉移可將毒力基因傳遞至特定的遺傳背景中形成混合型致病菌，如在動物和人上發現了一些STEC攜帶ETEC毒素，從而產生了STEC/ETEC[3,5]。

大腸桿菌系統進化分群復雜，血清型眾多，不同血清型之間無交叉保護性，且呈地域性，給疫苗研制帶來困難，也是仔豬大腸桿菌病流行的重要因素[2,6]。目前，治療仔豬大腸桿菌病主要以抗生素為主，隨著抗生素的使用，導致大腸桿菌的耐藥性十分嚴重，提高了細菌感染的治療難度，也威脅著人類健康[7]。相對于其他地區而言，關于新疆地區豬源大腸桿菌毒力特征及耐藥性的報道尚不多見。本研究收集新疆部分規模化豬場仔豬腹瀉糞便樣品，進行大腸桿菌分離鑒定、系統進化分群、血清型鑒定及耐藥性分析，以明確新疆腹瀉仔豬源大腸桿菌的流行特征及耐藥譜、耐藥基因攜帶情況，為新疆地區豬場合理用藥有效控制仔豬大腸桿菌感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2021年6—9月，從新疆2個規模化豬場采集7日齡內腹瀉仔豬糞便樣品154份，在24 h內4 ℃條件下送至新疆農業大學動物醫學學院臨床實驗室。

1.2 主要試劑

麥康凱、MH瓊脂、MH肉湯購自青島海博生物技術有限公司，科瑪嘉大腸桿菌顯色培養基購自CHRO Magar公司；藥敏紙片購自Thermo Fisher公司；2×TaqMix購自天根生化科技有限公司，DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；Gelred核酸染料購自Biotium公司。

1.3 引物合成

大腸桿菌16S rDNA特異性鑒定引物[8]、腸道致病性大腸桿菌毒力基因LT、ST、stx1、stx2和eae引物[8-11]、大腸桿菌系統發育分群基因arpA、chuA、yjaA、TspE4.C2、ArpAgpE和trpAgpC引物[12]、O血清型鑒定引物[13]及主要耐藥基因blaCTX-M-1G、blaCTX-M-2G、blaCTX-M-9G、blaTEM、blaSHV、tetA、tetG、tetE、aac、aadA1、sul1和cml1引物[14-21]由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.4 細菌的分離與鑒定

將3 mL生理鹽水加入每份糞便拭子收集管后，室溫震蕩混勻，劃線接種麥康凱平板，37 ℃培養14～16 h，挑取紅色單菌落劃線接種科瑪嘉平板，37 ℃培養16～18 h后進行大腸桿菌16S rDNA特異性PCR鑒定。將陽性菌液置于含20%甘油的生理鹽水中，于-80 ℃保存備用。

1.5 腸道致病性大腸桿菌的毒力基因檢測

采用煮沸裂解法制備菌株DNA模板。PCR方法檢測毒力基因LT、ST、stx1、stx2和eae。根據毒力基因的攜帶情況判定腸道致病性大腸桿菌的類型，即攜帶ST和/或LT，可判定為ETEC；攜帶stx1和/或stx2，可判定為STEC；攜帶eae則判定為EPEC[3-4]。

1.6 大腸桿菌的系統進化分群

參照文獻[12]方法，首先通過四重PCR擴增arpA、chuA、yjaA和TspE4.C2，根據結果可劃分為A(或C)、D(或E)、B1、C、F、B2和E群。若四重PCR不能區分A和C或D和E群時，再次PCR擴增trpAgpC或ArpAgpE以進一步確定C或E群。

1.7 O型血清型鑒定

參照文獻[13],采用多重PCR篩選O血清型，用162對引物建立20個多重PCR組(6～9對引物/組)，擴增條帶大小明顯不同。

1.8 藥敏試驗

參照美國臨床實驗室標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準[22]，以大腸桿菌ATCC 25922為質控菌株，采用K-B紙片法對大腸桿菌進行藥物敏感性檢測并結果判定[22]。將對三類或三類以上抗生素(非同一類的3種)同時耐藥判定為多重耐藥(multiple drug resistance，MDR)[23]。

2 結 果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定及腸道致病性大腸桿菌的檢出情況

從154份腹瀉仔豬糞便中共分離到154株大腸桿菌。結合毒力基因的檢測結果，檢出的腸道致病性大腸桿菌包括ETEC(n=24)、STEC(n=21)、EPEC(n=1)、EPEC/STEC(n=2)、ETEC/STEC(n=1)和ETEC/EPEC(n=1)，104株未攜帶任何被檢毒力基因。

2.2 大腸桿菌的系統進化分群

系統進化分群顯示，154株分離株多數屬于B1(37%)和A群(31%)，少數屬于C(14%)、F(6%)、E(5%)和D(3%)群，6株未分群。腸道致病性大腸桿菌主要分布于A、B1、C和E群。

