雙香豆素誘導斜紋夜蛾卵巢細胞程序性死亡的機理研究

秦子昕, 邵雪花, 梁 赫, 溫雪梅, 路 偉*

(1.新疆農業大學農學院,棉花教育部工程研究中心, 自治區農林有害生物監測與安全防控重點實驗室, 烏魯木齊 830052; 2.廣東省農業科學院果樹研究所, 農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室, 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室, 廣州 510640)

斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae[1]。其幼蟲可取食蔬菜、果樹、煙草、棉花及其他作物的葉、花蕾、花及果實等[2-3],對我國農業生產構成重大威脅。目前,斜紋夜蛾等鱗翅目害蟲的防控主要依靠化學農藥[4],但部分化學農藥毒性高、殘留嚴重,施藥后無法及時轉運至嫩梢葉片,使得施藥部位與害蟲為害部位存在位差,需要頻繁施藥防控。化學農藥的頻繁使用,不僅對生物多樣性造成了極大威脅,而且導致了害蟲抗藥性、農藥殘留超標、土壤板結、環境污染等諸多問題[5-7];此外,近年來化學農藥的大量及不合理使用加大了斜紋夜蛾的選擇壓,對其防治效果日趨下降[8-9],故挖掘針對斜紋夜蛾等鱗翅目害蟲的天然活性化合物具有重要現實意義。

香豆素(coumarin)又稱香豆精、香豆內酯、1,2-苯并吡喃酮,廣泛存在于自然界中,在蕓香科、傘形科及桑科植物中含量較高,在豆科、蘭科、木樨科、茄科和菊科植物中也有廣泛分布,同時還是部分微生物代謝的主要產物[10-12]。近年來,香豆素因具有多種生物活性,已成為醫藥、農藥等行業的開發研究熱點。雙香豆素(dicoumarin,DIC)屬于香豆素類,也是一種1,2-苯并吡喃酮類化合物,最早作為一種抗凝血劑應用于醫學。隨著研究的深入,人們發現雙香豆素還具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗HCV、抗HIV、抗老年癡呆、抗瘧疾、抗寄生蟲、細胞毒性等多種生物活性[13-14]。

魏靜等的研究表明,人肝癌細胞(Hep G2)對雙香豆素表現出較強的敏感性,IC50為(3.19±0.68)μmol/L,且雙香豆素對Hep G2細胞的抑制作用呈劑量和時間依賴性[15]。Mazumder等研究了一系列雙香豆素衍生物的抗病毒活性,發現雙香豆素衍生物NSC 158393對HIV-2、貓和猴免疫缺陷病毒整合酶具有良好的抑制活性,IC50為0.8～2.3 μmol/L[16]。Katsori等的研究顯示,香豆素的物理化學性質與其生物活性強弱密切相關,在C3、C4和C7位置具有多種藥效基團的合成香豆素已用于抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、抗炎、抗真菌、抗類風濕性關節炎、抗晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGEs)和抗痤瘡活性研究[17]。Reddy等的研究表明,硫代香豆素、3-芳基-8-烯丙基-7-羥基-香豆素、三唑基香豆素和肽偶聯香豆素甲酰胺的雜化物對哺乳動物癌細胞系表現出較好的細胞毒性和抗菌活性[18]。楊麗君等的研究顯示,呋喃香豆素類和雙香豆素類化合物具有良好的殺線蟲活性,在病害防治方面也展現出廣闊的探索價值[19]。

利用離體細胞進行毒性測定是一種穩定、高效、靈敏的檢測方法,該方法具備耗藥量少、靈敏、簡便、周期短、適宜于快速篩選、試驗條件易于控制、節約人工等優點[20-23]。故本文以斜紋夜蛾卵巢細胞系SL-221和雙香豆素為研究對象,擬通過CCK-8法檢測不同濃度下雙香豆素對SL-221細胞的毒性,并采用流式細胞術測定該化合物對細胞周期、線粒體膜電位及細胞凋亡的影響;最后,利用實時熒光定量PCR技術探索營養信號通路(PI3K/TOR)上關鍵基因的表達情況。旨在從細胞水平上初步探討雙香豆素對SL-221細胞增殖的抑制活性及其作用機理,以期為雙香豆素的開發利用提供理論基礎,同時為斜紋夜蛾的生物防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑及細胞

