調控線粒體鈣離子攝入蛋白1表達對血管內皮細胞缺氧/復氧損傷的影響及機制研究

史喜德，陳江煒，張旭濤，李亞娟，李飛，劉峰舟

目前，內皮細胞缺血/再灌注損傷的作用機制尚不十分清楚。微循環損傷誘發的炎癥反應是缺血/再灌注損傷的主要原因，可導致多種血管疾病進展[1-2]。研究表明，內皮細胞損傷是缺血/再灌注損傷的關鍵環節[3-5]，當缺血組織恢復血流再灌注時，微血管內皮細胞首先受到損傷。線粒體鈣離子攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）是線粒體鈣穩態的重要調節蛋白，其可參與多種疾病的發生發展[6-8]。既往研究證實，內皮細胞與缺血/再灌注損傷密切相關[9-10]，線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為內皮細胞損傷的關鍵因素可參與細胞氧化應激和炎癥反應等多種生理病理過程[11]。既往研究表明，在Hela細胞和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中沉默MICU1表達可明顯增加ROS生成[12-13]。基于此，本研究采用缺氧培養箱構建內皮細胞缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型，并利用MICU1腺病毒和siRNA干預內皮細胞H/R損傷模型MICU1的表達，旨在探討調控MICU1表達對內皮細胞H/R損傷的影響及可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2021年12月至2022年7月。

1.2 實驗試劑與儀器 HUVECs和MICU1腺病毒來自西京醫院心內科實驗室，siRNA由北京擎科生物科技有限公司合成，Lipofectamine 2000轉染試劑、Trizol試劑、高糖DMEM培養基及胰蛋白酶消化液購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自生工生物工程（上海）股份有限公司，反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購自西安晶彩生物科技有限公司，白介素6（interleukin 6，IL-6）ELISA試劑盒和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）ELISA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，超敏ECL化學發光試劑盒和PVDF膜購自美國密理博公司，羊多抗MICU1抗體（ab-190114）、兔多抗NF-κB p65抗體（AF0246）、兔單抗β-actin抗體（AF5003）、驢抗羊二抗（A0181）、羊抗兔二抗（A0208）購自上海碧云天生物技術有限公司，Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒和DHE-ROS檢測試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司，ROS清除劑N，N'-二甲基硫脲（N，N'-dimethylthiourea，DMTU）購自北京百奧萊博科技有限公司，引物合成由西安擎科生物公司完成；實時熒光定量PCR檢測系統購自美國伯樂公司，細胞培養箱購自美國賽默飛公司，NBS Galaxy48R二氧化碳培養箱購自德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 （1）將HUVECs分成對照組和模型組，對照組細胞正常培養，不加任何干預；模型組細胞構建H/R損傷模型。檢測各組MICU1 mRNA、蛋白。（2）將HUVECs分成對照組、siCtrl+模型組及siMICU1+模型組，對照組細胞正常培養，不加任何干預；siCtrl+模型組細胞轉染對照小干擾RNA后構建H/R損傷模型；siMICU1+模型組細胞轉染MICU1小干擾RNA后構建H/R損傷模型。檢測各組MICU1蛋白、ROS、NF-κB p65蛋白、炎性因子（TNF-α和IL-6）。（3）將HUVECs分成對照組、Ad-Ctrl+模型組及Ad-MICU1+模型組，對照組細胞正常培養，不加任何干預；Ad-Ctrl+模型組細胞感染對照腺病毒后構建H/R損傷模型；Ad-MICU1+模型組細胞感染MICU1腺病毒后構建H/R損傷模型。檢測各組MICU1蛋白、ROS、NF-κB p65蛋白、炎性因子（TNF-α和IL-6）及細胞凋亡率。（4）將HUVECs分成siCtrl+模型組、siMICU1+模型組及siMICU1+DMTU+模型組，siCtrl+模型組細胞轉染對照小干擾RNA后構建H/R損傷模型；siMICU1+模型組細胞轉染MICU1小干擾RNA后構建H/R損傷模型；siMICU1+DMTU+模型組細胞轉染MICU1小干擾RNA后加入ROS清除劑DMTU，并構建H/R損傷模型。檢測各組NF-κB p65蛋白、炎性因子（TNF-α和IL-6）及細胞凋亡率。

1.3.2 細胞培養 使用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基在37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱中培養HUVECs。

