棉鈴蟲性信息素生物合成研究進展

李 祥, 盧雯慧, 魏紀珍, 安世恒

(河南農業大學植物保護學院, 小麥玉米作物學國家重點實驗室, 河南省害蟲綠色防控國際聯合實驗室, 鄭州 450002)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,是一種世界性農業害蟲。該蟲適應能力強且寄主廣泛,當外部環境適宜時常大面積暴發成災[1-2]。棉鈴蟲曾是我國和世界棉花種植產業的重要威脅[3],后來隨著轉基因抗蟲棉的大面積推廣,在一定程度上抵御了棉鈴蟲的為害[4];但是除棉花外,棉鈴蟲還為害玉米、高粱、小麥等糧食作物,以及辣椒、番茄、菜豆等蔬菜,其寄主植物多達30多科200余種作物[5-6]。我國幅員遼闊、地形復雜,農作物種植面積廣、種類多、分布雜,農民對害蟲的防治水平參差不齊,這都為棉鈴蟲的持續為害提供了便利。

化學殺蟲劑是當前防治棉鈴蟲的重要手段,但長期、大量、不合理地使用化學農藥已經造成了嚴重的生態污染和人畜安全問題。在過去的十多年間,全國農業技術推廣服務中心連續對華北棉區的棉鈴蟲進行了抗性監測,發現該蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性已達到高抗水平(抗性倍數為113～342倍),對有機磷類(如辛硫磷)、雙酰胺類(如氯蟲苯甲酰胺)和大環內酯類藥劑(如甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽)的抗性處于中等水平,并且這些抗性水平還在不斷上升[7-11]。與化學殺蟲劑相比,Bt殺蟲蛋白具有靶向性強、不殺傷天敵、對環境友好等優點,轉Bt基因棉花累計種植面積已超過10億hm2[4]。但是在2008年時,美洲棉鈴蟲Helicoverpazea對表達Cry1Ac殺蟲蛋白的棉花產生了抗性,這成為首個Bt作物防治失敗的案例[12]。此后,轉Bt基因棉田間防治失敗的案例不斷增加[13-14],甚至在不同蛋白之間出現了交互抗性[15]。近年來,棉鈴蟲對Cry1Ac的抗性也顯著提高[16-17]。鑒于棉鈴蟲對化學農藥和轉Bt基因作物的抗性問題日益嚴重,迫切需要新的治理手段和更為安全有效的綜合防治策略。

大多數昆蟲繁衍后代進行物種延續時是通過兩性交配來完成的,這需要同一物種兩性個體的成功相聚。性信息素(sex pheromone)是昆蟲兩性通訊的化學信號,在物種繁衍中擔當著重要的角色。昆蟲性信息素又稱性外激素,是由特殊腺體所分泌的一類微量化學物質,對同種異性個體具有遠距離引誘和促進交配的作用[18]。鱗翅目蛾類通常依賴雌蛾釋放的性信息素作為遠距離信息交流的化學信號,這種信號是雄蛾成功搜尋到配偶的關鍵因子。在求偶期,雌蛾通過延伸產卵器末端來暴露其性信息素腺體(pheromone gland,PG),并釋放性信息素;雄蛾能夠感知這些化學物質并做出定向反應來完成交配。以性信息素為基礎的害蟲誘殺和交配干擾等防治手段具有靈敏度高、選擇性強、對天敵安全、不污染環境等優點,在害蟲綜合治理和綠色防控體系應用中深受青睞。本研究概述了棉鈴蟲性信息素的組成和功能,生物合成時的信號轉導途徑和調控機制,以及性信息素前體的生成和特異性組分的碳鏈修飾過程,并總結了當前研究的不足,旨在為今后的基礎研究和生產應用提供指導。