雙香豆素,分子式C19H12O6,分子量336.30,CAS號:66-76-2,由廣東省農業科學院果樹研究所資源與環境實驗室提供,結構式見圖1。印楝素購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;佛手柑內酯、茴芹內酯、異茴芹內酯、異歐前胡素、甲氧基香豆素、檸檬油素、傘形花內酯、異牡荊黃素、番石榴苷、東莨菪苷、根皮苷、(-)-沒食子兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素、(+)-表兒茶素、香葉木素7-O-beta-D-葡萄糖苷、(±)-兒茶精、(-)-兒茶素、槲皮素、沒食子酸、沒食子酸甲酯購自四川維克奇生物科技有限公司。斜紋夜蛾Spodopteralitura卵巢細胞SL-221,由廣東省農業科學院果樹研究所資源與環境實驗室培養。

圖1 雙香豆素結構式

1.2 試驗方法

1.2.1斜紋夜蛾卵巢細胞SL-211培養

將SL-211凍存管從液氮中取出,迅速投入37℃水浴使細胞融化,細胞融化后用酒精棉球擦拭凍存管表面以消毒,之后在超凈工作臺中將細胞液轉入離心管,800 r/min離心3 min。去上清,加入1 mL SIM SF昆蟲細胞培養基(含10%胎牛血清)重懸細胞,將細胞懸液接入培養瓶中,補足培養液至3 mL,放入27℃恒溫培養箱培養。待細胞密度達到85%～90%時,棄去原培養基,加入3 mL新的SIM SF昆蟲細胞培養基(含5%胎牛血清),用一次性吸管輕柔吹打細胞使其脫壁分散,并分裝傳代。之后每2 d傳代細胞一次,定期觀察記錄細胞狀態。

1.2.2CCK-8法檢測化合物對斜紋夜蛾SL-211細胞的毒性

用Cell Counting Kit(簡稱CCK-8試劑盒，北京聚合美生物科技有限公司)檢測雙香豆素等21個酚類化合物對SL-221細胞的毒性。取對數生長期生長狀態良好的SL-221細胞,用吸管將貼壁細胞輕柔吹打脫壁,并用SIM SF昆蟲細胞培養基(含5%胎牛血清)調節細胞濃度至5×105個/mL。將細胞懸液接種于96孔板,每孔100 μL,置于27℃恒溫培養箱培養過夜。用細胞培養級二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)將供試化合物配制成母液。試驗前用無血清SIM SF培養基將藥液倍比稀釋至0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL。棄去96孔板中原有培養基,分別加入不同濃度含藥培養基,每個濃度4個重復。以含0.1% DMSO無血清培養基作為空白對照,相同濃度的印楝素作為陽性對照,置于27℃恒溫培養箱孵育48 h。48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,之后放入培養箱繼續避光孵育2 h,用酶標儀測定450 nm處的吸光度,并按照公式計算細胞抑制率,細胞抑制率為50%的值即為IC50。

細胞抑制率=(A零加藥-A加藥)/(A零加藥-A空白)×100%。

式中,A零加藥表示含有細胞的培養基、CCK-8溶液、0.1% DMSO,無待測化合物的孔的吸光度。A加藥表示含有細胞的培養基、CCK-8溶液、待測化合物的孔的吸光度。A空白表示含培養基、CCK-8溶液、待測化合物,無細胞的孔的吸光度。