1.3.3 H/R損傷模型構建 將處于對數生長期的HUVECs鋪種于六孔板，每孔細胞數約為2.5×105個，待細胞密度達到80%左右時，更換無血清DMEM培養基，并將細胞轉移至缺氧培養箱（氣體成分：94% N2，1% O2，5% CO2）于37 ℃恒溫培養24 h，之后將細胞轉移至普通細胞培養箱，復氧6 h，構建H/R損傷模型。

1.3.4 病毒轉染 將處于對數生長期的HUVECs鋪種于六孔板，每孔細胞數約為2.5×105個。待細胞密度達到80%左右時進行病毒轉染。按照感染復數為50的條件稀釋轉染病毒，每孔轉染1 ml病毒稀釋液（含20 μl病毒和980 μl無血清DMEM培養基），6 h后補加1 ml含15%胎牛血清的DMEM完全培養基繼續培養，24 h后更換培養基。

1.3.5 采用實時熒光定量PCR檢測MICU1 mRNA細胞經胰蛋白酶消化液消化、離心，采用Trizol試劑提取總RNA，采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR檢測。將β-actin作為內參基因，MICU1正向引物序列：5'-GGACAGTGGCTAAAGTGGAGC-3'，反向引物序列：5'-CATGAGGCGAGTGAAACCC-3'；β-actin正向引物序列：5'-ACACTGTGCCCATCTACG-3'，反向引物序列：5'-TGTCACGCACGATTTCC-3'。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環；72 ℃ 5 min。每個樣品設3個復孔，采用2-ΔΔCt法計算MICU1 mRNA表達情況。實驗獨立重復3次。

1.3.6 采用Western blot法檢測MICU1蛋白、NF-κB p65蛋白 采用胰蛋白酶消化液常規消化細胞并進行離心處理，采用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量法測定細胞總蛋白濃度后將其煮沸15 min至變性。采用10% SDS-PAGE分離蛋白，在恒定電壓（100 V）條件下進行轉膜，采用5%脫脂奶粉于室溫條件下封閉1 h，加入一抗于4 ℃孵育過夜，采用TBST緩沖液洗膜3次，加入二抗于室溫條件下孵育1 h，采用TBST緩沖液洗膜3次，采用超敏ECL化學發光試劑盒檢測MICU1蛋白、NF-κB p65蛋白。實驗獨立重復3次。

1.3.7 采用流式細胞術檢測ROS 細胞經過干預處理后，使用PBS清洗，之后加入10 μmol/L DHE熒光染料，于37 ℃細胞培養箱中孵育30 min，采用PBS清洗3次后用無血清培養基重懸細胞，采用流式細胞儀于488 nm激發光、590 nm發射光波長下檢測ROS。實驗獨立重復3次。

1.3.8 采用ELISA檢測TNF-α、IL-6 將細胞移入15 ml離心管中，500×g離心5 min，留取上清液，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.9 采用流式細胞術檢測細胞凋亡率 采用不含EDTA的胰蛋白酶消化液常規消化六孔板中的內皮細胞，然后采用預冷的PBS洗滌細胞2次，加400 μl Binding Buffer輕輕重懸細胞，細胞濃度調整為1×106個/ml。在細胞懸液中加入5 μl Annexin V-PE，室溫避光孵育15 min后加入10 μl 7-AAD染料，輕柔混勻，于4 ℃避光孵育5 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗獨立重復3次。

1.4 統計學方法 使用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內皮細胞H/R損傷模型MICU1表達情況 模型組MICU1 mRNA、蛋白低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 對照組和模型組MICU1蛋白表達的SDS-PAGE圖Figure 1 SDS-PAGE map of MICU1 protein expression in control group and model group

表1 對照組和模型組MICU1 mRNA、蛋白比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of MICU1 mRNA and protein between control group and model group

表1 對照組和模型組MICU1 mRNA、蛋白比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of MICU1 mRNA and protein between control group and model group

注：MICU1=線粒體鈣離子攝入蛋白1

組別 MICU1 mRNA MICU1蛋白對照組 1.00±0.08 1.00±0.05模型組 0.41±0.10 0.42±0.02 t值 8.430 17.967 P值 0.001 ＜0.001

2.2 沉默MICU1表達對內皮細胞H/R損傷模型的影響

2.2.1 沉默MICU1表達對內皮細胞H/R損傷模型MICU1蛋白、ROS的影響 對照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。siCtrl+模型組MICU1蛋白低于對照組，ROS高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；siMICU1+模型組MICU1蛋白低于siCtrl+模型組，ROS高于siCtrl+模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 流式細胞術檢測對照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組ROSFigure 2 ROS detected by flow cytometry in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