1 棉鈴蟲性信息素組分的鑒定和功能

對昆蟲性信息素的成分鑒定始于20世紀50年代,Butenandt等從50萬頭家蠶Bombyxmori雌蛾中分離并鑒定出了第一個昆蟲性信息素——反8,順10-十六碳二烯-1-醇(trans-8,cis-10-hexadecadien-1-ol,E8,Z10-16∶OH)[19],由此開始了研究昆蟲性信息素化學結構的時代。鱗翅目昆蟲是農業上為害較重的一類害蟲,這類昆蟲視覺很差,但擁有發達的嗅覺交流機制,是昆蟲性信息素研究的主要對象。目前已有超過700種蛾類的性信息素組分被鑒定出來(https:∥lepipheromone.sakura.ne.jp/pdb_top.html;http:∥www.pherobase.com/)。其中,大約75%的蛾類性信息素是長度在10～18C的直鏈脂肪族化合物,具有0～3個不飽和鍵,末端具有羥基、醛基或乙?；裙倌軋F,稱為醇類、醛類或酯類性信息素;具有這樣特征的蛾類性信息素也被定義為I型性信息素[20]。

以棉鈴蟲為代表的醛類性信息素的生物合成和調控過程,是目前研究較早也較為透徹的一類性信息素。1977年,首個被鑒定出的棉鈴蟲性信息素組分為順-11-十六碳烯醛(cis-11-hexadecenal,Z11-16∶Ald),是從雌蛾第八到第九腹節的節間膜處提取到的[21]。隨后通過固相微萃取和溶劑浸提的方法先后從PG中鑒定出了其他9種組分,包括順-11-十六碳烯醇(cis-11-hexadecenol,Z11-16∶OH)、順-9-十六碳烯醛(cis-9-hexadecenal,Z9-16∶Ald)、順-7-十六碳烯醛(cis-7-hexadecenal,Z7-16∶Ald)、十六醛(hexadecanal,16∶Ald)、十六醇(hexadecanol,16∶OH)、順-9-十四碳烯醛(cis-9-tetradecenal,Z9-14∶Ald)、十四醛(tetradecanal,14∶Ald)、壬醛(nonanal,9∶Ald)和庚醛(heptanal,7∶Ald)[22-26]。

這10種化合物的含量在棉鈴蟲不同地理種群之間略有差異。其中,Z11-16∶Ald的含量顯著高于其他組分,占性信息素總混合物的90%左右。大量室內和田間試驗也證明了該物質是棉鈴蟲雌蛾吸引異性的關鍵物質[21-24, 27-28]。實際上單一的Z11-16∶Ald對雄蛾的吸引力并不高,加入1%～10%的Z9-16∶Ald后能大大提高引誘效果[24, 29]。這兩種物質的混合被認為是棉鈴蟲性信息素的主要組分。通常,Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald的比例為97∶3時,引誘效果最佳[28]。有學者認為,其他幾種組分可能是性信息素生物合成過程中的中間產物或副產物。但后來的研究發現,9∶Ald、Z9-14∶Ald、Z7-16∶Ald、Z11-16∶OH等物質不僅能夠引起雄蛾觸角強烈的電生理反應,將這些組分添加到棉鈴蟲性信息素主成分后,其引誘效果也發生了不同情況的變化[23-24, 30]。例如,在Z11-16∶Ald與Z9-16∶Ald(97∶3)的混合物中加入適量(0.3%)的Z9-14∶Ald能大幅提升混合物對雄蛾的引誘能力[24];但添加較高含量的Z9-14∶Ald或Z11-16∶OH則會顯著抑制誘蛾效果[23, 28]。進一步研究發現,Z11-16∶OH主要在雌蛾羽化初期時大量釋放,以阻止雄蛾與尚未性成熟的雌蛾交配[30-31]。Z7-16∶Ald不能提高雌蛾對雄蛾的遠距離引誘效果,但在兩性成蟲近距離接觸時,Z7-16∶Ald的存在能促進種群交配率的提高[23]。其他化合物的具體生物學意義,還有待進一步的研究和發掘。

2 棉鈴蟲性信息素生物合成的信號轉導

棉鈴蟲雌蛾通常在羽化后2～3 d的暗期4.5 h左右性信息素釋放達到最高水平,求偶和交配高峰則發生在性信息素大量釋放后的2～3 h[32]。昆蟲交配需要在特定的發育階段和光周期條件下進行,因此,性信息素的生物合成過程也需要被精準地調控。直接激發并控制棉鈴蟲性信息素生物合成的因子是性信息素合成激活肽(pheromone biosynthesis-activating neuropeptide,PBAN),這是一種由33個氨基酸組成的神經激素,在蛾類昆蟲的進化中高度保守[33-34]。大多數蛾類性信息素的合成和釋放都受PBAN調控,這種調控作用會受到內部神經系統以及外部環境因子(如光照、晝夜節律、溫度等)的共同影響。通常溫度越低、光周期越短時棉鈴蟲性信息素組分的合成量就越高[35];如果用異常光周期或不同光質處理雌蛾,會導致性信息素釋放量下降，求偶節律混亂等情況[36]。

