棉鈴蟲JNKs基因的克隆及表達分析

于思琪, 湯金榮, 張彩虹, EI THINZAR SOE, 梁革梅,2*

(1.中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193; 2.中國農業科學院西部農業研究中心, 昌吉 831100)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)高度保守,在細胞增殖、分化和遷移等過程中發揮著重要作用,還參與細胞對環境的應激適應、炎癥反應、抗逆性等多種重要的生理過程[1]。MAPK通過4級磷酸化級聯反應給鄰近的蛋白質傳遞信號[2],主要有4條信號通路,分別為:c-Jun氨基末端激酶途徑(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、蛋白激酶 P38 途徑(protein kinase 38,P38)、細胞外信號調節蛋白激酶途徑(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)和ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)途徑[3]。JNK信號通路是MAPK中的重要通路之一,已有文獻報道昆蟲JNK 在響應殺蟲劑、低溫、外來病原微生物、紫外輻射的應激反應中發揮著重要作用,如:低溫可以誘導激活西花薊馬Frankliniellaoccidentalis體內JNK、P38信號通路,引起應激反應[4];煙粉虱Bemisiatabaci的JNK基因在響應細菌、真菌的脅迫時發揮著重要作用[5];白紋伊蚊Aedesalbopictus的JNK基因響應熱滅活細菌脅迫,且在30 min時表達量達到最大[6];當棉鈴蟲Helicoverpaarmigera受到紫外輻射時,其JNK信號通路被激活并發生一系列的應激反應[7]。而且JNK信號通路還參與昆蟲的發育和免疫反應等,如JNK在果蠅Drosophila的形態發育和免疫反應過程中發揮作用[8];白紋伊蚊幼蟲的JNK基因被干擾后48 h死亡率會顯著增加[9]。

Bt是目前世界上產量最大、應用最廣的生物殺蟲劑。由于Bt殺蟲蛋白具有殺蟲效果好、安全、高效等優點[10-13],Bt殺蟲基因已廣泛用于抗蟲轉基因作物的研制[14],但是靶標害蟲對其也存在一系列的應激與免疫反應,甚至有些靶標害蟲產生了抗性[1,15-21]。因此,明確Bt蛋白殺蟲機制和昆蟲對殺蟲蛋白產生應激反應的作用機制對延長Bt產品的使用壽命具有重要意義。研究表明,小菜蛾Plutellaxylostella中腸Bt殺蟲蛋白受體受位于抗性基因座內的MAPK途徑調控,與敏感品系相比,Bt Cry1Ac抗性品系中MAP4K4基因顯著上調,并反式調控多個抗性基因差異表達[22-25]。

JNK途徑可由多種生物因子或非生物因子激活,昆蟲取食Bt殺蟲蛋白后其免疫系統會產生一系列的應激、免疫反應[26-27]。因此,我們推測JNKs可能參與棉鈴蟲抵御Bt殺蟲蛋白傷害及對其產生抗性的過程。本研究克隆得到兩條棉鈴蟲JNK基因序列,分別命名為HaJNK1、HaJNK2,通過熒光定量PCR分析了HaJNKs的時空表達譜,并比較了棉鈴蟲取食Cry1Ac蛋白后對HaJNKs表達量的影響,以期為進一步揭示棉鈴蟲HaJNKs基因在抵御Bt殺蟲蛋白及對其產生抗性機制中的作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲:棉鈴蟲96S敏感品系,1996年采自河南省新鄉市棉田,在實驗室人工飼養至今,未接觸任何Bt殺蟲蛋白或殺蟲劑。幼蟲用人工飼料飼養,成蟲飼喂10%的糖水[28]。飼養溫度為(27±2)℃,光周期為L∥D=14 h∥10 h,相對濕度為(75±10)%。

供試殺蟲蛋白:Cry1Ac蛋白,購自北京綻諾思特生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1樣品收集

不同組織:選取2日齡的5齡棉鈴蟲90頭,每30頭作為1個重復,共3個重復。幼蟲置于冰上解剖并分別截取以下10種組織:頭、表皮、唾液腺、脂肪體、前腸、中腸、后腸、馬氏管、血淋巴、性腺,取樣后在0.7% NaCl溶液中清洗,濾紙吸干,然后立刻置于1.5 mL離心管中,放入液氮或-80℃保存。

不同發育時期:收集不同發育時期的棉鈴蟲,卵400粒、1齡幼蟲100頭、2齡幼蟲50頭、3齡幼蟲20頭、4齡和5齡幼蟲各10頭、雌蛹、雄蛹、雌成蟲、雄成蟲各10頭為1次重復,每個時期設3次重復。取樣后立刻置于液氮或-80℃保存。

1.2.2RNA提取與cDNA合成

按照說明書用TRIzol試劑提取總RNA,并在NanoDrop 1000(Thermo Fisher)紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和質量,確保A260/A280、A260/A230均在1.8～2.2范圍內,之后用瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。按照HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒說明書合成cDNA第一鏈(南京諾唯贊生物科技股份有限公司),并置于-20℃保存(用于定量的樣品取1 μg RNA用于反轉錄)。