表2 對照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of MICU1 protein and ROS in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

表2 對照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of MICU1 protein and ROS in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

注：ROS=活性氧；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與siCtrl+模型組比較，P＜0.05

組別 MICU1蛋白 ROS對照組 1.00±0.05 9.2±3.7 siCtrl+模型組 0.41±0.04a 27.8±3.2a siMICU1+模型組 0.21±0.04b 48.1±2.4b F值 297.710 113.408 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2.2 沉默MICU1表達對內皮細胞H/R損傷模型NF-κB p65蛋白、炎性因子的影響 對照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。siCtrl+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6高于siCtrl+模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 對照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of NF-κB p65 protein，TNF-α and IL-6 in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

表3 對照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of NF-κB p65 protein，TNF-α and IL-6 in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-6=白介素6；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與siCtrl+模型組比較，P＜0.05

組別 NF-κB p65蛋白 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml）對照組 1.00±0.07 219±24 160±19 siCtrl+模型組 2.03±0.25a 465±28a 440±18a siMICU1+模型組 3.20±0.20b 862±29b 695±30b F值 100.739 437.589 419.720 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 上調MICU1表達對內皮細胞H/R損傷模型的影響

2.3.1 上調MICU1表達對內皮細胞H/R損傷模型MICU1蛋白、ROS的影響 對照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。Ad-Ctrl+模型組MICU1蛋白低于對照組，ROS高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Ad-MICU1+模型組MICU1蛋白高于Ad-Ctrl+模型組，ROS低于Ad-Ctrl+模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4、圖3。

表4 對照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of MICU1 protein and ROS in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

表4 對照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of MICU1 protein and ROS in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與Ad-Ctrl+模型組比較，P＜0.05

組別 MICU1蛋白 ROS對照組 1.00±0.15 8.93±3.00 Ad-Ctrl+模型組 0.38±0.08a 27.80±2.20a Ad-MICU1+模型組 2.07±0.26b 18.57±2.65b F值 69.662 38.332 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖3 流式細胞術檢測對照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組ROSFigure 3 ROS detected by flow cytometry in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

2.3.2 上調MICU1表達對內皮細胞H/R損傷模型NF-κB p65蛋白、炎性因子的影響 對照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。Ad-Ctrl+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Ad-MICU1+H/R組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6低于Ad-Ctrl+模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 對照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of NF-κB p65, TNF-αand IL-6 in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

表5 對照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of NF-κB p65, TNF-αand IL-6 in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與Ad-Ctrl+模型組比較，P＜0.05

組別 NF-κB p65蛋白 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml）對照組 1.00±0.08 192±50 155±25 Ad-Ctrl+模型組 2.17±0.07a 537±50a 443±38a Ad-MICU1+模型組 1.28±0.66b 287±35b 247±38b F值 211.264 45.369 55.940 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3.3 上調MICU1表達對內皮細胞H/R損傷模型細胞凋亡率的影響 對照組細胞凋亡率為（7.367±1.305），Ad-Ctrl+模型組為（26.400±0.819），Ad-MICU1+模型組為（17.533±1.250）。對照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=207.376，P＜0.05）。Ad-Ctrl+模型組細胞凋亡率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Ad-MICU1+模型組細胞凋亡率低于Ad-Ctrl+模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 流式細胞術檢測對照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組細胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate detected by flow cytometry in the control group，Ad-Ctrl+model and Ad-MICU1+model group

2.4 清除ROS對內皮細胞H/R損傷模型的影響

2.4.1 清除ROS對內皮細胞H/R損傷模型NF-κB p65蛋白、炎性因子的影響 siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6高于siCtrl+模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6低于siMICU1+模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表6。

表6 siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 6 Comparison of NF-κB p65 protein，TNF-α and IL-6 in siCtrl+model group，siMICU1+model group and siMICU1+DMTU+model group

表6 siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 6 Comparison of NF-κB p65 protein，TNF-α and IL-6 in siCtrl+model group，siMICU1+model group and siMICU1+DMTU+model group