2.3 大腸桿菌的O血清型檢測

在154株分離株中，定型菌株44株，分別屬于10種血清型，包括O8、O12、O21、O32、O81、O141、O153、O154、O166和O175，其中，O154、O12、O8、O141和O175為主要流行的血清型，占定型血清型的82%。在ETEC中檢測到O8、O21、O141、O153和O154，在STEC中檢測到O12、O81、O141、O154和O175(圖1)。

圖1 大腸桿菌中O血清型的分布Fig.1 Distribution of O serotypes in E. coli isolates

2.4 大腸桿菌的藥物敏感性檢測

抗生素藥敏檢測結果顯示，154株分離株對復方新諾明、四環素、氨芐西林、鏈霉素和氯霉素的耐藥率為81%～100%，對阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻肟、慶大霉素、頭孢曲松、環丙沙星和阿米卡星的耐藥率為31%～66%，對左氧氟沙星、多黏菌素B、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦和亞胺培南的耐藥率為1%～19%，其中，腸道致病性大腸桿菌對除亞胺培南之外的17種抗生素均有耐藥現象。98%為MDR菌株，以5耐(38%)和6耐(34%)為主(圖2)。

圖2 154株大腸桿菌的多重耐藥類型Fig.2 MDR types of the 154 E. coli isolates

2.5 大腸桿菌耐藥基因的檢測

154株分離株的耐藥基因檢測結果顯示，151株攜帶至少1種耐藥基因，其中，tetA(88%)、tetG(60%)和cmlA(45%)的攜帶率較高，而blaCTX-M-1G、aadA1、sul1、aac和blaCTX-M-9G均低于30%，未檢測出blaCTX-M-2G、blaTEM、blaSHV和tetE。除blaCTX-M-9G外，其他耐藥基因也分布于腸道致病性大腸桿菌中(圖3)。

圖3 154株大腸桿菌的物耐藥基因檢測結果Fig.3 Detection for resistance genes in 154 E. coli isolates

3 討 論

本研究發現新疆地區豬場感染大腸桿菌的類型復雜，包括ETEC、STEC和EPEC，其中，ETEC的檢出率低于蘇北地區[9]。在斯洛伐克ETEC和STEC也是引起仔豬腹瀉的常見病原[24]。雖然104株腹瀉仔豬源大腸桿菌未攜帶被檢毒力基因，但還不能判定其致病性，有待進一步研究。

大腸桿菌的致病力與分群有一定關系，B2和D群是主要的腸道外致病性大腸桿菌，A和B1群多為腸道共生大腸桿菌[25]。李金鵬等[26]發現，河南地區腹瀉豬源大腸桿菌多屬于B2和D群，彭珂楠等[27]報道四川地區豬源致病型大腸桿菌多屬于A和B1群，新疆地區多屬于B1和A群，與河南和四川地區有所差異[26-27]。

大腸桿菌的致病力也與血清型有關，如O8、O9、O15、O20、O25、O64、O78、O101、O107、O115、O128、O138、O139、O141、O147、O149和O157等[2,9]，血清型可能隨地域或時間而發生變化，且編碼抗原和毒素的基因可通過質粒而轉移，使致病血清型不斷變化[2]。本研究中優勢血清型為O154、O12、O8、O141和O175，表明新疆地區腹瀉仔豬源大腸桿菌的血清型呈多樣性。國內其他地區也報道過O8和O141[2,9]，而O154、O12和O175相對少見，表明這些血清型可能僅在新疆比較流行。

本研究發現新疆地區腹瀉仔豬源大腸桿菌以MDR為主，與孫慧琴等[28]的報道一致，表明新疆地區豬源大腸桿菌的耐藥形勢嚴峻。MDR針對的多為獸醫臨床上應用頻率高、時間久的藥物，如復方新諾明、四環素和氨芐西林等，而對亞胺培南、哌拉西林-他唑巴坦和氨芐西林-舒巴坦較敏感。新疆地區腹瀉仔豬源大腸桿菌，包括ETEC、STEC和ETEC/EPEC對治療MDR革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”——多黏菌素的耐藥率為18%，高于河南地區(13%)[29]，表明致病性大腸桿菌對其適應速度快，提示獸醫臨床需謹慎把握用藥頻率。

細菌攜帶的耐藥基因與耐藥表型密切相關。新疆地區腹瀉仔豬源大腸桿菌攜帶多種耐藥基因，如tetA、tetG和cmlA等，通常位于可移動的質粒上[30]，多種耐藥基因的檢出率低于與之對應的耐藥表型檢出率，可能存在其他耐藥機制，如由染色體介導的耐藥機制[31]，有待進一步研究。

4 結 論

新疆地區腹瀉仔豬源大腸桿菌類型復雜、耐藥譜廣、耐藥基因豐富，定期對局部地區開展致病性大腸桿菌的檢測和耐藥性監測，可為疫病防控提供理論依據。