1.2.3雙香豆素處理后斜紋夜蛾SL-211細胞形態學觀察

經CCK-8法篩選,雙香豆素對SL-221細胞增殖活性的抑制率最高,選用雙香豆素做后續機理研究。6 cm細胞培養皿中接種2 mL對數生長期的SL-221細胞懸液(細胞密度約為5×105個/mL),置于27℃培養箱培養24 h后吸去SIM SF培養基,更換為含有4 μg/mL雙香豆素的新鮮細胞培養基。藥劑分別處理細胞0、3、6、12、24、48 h,其中0 h為對照,于倒置顯微鏡下觀察,并拍照記錄細胞形態的變化。

1.2.4流式細胞術檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-211細胞周期的影響

配制含1 μg/mL雙香豆素的無血清SIM SF培養基備用。取對數生長期狀態良好的SL-221細胞以5×106個/mL密度接種于6孔板中培養過夜。棄去原有培養基,加入含藥培養基,以含0.1% DMSO無血清培養基為對照。27℃恒溫培養箱分別孵育0、3、6、12、24、48 h后收集細胞,其中0 h為對照,每板設為1組,其中每孔對應1個處理時間,每個處理時間重復3組。采用DNA含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)檢測細胞各個時期DNA含量。用PBS洗滌細胞2次,70%乙醇固定細胞,4℃冰箱過夜。次日用PBS洗滌細胞2次,之后加入100 μL RNaseA溶液,37℃水浴30 min,再加入400 μL PI染色液4℃避光孵育30 min。完成后立即用流式細胞儀(BD FACS)在激發波長488 nm,發射波長617 nm處檢測PI(紅色)熒光,FlowJo軟件統計分析G0/G1(DNA合成前期)、S(DNA合成期)、G2/M(DNA合成后期)的細胞數量。

1.2.5JC-1熒光標記法檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-211細胞線粒體膜電位的影響

細胞處理方法同1.2.4。分別收集經1 μg/mL雙香豆素處理0、3、6、12、24、48 h的細胞,其中0 h為對照,用PBS清洗細胞2次。按照線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，北京索萊寶科技有限公司)使用說明,加入1 mL JC-1染色工作液,37℃避光孵育30 min,后用JC-1染色緩沖液清洗細胞2次,1 mL JC-1染色緩沖液重懸細胞,流式細胞儀檢測激發波長585 nm,發射波長590 nm處的PE(紅色)熒光;激發波長515 nm,發射波長529 nm處FITC(綠色)熒光,并計算紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體膜電位的變化情況(紅綠熒光的相對比例=紅色熒光百分比/綠色熒光百分比)。

1.2.6Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-211細胞凋亡的影響

細胞處理方法同1.2.4。分別收集經1 μg/mL雙香豆素處理0、3、6、12、24、48 h的細胞,其中0 h為對照,800 r/min離心3 min,用PBS清洗細胞2次。之后用Binding buffer重懸細胞,然后按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)說明書加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染液與10 μL PI染液,室溫避光雙染細胞,流式細胞儀檢測激發波長535 nm,發射波長615 nm處的PI(紅色)熒光;激發波長488 nm,發射波長525 nm處的FITC(綠色)熒光,并用FlowJo軟件分析細胞凋亡情況。

1.2.7RT-qPCR法檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-211細胞相關基因表達情況的影響

采用RT-qPCR檢測斜紋夜蛾卵巢細胞凋亡、細胞自噬相關基因(SL-Bcl-2、SL-PI3K、SL-TOR、SL-P53、SL-CytoC、SL-Atg8)的表達情況,以SL-Actin為內參基因。引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。細胞處理方法同1.2.4,收集經1、2、4 μg/mL雙香豆素分別處理0、3、6、12、24、48 h的SL-221細胞,其中0 h為對照,用TRIzol試劑提取細胞總RNA,反轉錄合成cDNA。利用Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀進行擴增反應,體系(10 μL):cDNA 1 μL、2×M5 HiPer Real time PCR Super mix with Low Rox 5 μL、上、下游引物共0.5 μL,RNase Free ddH2O 3.5 μL。反應程序為：95℃預變性30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個循環;95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。重復3次。通過RT-qPCR可以得到目的基因與內參基因的Ct值,Ct值表示熒光達到熒光閾值的循環數,Ct值與樣本起始拷貝數的對數存在線性關系,即Ct值越小,起始拷貝數就越多,利用2-ΔΔCt(ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因,ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組)計算出不同處理時間下的SL-221細胞基因相對表達量。