在特定光暗周期為主的外部環境刺激下,PBAN由昆蟲咽下神經節(subesophageal ganglion,SOG)中的部分神經細胞合成和分泌,再經由血淋巴輸送到PG細胞。血淋巴中的PBAN與PG細胞膜上的G蛋白偶聯受體(PBANR)結合,利用Ca2+和cAMP作為第二信使來完成性信息素生物合成的信號轉導[37-43]。一方面,PBAN與PBANR結合后,激活細胞膜上的鈣離子通道,促使細胞外的Ca2+向內流動。伴隨著細胞內Ca2+濃度的升高,鈣調蛋白(calmodulin,CaM)被激活并與鈣調磷酸酶(calcineurin,CaN)相結合。CaN通過去磷酸化絲氨酸84和絲氨酸92位點來活化性信息素生物合成的限速酶——乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase,ACC),該酶催化乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A,acetyl CoA)生成丙二酰輔酶A(malonyl coenzyme A,malonyl CoA),并在脂肪酸合成酶(fatty acid synthases)的作用下生成長鏈脂肪酸,即性信息素特異性組分的前體物質[42, 44-45]。PBAN/PBANR/Ca2+/CaN信號通路在蛾類I型性信息素的生物合成中十分保守,在所有已檢測的蛾類昆蟲中均起著主導作用[37-43, 46-49]。另一方面,在以棉鈴蟲為代表的醛類性信息素合成時,PBAN能同時刺激腺苷酸環化酶(adenylate cyclase,AC)的活性,促進環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的水平升高。cAMP作為第二信使激活下游的蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),從而降低AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的活性。AMPK是ACC的負調節因子,其活性被抑制能保證CaN對ACC的去磷酸化激活活性,最終使性信息素生物合成得以順利進行[42]。

在上述模型中,PBAN同時利用Ca2+和cAMP為作為第二信使;PBAN/PBANR/Ca2+/CaN信號通路與PBAN/PBANR/cAMP/PKA信號通路的共同作用保證了棉鈴蟲醛類性信息素的順利合成。以家蠶為代表的醇類性信息素的生物合成僅依賴PBAN/PBANR/Ca2+/CaN一條信號轉導途徑,與棉鈴蟲明顯不同[34, 50-51]。酯類性信息素的生物合成研究較少,目前僅報道了亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis性信息素的PBAN信號轉導機制,當主要成分順-12-十六碳烯酯被合成時,PBAN僅招募Ca2+為第二信使,cAMP的胞內水平未見明顯變化[49]。

3 棉鈴蟲性信息素特異性組分的合成

蛾類依賴其性信息素在結構方面的多樣性(如鏈長、含氧官能團類型、雙鍵的數量和位置等)以及各組分的精確釋放比例來促進種內兩性通訊,并維持種間生殖隔離[20]。蛾類性信息素往往由兩種或兩種以上的化學物質組成,其中一種化學物質含量較高,為主要成分,如家蠶性信息素主要由E8,Z10-16∶OH和反10,順12-十六碳二烯醛(trans-10,cis-12-hexadecadienal,E10,Z12-16∶Ald)兩種組分構成,其中E8，Z10-16∶OH的含量高達92%[52]。有趣的是,煙芽夜蛾Heliothisvirescens、棉鈴蟲、煙青蟲Helicoverpaassulta和H.subflexa等多種夜蛾科昆蟲都是利用特定混合比例的Z9-16∶Ald和Z11-16∶Ald作為自身的性信息素成分;甚至在人工干預下,棉鈴蟲和煙青蟲可以雜交并產生不育后代[53]。因此可以認為,性信息素各組分之間的合成滴度與釋放比例控制是昆蟲準確識別同種異性并維持種間隔離的關鍵。