1.2.3HaJNK基因的克隆

根據NCBI數據庫的棉鈴蟲HaJNK序列,利用primer3 plus設計PCR特異性引物(表1),以4齡幼蟲中腸cDNA為模板,進行PCR擴增,體系如下:2 × Phanta Max Master Mix 25 μL,上、下游引物各2 μL,cDNA模板2 μL,超純水 19 μL。反應條件為:95℃預變性3 min;95 ℃變性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸1 min 30 s,35個循環,72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶并純化,而后將純化產物連接到pEASY-Blunt Simple(全式金北京生物技術有限公司)克隆載體上,并轉化至Trans1-T1感受態細胞中,待細胞復蘇后,取200 μL涂在含有氨芐抗生素的培養基上,37℃過夜培養,之后挑取單克隆,菌液PCR驗證后挑取陽性菌液送至深圳華大基因有限公司進行測序。

1.2.4序列分析以及進化樹的構建

利用DNAMAN軟件對測序結果進行拼接并比對,利用NCBI中ORF finder預測開放閱讀框,并翻譯成氨基酸序列。利用ExPaSy(http:∥web.expasy.org/compute_pi)預測HaJNK蛋白的分子量和等電點,Sig-nalP 4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/Sig-nalP/)預測HaJNK的信號肽,NCBI CDD(Conserved Domain Database)預測HaJNK的保守結構域,利用SWISS MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)預測蛋白的三級結構。利用NCBI-Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線搜索得到棉鈴蟲HaJNK的同源蛋白,使用MEGA 7.0軟件鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹。

1.2.5RT-qPCR分析HaJNK的時空表達

基于HaJNK基因序列,用Primer5設計RT-qPCR特異性引物,內參基因為RPS15(基因序列號:AY818611.1)與18S(基因序列號:AB620126.1),合成并進行引物擴增效率檢測(表1)。模板為棉鈴蟲不同發育時期、不同組織的cDNA,利用ABI QuantStudio 6(Thermo Fisher)高產率實時熒光定量PCR儀擴增。反應總體系20 μL:2×TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,超純水為7.2 μL,cDNA模板2 μL。反應條件參照TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒的說明書:95℃預變性30 s;95℃變性10 s,60℃退火/延伸20 s,40個循環;采用2-ΔΔCt法分析HaJNK基因的相對表達量[29]。

表1 本研究所用引物

1.2.6取食Cry1Ac對HaJNKs基因表達量的影響

用20、40、80 ng/μL Cry1Ac分別處理4齡棉鈴蟲,分別在0、3、6、12、24、48 h時取樣,每次取10頭為1個重復，每個時間段3個生物學重復。進行熒光定量PCR檢測HaJNKs基因的變化。

1.3 數據分析

利用SPSS Statistics 26軟件對試驗數據進行分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析不同發育時期、組織的表達量之間以及Cry1Ac處理前后HaJNK表達量的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 HaJNK基因克隆和生物信息學分析

經克隆及多次重復測序得到兩條HaJNK序列,分別命名為HaJNK1、HaJNK2,其開放閱讀框分別為1 191 bp和1 143 bp,分別編碼396、380個氨基酸。部分序列對比如圖1所示。預測HaJNK1和HaJNK2的蛋白分子量分別為45.07 kD和43.32 kD,等電點為6.49、6.06。HaJNK1與HaJNK2均存在于細胞質中,無信號肽。HaJNK1與HaJNK2蛋白的三維結構存在差異,HaJNK1在起始位置多兩個發夾結構(圖2)。

圖1 棉鈴蟲HaJNKs的部分DNA序列與氨基酸序列

圖2 預測的棉鈴蟲HaJNKs蛋白三維結構

2.2 HaJNK進化樹分析

序列對比結果顯示，棉鈴蟲的HaJNK與鱗翅目昆蟲的同源性都較高,其中HaJNK1與黏蟲聚為一支,親緣關系較近, HaJNK2與家蠶聚為一支,它們的親緣關系較近(圖3)。

圖3 基于HaJNK氨基酸序列采用鄰接法構建棉鈴蟲和相關昆蟲的系統進化樹

2.3 HaJNK的時空表達譜

2個HaJNK基因在棉鈴蟲的各個發育階段都有表達,不同發育階段的表達量存在顯著差異(HaJNK1:F=47.81,P=0.001;HaJNK2:F=38.34,P=0.001)。HaJNK1和HaJNK2均在卵期表達量最高,其次HaJNK1在雌成蟲、2齡幼蟲中表達量較高,HaJNK2表達量較高的是雌成蟲和1齡幼蟲(圖4)。

圖4 HaJNK基因在棉鈴蟲不同發育時期的表達量

2個HaJNK基因在棉鈴蟲的不同組織中均有表達,不同組織中的表達量存在顯著差異(HaJNK1:F=31.39,P=0.001;HaJNK2:F=20.88,P=0.001)。其中HaJNK1在性腺中表達量最高,其次是唾液腺,頭和表皮中也有較高的表達量;HaJNK2在頭部表達量最高,顯著高于其他組織(圖5)。