表1 斜紋夜蛾生長發育相關基因 RT-qPCR 所需引物

1.3 數據分析

本試驗結果均為3次以上重復試驗統計獲得,運用IBM SPSS Statistics 26軟件分析數據,結果由平均值±標準差(SD)表示,各處理組所得平均值之間的差異通過單因素方差分析及Duncan氏多重比較進行檢驗評估,P<0.05表示在統計學上具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 CCK-8法檢測化合物對斜紋夜蛾SL-211細胞的毒性

21個供試藥劑中雙香豆素對SL-221細胞的抑制活性最高[48 h抑制中濃度(IC50)為0.85 μg/mL],是陽性對照印楝素(48 h IC50為7.20 μg/mL)的8.47倍(表2)。在21個化合物中,檸檬油素、甲氧基香豆素、茴芹內酯、異歐前胡素、傘形花內酯也展現出良好的細胞抑制活性,其IC50分別為7.23、8.76、8.81、9.62、9.63 μg/mL。異牡荊黃素、根皮苷、沒食子酸、沒食子酸甲酯、東莨菪苷、(±)-兒茶精、異茴芹內酯、(-)-兒茶素、番石榴苷的細胞抑制活性次之,其IC50分別為10.24、11.64、11.81、12.44、13.12、15.73、17.05、17.21、18.38 μg/mL;佛手柑內酯、(+)-表兒茶素、槲皮素、(-)-表沒食子兒茶素、(-)-沒食子兒茶素、香葉木素7-O-beta-D-葡萄糖苷的細胞抑制活性較差。

表2 21種酚類化合物對斜紋夜蛾卵巢細胞SL-211的毒力

0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL雙香豆素作用于SL-221細胞,48 h后細胞抑制率分別為49.00%、65.00%、68.94%、80.82%、91.60%、93.55%、95.13%(圖2)。表明雙香豆素對SL-221細胞具有良好的抑制增殖活性,且呈現濃度依賴性。

圖2 雙香豆素處理斜紋夜蛾卵巢細胞48 h的細胞抑制率

2.2 雙香豆素處理后斜紋夜蛾SL-221細胞形態學觀察

利用倒置顯微鏡觀察4 μg/mL雙香豆素處理SL-221細胞不同時間其形態的變化(圖3)。結果顯示,0 h時細胞外部形態飽滿,細胞膜光滑通透,呈不規則圓形或梭形,貼壁生長狀態良好;處理3 h和6 h時少部分細胞脫壁變圓,細胞膜光滑度減小;處理12 h后,細胞膜表面粗糙,出現腫脹細胞,細胞增殖受到抑制;處理24 h后,細胞不能貼壁生長,細胞膜破裂,出現凋亡小體;處理48 h后,細胞腫脹破裂,內容物溢出,凋亡小體增多,大量細胞死亡。通過形態學觀察發現48 h內,隨著藥劑處理時間的延長,細胞凋亡現象趨于明顯。由此可見,雙香豆素對SL-221細胞增殖抑制作用呈現時間依賴性。

圖3 雙香豆素誘導的斜紋夜蛾卵巢細胞形態變化

2.3 流式細胞術檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-221細胞周期的影響

經1 μg/mL雙香豆素處理0、3、6、12、24、48 h的SL-221細胞的細胞周期分布情況見圖4。處于不同細胞周期的細胞比例的統計分析結果見圖5。處理48 h與0 h相比,G0/G1期的細胞比例由(46.37±2.61)%下降至(19.77±1.56)%,S期的細胞比例由(28.60±1.71)%下降至(20.90±5.87)%,而G2/M期的細胞比例由(24.73±2.11)%增加至(59.67±4.94)%。由此可見,雙香豆素可誘導SL-221細胞的細胞周期阻滯在G2/M期。