注：DMTU=N，N'-二甲基硫脲；a表示與siCtrl+模型組比較，P＜0.05；b表示與siMICU1+模型組比較，P＜0.05

IL-6（pg/ml）siCtrl+模型組 1.00±0.09 460±28 437±26 siMICU1+模型組 3.13±0.21a 861±43a 692±33a siMICU1+DMTU+模型組 2.10±0.26b 613±44b 502±28b F值 84.354 81.625 64.004 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 NF-κB p65蛋白 TNF-α（pg/ml）

2.4.2 清除R O S對內皮細胞H/R損傷模型細胞凋亡率的影響 s i C t r l+模型組細胞凋亡率為（2 6.4 3 3±2.4 0 1），s i M I C U 1+模型組為（35.333±2.669），siMICU1+DMTU+模型組為（23.967±2.157）。siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=70.111，P＜0.05）。siMICU1+模型組細胞凋亡率高于siCtrl+模型組，siMICU1+DMTU+模型組細胞凋亡率低于siMICU1+模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 流式細胞術檢測siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組細胞凋亡率Figure 5 Apoptosis rate detected by flow cytometry in the siCtrl+model group，siMICU1+model group and siMICU1+DMTU+model group

3 討論

內皮細胞損傷是缺血/再灌注損傷的關鍵，內皮細胞可通過合成、分泌多種細胞因子（包括一氧化氮、內皮素1、緩激肽、黏附分子）而參與炎癥反應、凝血過程、血管舒張、氧化應激的調控；此外，其還在維持血管生理功能及微循環穩態中發揮著重要作用[14-15]。因此，分析內皮細胞損傷參與缺血/再灌注損傷的機制對心血管疾病的防治具有重要意義。

MICU1是線粒體鈣調控的關鍵分子。既往研究發現，高血壓、動脈粥樣硬化患者動靜脈內皮細胞中MICU1表達水平均明顯降低，提示內皮細胞MICU1可能在心血管疾病進展中發揮了重要作用[16]，本研究結果與其相似。為了進一步明確MICU1在內皮細胞H/R損傷的作用及可能機制，本研究采用siRNA沉默MCIU1表達，結果顯示，siMICU1+模型組TNF-α、IL-6、細胞凋亡率高于siCtrl+模型組；采用MICU1腺病毒上調MICU1表達，結果顯示，Ad-MICU1+模型組TNF-α、IL-6、細胞凋亡率低于Ad-Ctrl+模型組，提示下調MICU1表達可誘導內皮細胞H/R損傷模型發生炎癥反應及細胞凋亡，而上調MICU1表達的作用相反。氧化應激是內皮功能障礙和血管損傷的重要決定因素[17]。內皮細胞ROS作為信號分子可參與調控細胞生命進程，包括細胞生長、增殖、分化，從而改變血管張力、導致血管炎癥及血管重塑，進而影響血管疾病進展[17-18]。既往研究證實，下調MICU1表達可促進內皮細胞ROS的生成[13]，但在H/R條件下，MICU1表達下調是否影響內皮細胞ROS生成尚不十分清楚。本研究結果顯示，siMICU1+模型組ROS高于siCtrl+模型組，Ad-MICU1+模型組ROS低于Ad-Ctrl+模型組，提示在H/R條件下，下調MICU1表達可促進內皮細胞ROS生成，上調MICU1表達可抑制內皮細胞ROS生成。為了明確調控MICU1表達影響內皮細胞炎癥因子釋放、細胞凋亡的具體機制，本研究在下調H/R損傷模型MICU1表達的同時，利用DMTU清除內皮細胞ROS，結果顯示，siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白高于siCtrl+模型組，siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白低于siMICU1+模型組，提示下調MICU1表達可導致依賴ROS的NF-κB通路被激活，進而誘導內皮細胞H/R損傷模型發生炎癥反應及細胞凋亡。

綜上所述，下調MICU1表達可誘導內皮細胞H/R損傷模型發生炎癥反應及細胞凋亡，而上調MICU1表達的作用相反，分析其機制可能與調控MICU1表達可影響依賴ROS的NF-κB通路激活有關。本研究揭示了MICU1參與內皮細胞H/R損傷的潛在分子機制，MICU1有望成為內皮細胞H/R損傷的治療靶點，未來仍有待進行動物實驗進一步證實本研究結論。

作者貢獻：李飛進行文章的構思與設計；史喜德進行研究的實施與可行性分析，撰寫論文；陳江煒、李亞娟進行數據收集、整理和統計學分析；劉峰舟進行結果的分析與解釋；張旭濤進行論文的修訂；李飛、劉峰舟負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。