棉鈴蟲圍食膜中Bt抗性相關蛋白的分離與鑒定

李怡萍, 劉少凱, 袁向群,

(1.西北農林科技大學植物保護學院, 農業農村部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室, 楊凌 712100; 2.中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera是鱗翅目夜蛾科的一種世界性重大農業害蟲,其分布范圍廣泛,在我國西北內陸棉區、長江流域棉區和黃河流域棉區這三大主要棉區均有分布。棉鈴蟲寄主范圍廣,能取食包括棉花、玉米、大豆等多種農作物及經濟作物,具有環境適應能力強、產卵量大、遷飛距離遠等特點[1-2]。在20世紀60年代至70年代,對棉鈴蟲的防治均以化學防治為主,其中有機磷類、有機氯類等多種化學殺蟲劑被先后使用。但是隨著殺蟲劑的大量使用,20世紀80年代末至90年代初期,棉鈴蟲快速對滴滴涕、硫丹、擬除蟲菊酯類等常規殺蟲劑產生了抗性,田間防治基本失效,加之適宜的氣候條件等原因,棉鈴蟲在我國黃河流域和長江流域棉區連年暴發成災,造成了極大的損失,直接經濟損失超過百億元[3-4]。

1997年,我國開始商業化種植轉Bt(Bacillusthuringiensis,蘇云金芽胞桿菌)基因的抗蟲棉[5]。轉Bt基因棉的種植,以及Bt生物殺蟲劑的使用,不僅有效防控了棉鈴蟲等靶標害蟲,還減少了很多化學殺蟲劑的使用[4]。我國目前種植的轉基因棉花均為表達cry1Ac基因或cry1Ac+cry1Ab融合基因的Bt棉,隨著我國棉花種植空間不斷向以新疆為主的西北棉區集中,長期使用單價cry1A家族的Bt棉必然會存在田間抗性進化的隱患[4]。

目前研究表明抗性產生的最主要原因是昆蟲中腸的刷狀緣膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMV)上與Bt殺蟲蛋白結合的受體的改變或突變引起的[6-8]。昆蟲取食Bt Cry1A類全長蛋白后,在中腸堿性環境中被胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶水解,N端去除40個左右的氨基酸,C端去除500個左右的氨基酸,原蛋白由130 kD左右被活化為65 kD左右有殺蟲活性的核心片段。活化的蛋白片段穿過圍食膜(peritrophic membrane,PM),進一步與中腸BBMV上受體結合,發揮作用。但是Bt殺蟲蛋白只有穿過中腸圍食膜才能達到中腸上皮細胞的作用位點與受體結合,且研究發現昆蟲圍食膜上也可能存在與Bt殺蟲蛋白結合的受體蛋白,因此,昆蟲圍食膜蛋白的改變也可能引起Bt抗性的產生[9-11]。

1762年在鱗翅目幼蟲中發現圍食膜結構,1890年正式命名[12]。圍食膜是中腸前端一直延伸至后腸的一層厚薄均勻的無色透明的非細胞結構薄膜,是由中腸細胞分泌形成的,主要由蛋白質、黏多糖和幾丁質組成,是昆蟲抵御病原微生物入侵及有害物質的第一道天然保護性屏障,具有保護中腸上皮細胞、阻止病原物入侵等防御功能[13-17]。有關圍食膜蛋白的組成研究一直是學者們關注的熱點,張嚴峻等[18]使用SDS-PAGE技術在棉鈴蟲圍食膜中發現了16種蛋白,Campbell等[15]通過質譜技術鑒定出了41個棉鈴蟲幼蟲圍食膜蛋白質。隨著生物技術的發展,梁振普等[17]通過LC-MS/MS技術鑒定了169個棉鈴蟲圍食膜蛋白質。其中也包括了堿性磷酸酶2(alkaline phosphatase 2)、氨肽酶N1(aminopeptidase N1)、ATP合成酶β亞基(ATP synthase subunit beta)、V型質子ATP酶D2亞基(V-type proton ATPase subunit D2)等,這些蛋白是Bt殺蟲蛋白結合的受體,與Bt抗性產生有一定的關系。

然而,對棉鈴蟲圍食膜蛋白與Bt抗性的關系研究甚少,本研究以棉鈴蟲抗、感品系圍食膜為對象,采用蛋白質分離和配體雜交(ligand blot)技術,研究棉鈴蟲圍食膜上與Bt-Cry1Ac存在結合能力有差異的蛋白,通過質譜鑒定和生物信息學分析等技術,鑒定可能參與Bt殺蟲蛋白抗性進化的差異蛋白。研究有助于理解棉鈴蟲圍食膜蛋白與Bt殺蟲蛋白之間的作用,為進一步明確Bt抗性機制、制定合理的Bt抗性治理策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及飼養條件