圖4 雙香豆素處理不同時間斜紋夜蛾卵巢細胞細胞周期的分布情況

圖5 雙香豆素誘導的斜紋夜蛾卵巢細胞細胞周期阻滯分析

2.4 JC-1熒光標記法檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-221細胞線粒體膜電位的影響

利用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和流式細胞儀檢測雙香豆素處理不同時間,SL-221細胞線粒體膜電位的變化情況(圖6)。線粒體膜電位較高時,JC-1在線粒體基質中形成聚合物,呈紅色熒光;而當線粒體膜電位較低時,JC-1為單體,呈綠色熒光,其變化情況統計結果見圖7。1 μg/mL雙香豆素處理3 h后細胞內的紅/綠熒光比例與0 h相比顯著降低(P<0.05),并隨處理時間延長,線粒體膜電位持續降低。處理時間至48 h時,細胞內的紅/綠熒光比例由0 h時的10.58降至0.04,下降了99.62%。由此表明,雙香豆素能夠明顯降低SL-221細胞的線粒體膜電位。

圖6 雙香豆素對斜紋夜蛾卵巢細胞線粒體膜電位的影響

圖7 雙香豆素對斜紋夜蛾卵巢細胞線粒體膜電位影響情況的統計分析

2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-221細胞凋亡的影響

1 μg/mL雙香豆素處理SL-221細胞0、3、6、12、24、48 h后,采用流式細胞儀檢測FITC,PI通道熒光強度,獲得處理不同時間下各類細胞的分布情況(圖8)。其中左上象限(Q1)表示壞死細胞、右上象限(Q2)表示晚期凋亡細胞、右下象限(Q3)表示早期凋亡細胞、左下象限(Q4)表示正常細胞。經Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染統計各類細胞的比例(圖9),可以看出,雙香豆素處理48 h與0 h相比,正常細胞比例由(74.33±1.03)%降低至(25.90±6.61)%,早期凋亡細胞比例由(7.25±3.33)%增加到(23.37±4.34)%,晚期凋亡細胞比例由(14.49±5.06)%增加到(46.40±1.35)%。由此可見,雙香豆素可誘導SL-221細胞凋亡,且細胞凋亡率與處理時間呈正相關。

圖8 Annexin V-FITC/PI雙染檢測雙香豆素誘導的斜紋夜蛾卵巢細胞凋亡

圖9 Annexin V-FITC/PI雙染檢測雙香豆素誘導斜紋夜蛾卵巢細胞凋亡情況的統計分析

2.6 RT-qPCR法檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-221細胞相關基因表達情況的影響

進一步通過RT-qPCR法檢測SL-221細胞凋亡、細胞自噬相關基因的mRNA表達情況。由結果(圖10)可知,1、2、4 μg/mL雙香豆素處理SL-221細胞3～48 h,SL-PI3K、SL-TOR和SL-Bcl-2基因表達量呈現下降趨勢,且藥物處理濃度越高,下降越明顯。其中,處理48 h,SL-PI3K基因表達量分別較對照下調了86.42%、90.11%、93.36%;SL-TOR基因表達量分別較對照下調了98.08%、98.66%、98.81%;SL-Bcl-2基因表達量分別較對照下調了92.25%、97.69%、98.49%;SL-Atg8、SL-CytochromeC和SL-P53基因表達量呈現上調趨勢。其中,處理48 h,SL-Atg8基因表達量分別較對照上調12.31倍、13.21倍、14.83倍;SL-CytochromeC基因表達量分別較對照上調了11.08倍、23.81倍、26.57倍;SL-P53基因表達量分別較對照上調了21.59倍、33.36倍、91.18倍。