3.1 棉鈴蟲性信息素特異性組分的合成

大多數雌蛾釋放的性信息素組分是末端具有不同官能團的不飽和脂肪鏈,前體物質經過去飽和、碳鏈縮短、官能團生成等碳鏈修飾反應,最終生成具有生物活性的信息化合物[54]。去飽和酶(desaturase,△)、脂肪?；€原酶(fatty acyl-CoA reductase,FAR)、醇氧化酶(alcohol oxidase),以及β-氧化途徑相關酶(β-oxidation related-enzyme)被認為是參與前體脂肪鏈合成后步驟的主要功能酶系,負責特異性性信息素組分的生成[42, 55]。當前對特異性組分合成調控的研究主要集中在對去飽和酶和FAR的功能鑒定上。其中,去飽和酶主要負責性信息素前體中雙鍵或三鍵的形成;通過在脂肪鏈中的特定位置引入氧原子,后經脫氫反應生成H2O,形成順式或反式的不飽和結構[56]。FAR主要負責將性信息素的脂肪鏈前體末端的脂酰輔酶A催化生成相應的醇類,后經氧化作用或乙酰化反應生成相應的醛類或酯類化合物[57]。

在棉鈴蟲中,經過PBAN的激活作用和級聯反應生成了性信息素前體,即十六碳?；o酶A(16∶CoA)和少量十八碳?；o酶A(18∶CoA)。研究發現,棉鈴蟲PG細胞的轉錄組中同時包含△11和△9這兩類去飽和酶基因,且△11基因的表達水平顯著高于△9,這與棉鈴蟲性信息素混合物中Z11-16∶Ald與Z9-16∶Ald的比例接近。有學者因此推測△11主要通過作用在16∶CoA而形成Z11-16∶CoA(Z11-16∶Ald的合成前體),而△9則利用16∶CoA為前體生成Z9-16∶CoA(Z9-16∶Ald的合成前體)[58-60]。這一推測在煙青蟲的研究中得到了驗證,但是棉鈴蟲中的情況似乎并不支持這一推論。甚至有學者指出,在棉鈴蟲PG中未發現△9的表達(這可能是受當時的測序條件限制,△9的表達豐度過低而未能檢測到)。關于棉鈴蟲性信息素主要組分Z11-16∶Ald的形成,學者們的意見比較一致,都認為是16∶CoA在△11的氧化作用下,首先形成不飽和的Z11-16∶CoA,再在FAR的催化作用下生成Z11-16∶OH,后經醇氧化酶的作用最終生成Z11-16∶Ald[54, 58-62]。在合成次要組分Z9-16∶Ald時,比較認可的途徑是18∶CoA作為前體物質經過△11的氧化作用先生成Z11-18∶CoA,再經過β-脂肪氧化途徑去除兩個碳原子后形成Z9-16∶CoA。Z9-16∶CoA再經過酰基還原作用和醇氧化作用生成少量的Z9-16∶Ald。美洲棉鈴蟲與棉鈴蟲具有相似的性信息素組成,這一推論也在對美洲棉鈴蟲的研究中得到了驗證[59, 62-63](圖1)。

圖1 棉鈴蟲性信息素生物合成模式圖

3.2 棉鈴蟲性信息素特異性組分的比例控制

性信息素特異性組分的合成及滴度控制主要依賴脂肪鏈前體合成后的碳鏈修飾過程,其中,FAR和去飽和酶基因的適量表達可能是維持性信息素各組分適宜釋放比例的重要因素。對不同亞型的歐洲玉米螟Ostrinianubilalis性信息素生物合成進行研究時發現,長鏈脂肪酸前體的總量對各組分最終合成滴度的影響很小,而FAR是調節性信息素各組分釋放比例的關鍵因子[64]。也有學者提出,棉鈴蟲中特異性的去飽和酶可能是產生不同性信息素組分的關鍵因素[58-59]。但如前文所述,棉鈴蟲兩種主要組分的生物合成均依賴于△11,這與該結論似乎矛盾。Hagstr?m等構建酵母表達體系對以煙芽夜蛾為主的4種蛾類(包括棉鈴蟲)的性信息素合成進行了研究,指出FAR(而非去飽和酶)對底物的半選擇性(semi-selective)是維持各組分特定合成比例的一個重要因素[63]。結合特異性組分的合成機制,推測FAR的底物偏好性可能是控制棉鈴蟲Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald合成比例的關鍵因素,但具體的調控機制還有待進一步的明確。