敏感品系棉鈴蟲(96S):于1996年采自河南省新鄉棉田,室內用人工飼料飼養至今,從未接觸任何殺蟲劑。棉鈴蟲Bt抗性品系(BtR):在室內用Cry1Ac蛋白篩選了175代,相對抗性倍數為3 500倍,篩選方法參見史艷霞等[19]方法。飼養條件: 溫度(27±2)℃,相對濕度(75±10)%,光周期為L∥D=14 h∥10 h。幼蟲在指形管(直徑2 cm,長度15 cm)中用人工飼料[20]飼養,成蟲在產卵籠(直徑29.5 cm,高35 cm)中用10%蜂蜜水飼養。上述所有棉鈴蟲品系均由中國農業科學院植物保護研究所棉花害蟲組饋贈。

1.2 供試Bt菌株及抗體

供試BacillusthuringiensisHD-73菌株和Cry1Ac抗體均由中國農科院植物保護研究所生物技術組饋贈。二抗為山羊抗兔,購自北京中杉金橋公司。

1.3 棉鈴蟲圍食膜蛋白的提取分離

1.3.1圍食膜樣品的獲取

分別取抗、感品系健康的5齡棉鈴蟲幼蟲,置于冰上10 min,剖取圍食膜,用冷卻的生理鹽水(0.7% NaCl)沖洗去掉里面的食物,在濾紙上快速吸干多余液體,每1條圍食膜放入1個EP管中,液氮中快速冷卻,使用FD5508冷凍干燥機(美國SIM公司)冷凍干燥48 h后,置-80℃冰箱保存備用。

1.3.2棉鈴蟲圍食膜蛋白的分離純化

參考Campbell等[15]和李怡萍等[21]的方法,稱取冷凍干燥的抗、感品系棉鈴蟲圍食膜樣品各1 mg,進行無水三氟利克酸(anhydrous trifluoromethanesulfonic acid,TFMS)處理,用GlycoPrfile TM IV,Chemical Deglycosylation Kit(美國Invitrogen公司)進行總蛋白的提取,再用2D Clean-Up Kit(美國GE Biosciences公司)純化提取的總蛋白。

1.3.3棉鈴蟲圍食膜蛋白質含量的測定

取1.3.2中純化的抗、感品系圍食膜蛋白沉淀(指初始取的冷凍干燥圍食膜為1 mg,經TMFS處理與純化后獲得的總蛋白沉淀),分別用200 μL上樣緩沖液IEF溶解。12 000 r/min、4℃,離心5 min(5145D臺式離心機,德國Eppendorf Corporation),除去不溶物質和泡沫,取上清液,用2D Quant Kit(美國GE Biosciences公司)測定蛋白濃度。根據測定的蛋白濃度計算出1 mg干燥的圍食膜樣品中蛋白質總重和蛋白質含量。每樣品重復3次,測定數據使用DPS 9.50中獨立樣本t測驗進行差異顯著性分析。

1.3.4棉鈴蟲圍食膜蛋白的NuPAGE電泳

取1.3.2中純化的抗、感品系圍食膜蛋白沉淀,使用NuPAGE 4%～12% Bis-Tris Mini Gel預制梯度膠(美國Invitrogen公司)及NuPAGE電泳槽(美國Stragene公司)進行電泳,電泳電壓為200 V,電泳時長為50 min。電泳完成后進行考染。

1.3.5棉鈴蟲圍食膜蛋白與活化Cry1Ac的結合能力檢測

采用1.3.4中的方法對抗性和敏感品系的圍食膜蛋白進行電泳檢測。上樣之前要測其蛋白濃度,使二者保持相同的蛋白濃度。電泳結束后的膠塊不染色,直接進行ligand blot,先加活化的Cry1Ac,再分別加一抗Cry1Ac抗體和二抗山羊抗兔,最后使用Eagle Eye System凝膠成像儀系統(美國Stragene公司)進行曝光檢測。

1.4 抗、感品系棉鈴蟲圍食膜差異蛋白的鑒定分析

1.4.1棉鈴蟲圍食膜蛋白的蛋白膠內酶解及質譜鑒定

在考染膠上用挖膠筆挖出選定的有顯著差異的蛋白條帶,盡可能避免切到膠以外的部分,放入離心管中。蛋白膠內酶解和質譜鑒定由華大蛋白公司完成。

1.4.2棉鈴蟲圍食膜蛋白的質譜數據生物學分析

將質譜鑒定過程中,由MALDI-TOF(基質輔助激光解吸電離離子源和飛行時間質量分析器聯用)質譜儀(新加坡ABSciex公司)獲得肽指紋圖譜(peptide-mass fingerprint,PMF),用MASCO(http:∥mascot.proteomics.com.cn/)Aldente軟件搜索NCBI nr和Swiss-Prot數據庫,并參考了中國農業科學院植物保護研究所棉花害蟲組的棉鈴蟲cDNA文庫數據,進行BLAST，比對PMF的結果。比較數據庫中相應多肽序列的質量數及其MS/MS圖譜的相關性,由中國農業科學院植物保護研究所生物技術組束長龍老師幫助檢索。