圖10 不同濃度雙香豆素誘導斜紋夜蛾卵巢細胞6種基因表達變化情況

3 結論與討論

雙香豆素最早因其具有干擾維生素K代謝循環的作用,在臨床上被廣泛用作抗凝血劑。已有研究表明,雙香豆素在抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗結核和抗精神病等方面具有良好活性,但針對農業害蟲方面的研究卻未見報道。本文以斜紋夜蛾卵巢細胞為靶標,研究雙香豆素對細胞的毒力及相關作用機理,結果表明,雙香豆素對斜紋夜蛾卵巢細胞具有良好的增殖抑制活性,IC50為0.85 μg/mL,其活性是陽性對照印楝素(IC50為7.20 μg/mL)的8.47倍,且抑制活性具有濃度依賴趨勢,顯示出優于印楝素的發展潛力;進一步通過流式細胞術檢測發現雙香豆素不僅阻斷SL-221細胞周期,同時促使線粒體膜電位下降,誘導昆蟲細胞凋亡。細胞周期是控制細胞生長的主要調控機制,由于正常細胞不斷增殖,細胞總是處于G0/G1,S,G2/M連續的細胞周期中。在細胞周期的各階段,細胞分別進行著DNA復制、蛋白質合成及細胞分裂等重要的生理活動。其中G2/M期主要進行DNA復制,DNA復制完成后細胞分裂并啟動下一個細胞周期,經雙香豆素處理的大多數細胞的周期停留在G2/M期,細胞無法進行正常有絲分裂,進而抑制了細胞的增殖。

PI3K在調控細胞增殖、分化和凋亡等多種細胞功能中發揮重要作用,PI3K可直接激活蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和TOR,導致其磷酸化,磷酸化后的Akt促使轉錄因子FOXO入核發揮轉錄活性,進而調控營養信號通路(PI3K/TOR)下游關鍵基因Atg8、P53及Bad等的表達,誘導細胞自噬(autophagy)與細胞凋亡(apoptosis)[24]。本研究發現,雙香豆素誘導SL-221細胞的SL-PI3K、SL-TOR基因相對表達量顯著下調,提示雙香豆素能夠抑制PI3K/TOR營養信號通路的信號傳導,促進細胞自噬和凋亡的產生。細胞自噬和細胞凋亡是兩種重要的細胞自我消化過程,在真核生物的進化過程中高度保守,又被稱為程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD),是為了維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程[25]。線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)存在于線粒體內、外膜之間,細胞外源性損傷和自身衰老均可引起MPTP開放。在環境脅迫下,當MPTP不可逆地過度開放時,線粒體跨膜電位崩解,細胞色素C(Cyto C)等促凋亡活性蛋白釋放至胞漿內促使細胞凋亡。在該過程中,線粒體膜電位下降是凋亡的早期表現,一旦線粒體膜電位損耗,細胞就會進入不可逆的凋亡過程[26-28]。目前已發現Bcl-2蛋白家族包括25種家族同源蛋白,其中抑制凋亡因子Bcl-2、Bcl-x和Bcl-w能阻止Cyto C從線粒體釋放到細胞質,而促凋亡因子Bad、Bid和Bax可促進Cyto C從線粒體釋放到細胞質,從而調控細胞凋亡[29]。本研究發現,雙香豆素處理SL-221細胞48 h后,線粒體膜電位顯著下降,且凋亡相關基因SL-CytoC、SL-P53上調,SL-Bcl-2下調,表明雙香豆素可誘導SL-221細胞發生線粒體途徑的凋亡。

綜上,天然產物雙香豆素對SL-221細胞的抑制活性優于印楝素,且原材料易獲取,深入研究發現雙香豆素可通過PI3K/TOR營養信號通路,誘導SL-221細胞自噬和凋亡,從而抑制細胞增殖,但其具體的調控機制及對蟲體的生物活性仍需深入探討。