4 棉鈴蟲性信息素生物合成的終止調控

由PBAN介導的棉鈴蟲等蛾類昆蟲的性信息素生物合成的激活機制已經被較好地闡明,但關于性信息素合成的終止調控研究非常有限。性肽(sex peptide)是一種產生于雄性附腺的小分子肽,能通過交配傳遞給雌性昆蟲,用于抑制其性信息素的合成和釋放[65-67]。將純化后的黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的性肽注射到雌蟲體內,可以降低雌蟲對雄蟲的敏感性,使雌蟲拒絕交配,并刺激其產卵。研究還發現,性肽能夠同時刺激保幼激素(juvenile hormone,JH)含量升高[65-66]。有趣的是,性肽能夠跨物種發揮作用,將純化后的果蠅性肽注射到棉鈴蟲體內,發現了與果蠅相似的抑制作用,以及JH滴度的顯著上升[68]。

JH可能是抑制性信息素生物合成的另一個關鍵因子。用JH處理新羽化的棉鈴蟲未交配雌蛾,PBANR的表達水平顯著降低,進而抑制了性信息素的合成和釋放。而交配所導致的棉鈴蟲雌蛾JH的水平上升,也關聯了其性信息素釋放量的減少[69-70]。這似乎都說明JH可能是降低性信息素生物合成的一個重要因素。但是也有研究發現,用JH處理羽化前1 d的雌蛹,能誘導PG提前響應PBAN信號,啟動性信息素的合成[70]。關于JH在蛾類性信息素的生物合成中的具體功能還存在爭議,還需要更深入的研究。

Yang等[71]最新的研究揭示了章魚胺(octopamine)終止棉鈴蟲性信息素生物合成的新機制。他們發現,棉鈴蟲性信息素釋放水平與體內章魚胺滴度呈負相關,用章魚胺處理后,雌蛾性信息素的合成被顯著抑制。進一步發現章魚胺利用OctβR為功能受體,通過抑制細胞內Ca2+水平的上升和下游CaN/ACC的活性來阻止PBAN信號的轉導,最終終止棉鈴蟲性信息素的生物合成[71](圖2)。

圖2 章魚胺終止棉鈴蟲性信息素生物合成的調控機制(仿Yang等[71])

5 總結與展望

鱗翅目是昆蟲綱的第二大目,包含20多萬個已知物種,其中90%為蛾類昆蟲。盡管不同種類的飛蛾在形態和生物學上存在差異,但是由于蛾類昆蟲幾乎不依賴視覺功能,大多數蛾類在兩性交配時以性信息素作為種內溝通的信號物質,這類具有種間特異性的化合物是保證種群有序繁衍的重要因子。了解性信息素的生物合成及調控機制,對于了解昆蟲化學通訊的奧秘、揭示害蟲暴發的機理以及指導田間應用等都具有重要的意義。

本文以棉鈴蟲為例,總結了蛾類昆蟲中醛類性信息素生物合成和調控的一般機制,這對于研究其他蛾類性信息素的生物合成機制具有借鑒和比較意義。盡管棉鈴蟲性信息素的研究相比其他昆蟲較為完善,但仍有許多盲點有待進一步闡明。這包括:1)從棉鈴蟲PG中鑒定出的多種次要組分的功能還有待進一步研究,尤其是這些化合物在兩性成蟲近距離接觸時是否具有行為調控功能,以及發揮了怎樣的作用,都還有待發掘和闡明;2)盡管不少研究已經揭示了去飽和酶和FAR能夠控制棉鈴蟲等蛾類性信息素各組分的種類和滴度,但調控機制尚不明確;3)性信息素釋放的終止調控是環境、行為、激素等多重因素的綜合作用,當前對終止機制的內在分子機理研究較少,關鍵基因的發掘和功能鑒定,以及磷酸化蛋白組學的調控機制等都不清楚;4)以棉鈴蟲為代表的醛類性信息素與酯類或醇類性信息素在生物合成和調控方面的異同點,也是今后研究的重點方向。此外,如何將當前和今后的理論研究成果融入到害蟲綠色防控和綜合治理體系,也是學者們需要考慮的問題,這提示我們今后應該更加注重以應用為導向的機理研究。