2 結果與分析

2.1 抗、感品系棉鈴蟲圍食膜蛋白含量

由表1可以看出,敏感品系棉鈴蟲的圍食膜蛋白含量為22.19%,抗性品系棉鈴蟲的圍食膜蛋白含量為26.99%,抗性品系蛋白含量顯著高于敏感品系(P<0.05)。

表1 棉鈴蟲圍食膜蛋白質含量1)

2.2 棉鈴蟲圍食膜蛋白的NuPAGE電泳分離

NuPAGE電泳分離結果(圖1)顯示,重復3次的結果可以看出,分離效果清晰,可以分離出大約30種圍食膜蛋白,且所有蛋白包括大分子量220 kD和小分子量10 kD都能分離出來。

圖1 棉鈴蟲圍食膜蛋白質NuPAGE電泳結果

2.3 抗、感品系圍食膜蛋白與Cry1Ac的結合能力比較

運用ligand blot檢測分離純化的抗、感品系棉鈴蟲圍食膜蛋白與Cry1Ac的結合能力,結果發現蛋白大小分別為220、170、120、65、43、35 kD的6個圍食膜蛋白可與Cry1Ac結合,而且不同品系中結合能力差異明顯(圖2)。由ligand blot結果可知,Cry1Ac與敏感品系的圍食膜蛋白結合較強,與抗性品系結合弱。說明圍食膜蛋白上可能存在Cry1Ac的受體。

圖2 Ligand blot檢測CrylAc結合蛋白

2.4 棉鈴蟲抗、感品系圍食膜差異蛋白分析及鑒定

運用NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gels電泳比較Bt抗、感品系棉鈴蟲圍食膜蛋白,敏感品系(S)得到了220、170、120、60 kD左右的4個差異明顯的蛋白條帶,而在抗性品系(R)上很少或者幾乎沒有(圖3)。

圖3 棉鈴蟲抗感品系圍食膜蛋白NuPAGE電泳分析圖

2.5 棉鈴蟲抗、感品系圍食膜差異蛋白的質譜鑒定

用MALDI-TOF質譜分析鑒定了2.4中篩選到的4個蛋白,獲得肽指紋圖譜PMF,通過比對成功鑒定得到了4個相關蛋白并獲得相關生物學信息(表2)。

經NCBI blastn比對,蛋白1雖然有一定數量匹配結果,但是檢索覆蓋率都比較低,認為屬于新蛋白。蛋白4與數據庫中序列的一致性較低,也屬于新蛋白。蛋白2與棉鈴蟲羧酸酯酶(carboxyl/choline esterase,61.7 kD)有較好的一致性。蛋白3與豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的血影蛋白(spectrin beta chain-like,266.2 kD)有較好一致性(表2)。

表2 4種棉鈴蟲圍食膜蛋白BLAST比對結果

3 結論與討論

關于棉鈴蟲圍食膜蛋白質分離與鑒定的研究比較多。張嚴峻等[18]采用SDS-PAGE不連續膠(3%分離膠，10%濃縮膠)發現很多不同分子量大小的蛋白質,分離出比較清晰的16個條帶,蛋白質分子量一般在97.4 kD以下,很多蛋白質的分子量很接近。張小霞[22]研究發現使用12%分離膠和5%濃縮膠可以分離的圍食膜蛋白質種類較多,至少有14種蛋白質,并且小分子量的蛋白質含量較高,分子量一般在97 kD以下,蛋白質的分子量也比較接近。Campbell等[15]以棉鈴蟲、美洲棉鈴蟲Helicoverpazea和煙芽夜蛾Helicoverpavirescens為試蟲,發現利用無水三氟甲烷磺酸(TMFS)可以溶解包括幾丁質在內的全部圍食膜組分,可將蛋白從幾丁質中解離,獲得幾乎所有的圍食膜蛋白,并以此鑒定出了41種蛋白。梁振普等[17]參考Campbell等[15]的研究,利用TMFS與LC-MS/MS技術鑒定出了169個棉鈴蟲圍食膜蛋白質。其中也包括了ALP、APN、ATP合成酶β亞基、ABC轉運蛋白等可能為Bt殺蟲蛋白受體的蛋白質,這也說明了棉鈴蟲圍食膜蛋白確實與Bt抗性產生有一定的關系[23-26]。本研究運用Campbell等[15]和李怡萍等[21]的方法,將圍食膜樣品冷凍干燥后用TMFS法處理,然后進行NuPAGE梯度膠電泳,結果分離到約30種圍食膜蛋白,分離效果較好。沒有達到Campbell報道的41種蛋白,推測可能是因為選用的棉鈴蟲品系不同,存在地理差異,從而導致了分離出的蛋白數目不同。