圖5 HaJNK基因在棉鈴蟲不同組織的表達量

2.4 取食Cry1Ac后HaJNKs表達量變化

取食相同濃度Cry1Ac不同時間的棉鈴蟲中HaJNKs的表達量存在顯著差異，P值均小于0.05。隨時間的變化HaJNK1和HaJNK2的表達量都呈現先升高后降低的趨勢(圖6)。HaJNK1和HaJNK2的表達量分別在20 ng/μL的Cry1Ac處理6 h、40 ng/μL的Cry1Ac處理12 h和80 ng/μL的Cry1Ac處理12 h后達到最高;HaJNK1和HaJNK2均在80 ng/μL Cry1Ac處理12 h時表達量達到最高。

圖6 不同濃度Cry1Ac脅迫處理后棉鈴蟲HaJNKs表達量的變化

3 結論與討論

MAPK信號通路在調節生物生長、發育、繁殖過程中起到至關重要的作用,也是免疫反應中的關鍵因子,JNK作為其中一種重要通路發揮的作用不可小覷[6]。已有報道表明JNK在昆蟲抵御低溫、紫外、外來病原微生物脅迫過程中起到了重要作用。本文利用1對引物克隆棉鈴蟲的HaJNK基因,通過大量樣本測序發現,除了已經被鑒定過的HaJNK1之外,還發現HaJNK2基因,同時兩個HaJNK基因還存在不同的剪切本。經過序列比對,發現棉鈴蟲HaJNK2與HaJNK1序列一致性達98.77%,Query Cover為92.00%。經生物信息學分析發現兩個HaJNK在起始位置相差16個氨基酸(圖1b),蛋白三維結構預測發現,這16個氨基酸編碼的蛋白質折疊成為2個發夾結構(圖2a)。由于前人研究發現激酶的磷酸化會受到發夾結構的影響,而磷酸化水平會直接影響蛋白質功能[30]。因此,我們推測這可能造成HaJNK1和HaJNK2在棉鈴蟲體內發揮不同的功能。

進化樹分析結果表明,棉鈴蟲HaJNK1與二化螟、家蠶進化為同一支,再與棉鈴蟲HaJNK2聚為一支,它們在親緣關系上較近。因此,可能與其他鱗翅目昆蟲的JNK基因存在類似的功能,參與抵御外來病原微生物等的應激及免疫反應。時空表達譜分析表明HaJNKs在棉鈴蟲不同組織、不同齡期均有表達,說明HaJNK存在于棉鈴蟲的整個生命過程中,可能參與生物體的生長、發育、繁殖等過程。隨著棉鈴蟲的生長發育HaJNKs的表達量呈現出先高后低的趨勢,HaJNKs在卵期高表達,顯著高于其他發育時期,HaJNK1在性腺中表達量最高,其次是唾液腺,HaJNK2在頭部表達量最高,其次是性腺。報道顯示,果蠅卵期JNK高表達可能是因為JNK通路參與卵的形成,并在卵泡細胞和其他上皮細胞的形態發生過程中起到重要作用[31];棉鈴蟲頭部HaJNK表達量高可能是由于復眼視網膜細胞是昆蟲感受外界光刺激的主要場所,HaJNK將外界光刺激的胞外信號轉導至胞內,因此含有復眼的頭部HaJNK高表達[7]。我們推測HaJNK基因在棉鈴蟲各發育時期、組織中發揮著重要的功能,除參與卵形成、感受光刺激等功能外,還可能參與性別分化[32],且兩種HaJNK基因在不同的組織中發揮的功能有所不同。

棉鈴蟲受到Cry1Ac脅迫誘導后HaJNKs的表達量呈現出先升高后降低的趨勢。低濃度(20 ng/μL)Cry1Ac處理6 h后,HaJNK1和HaJNK2表達量達到最高,分別為對照組棉鈴蟲的2.23倍、2.39倍;高濃度(40 ng/μL、80 ng/μL)Cry1Ac處理12 h后,HaJNK1和HaJNK2表達量達到最高,其中80 ng/μL處理分別為對照組棉鈴蟲的3.32倍、2.71倍。這與其他昆蟲中的報道類似,經過Cry蛋白處理后亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis的MAPKs基因有明顯的上調現象[33],推測受到Cry蛋白的脅迫后引起了MAPK通路的免疫反應。煙粉虱被病原菌侵染后JNK的mRNA水平與蛋白磷酸化水平顯著升高,說明JNK信號通路在煙粉虱抵抗病原菌侵染過程中起到重要作用[5];JNK信號通路被果蠅免疫反應中的LSP所激活,參與果蠅的免疫反應[8]。而且,棉鈴蟲取食Cry1Ac后HaJNK表達量的升高,也可能激活MAPK通路,通過反式調控棉鈴蟲中腸上相關Bt受體蛋白基因的表達,降低受體蛋白與Bt蛋白的結合,從而減少對棉鈴蟲的為害[34-35]。關于HaJNK在Cry1Ac對棉鈴蟲的毒力過程中的作用,后續我們將進一步探索研究。