有報道表明Bt Cry活化蛋白與中腸上皮細胞受體的結合,是Bt殺蟲蛋白發揮作用的主要過程。類鈣黏蛋白(cadherin-like protein,CAD)、氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和ABC轉運蛋白(ATP binding cassette sub family C)等都是重要的Bt殺蟲蛋白受體[27-28]。其中APN為昆蟲中腸BBMV中含量最高的蛋白酶(約占55%),在中腸的功能行使過程中發揮著重要作用[29]。

已有研究表明抗、感品系中腸上受體蛋白的差異表達可能是昆蟲產生抗性的直接原因[6,11,14]。本研究使用2D Quant Kit測定總蛋白濃度,發現抗性品系蛋白含量顯著高于敏感品系,其中敏感品系圍食膜中蛋白含量為22.19%,抗性品系圍食膜中蛋白含量為26.99%,推測圍食膜中蛋白含量增加很可能和抗性的產生相關。其次,本研究測定的敏感品系棉鈴蟲圍食膜蛋白含量和張嚴峻等[18]測定的34.47%的結果差距較大,推測可能是由于本研究使用的TMFS處理方法與張嚴峻等[18]使用的酸水解、堿水解以及Folin-酚處理方法不同,使得中間過程中損耗了蛋白質。

為了進一步驗證圍食膜上蛋白質的功能,本研究運用配體雜交技術比較了抗、感品系棉鈴蟲圍食膜蛋白與Cry1Ac的結合特性。結果發現6個圍食膜蛋白(大小為220、170、120、65、43、35 kD左右)可與Cry1Ac結合,且敏感品系上結合強度明顯大于抗性品系。其中120 kD大小的蛋白推測可能是APN蛋白,65 kD大小的蛋白推測可能是ALP蛋白,大小與已有報道的棉鈴蟲中腸上的APN、ALP等Bt殺蟲蛋白受體大小也基本一致[30-33]。Zhang等[34]發現APN基因突變導致棉鈴蟲對Cry1Ac抗性增加,Agrawal等[35]也發現減少斜紋夜蛾Spodopteralitura體內APN基因的表達,也會顯著降低蟲體對Cry1C的敏感性。也有報道表明,在部分鱗翅目抗性品系昆蟲的中腸組織中,ALP的表達量有所下降[36-37]。

本研究利用NuPAGE電泳技術比較了抗、感品系圍食膜蛋白的差異,獲得了4種差異明顯的蛋白,這4種蛋白只存在于敏感品系,在抗性品系中缺失;通過質譜鑒定和生物信息學分析方法,確定了其中2種為棉鈴蟲羧酸酯酶和血影蛋白,推測另外2種蛋白可能是新蛋白。羧酸酯酶是能水解含羧基官能團的酸酯、酰胺和硫酯類化合物的一類酯酶[38-39]。大部分羧酸酯酶與化學信息素代謝和殺蟲劑抗性產生有關,如擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類、有機磷類等殺蟲劑在昆蟲體內的解毒過程中羧酸酯酶均發揮著重要作用[5]。也有文獻報道棉鈴蟲中腸中有著較高活性的羧酸酯酶,在棉鈴蟲解除毒素毒性的過程中起著重要的作用[15]。血影蛋白(spectrin)是紅細胞細胞骨架中最重要的蛋白質,它與錨蛋白(ankyrin)和跨膜陰離子交換蛋白(anion exchanger1, AE1)共同維持紅細胞膜結構的穩定性和柔韌性[40-41]。而圍食膜也是由中腸細胞分泌的一層非細胞組織,其中圍食膜蛋白也有維持圍食膜彈性和伸縮特性的功能,維持著圍食膜的結構。綜合以上研究結果,推測本研究中鑒定出的這兩種蛋白很可能與Bt抗性有關。

本研究證明棉鈴蟲圍食膜蛋白質中,存在能與Bt殺蟲蛋白結合的蛋白,可能與Bt抗性相關,研究結果對于進一步明確Bt抗性機制、制定合理的Bt抗性治理策略提供了理論依據。