糞便GeneXpert MTB/RIF檢測在腸結核診斷中的應用價值

劉榮梅 呂子征 馬麗萍 李強 宋艷華 陳紅梅 孔忠順 高孟秋

腸結核是消化道常見疾病之一，也是常見的肺外結核，約占肺外結核的11%[1-2]。腸結核的診斷較為困難，在臨床上需要與克羅恩病、腸道白塞病、腸道淋巴瘤、缺血性腸病、潰瘍性結腸炎等腸道潰瘍性疾病相鑒別，臨床上常因難于明確診斷而延誤治療，造成患者腸狹窄、腸穿孔、感染性休克，甚至死亡。因此，快速的診斷方法對腸結核的早期診斷和治療具有重要意義。

本研究旨在以臨床疑似腸結核患者的糞便為標本，以臨床診斷結果為標準，研究GeneXpert MTB/RIF檢測腸結核的效能，以判斷其對腸結核的診斷價值，為腸結核患者的及時診斷和治療提供實驗室診斷依據。

資料和方法

一、研究資料

1.研究對象：納入2019年1月至2021年12月首都醫科大學附屬北京胸科醫院就診的538例臨床疑似腸結核患者，留取糞便標本進行熒光涂片顯微鏡鏡檢、BACTEC MGIT 960液體快速培養、GeneXpert MTB/RIF檢測，同時對患者進行全血結核感染T細胞斑點試驗、腸鏡及腸黏膜組織病理檢查。

2.納入和排除標準：(1)入選標準：醫院收治的疑似腸結核患者；自愿參加并簽署知情同意書。(2)排除標準：患者不能配合隨訪；不能耐受腸鏡檢查；無自主決定權；拒絕參加試驗。

3.診斷標準：本研究以臨床診斷標準作為診斷標準。臨床診斷標準：(1)典型臨床表現：以中青年患者為主，腹痛、腹瀉(或腹瀉與便秘交替)、體質量下降，伴有發熱和盜汗等結核中毒癥狀，可有右下腹壓痛或右下腹包塊。(2)并發癥：腸梗阻。(3)結腸鏡表現：回盲部潰瘍或結節樣增生、環形潰瘍、回盲瓣受累、瓣口固定開放。通過結腸鏡檢查或手術檢查活檢發現下列一項者可以診斷：①腸壁和腸系膜淋巴結發現干酪樣壞死性肉芽腫；②組織病理切片發現結核分枝桿菌；③病變組織活檢培養結核分枝桿菌陽性；④病變取材后進行動物接種，接種動物出現結核病變。(4)鋇劑灌腸顯示回盲部跳躍征和潰瘍，可有腸管短縮、變形、狹窄。(5)合并活動性肺結核、結核菌素皮膚試驗強陽性、結核感染T細胞斑點試驗陽性。(6)如診斷困難行診斷性抗結核治療2～3個月，結腸鏡下病變明顯好轉或愈合。其中，出現(1)(2)(4)(5)中的2條及以上附加第(6)條可診斷為腸結核；進行腸鏡檢查的患者符合第(3)條可診斷為腸結核。

二、診斷結果

538例疑似腸結核患者經臨床診斷標準診斷，189例診斷為腸結核患者(腸結核組)，其中40例經結腸鏡檢查病理診斷確診，149例依據臨床診斷標準診斷；349例診斷為非腸結核患者(非腸結核組)，包括潰瘍型結腸炎6例，腸道急、慢性感染305例，消化道潰瘍14例，惡性腫瘤11例，克羅恩病7例，肝臟病變6例。

538例疑似腸結核患者中，合并肺結核292例，其中腸結核組102例，非腸結核組190例。102例腸結核合并肺結核的患者中，19例經腸鏡病理確診，51例同時行痰液GeneXpert MTB/RIF檢測均為陰性，其余32例未行痰液GeneXpert MTB/RIF檢測。190例非腸結核合并肺結核的患者中，171例糞便標本GeneXpert MTB/RIF檢測陽性；對其追加進行痰液GeneXpert MTB/RIF檢測，其中152例痰液GeneXpert MTB/RIF檢測陽性，9例檢測陰性，10例患者因無痰未進行該項檢測。

三、研究方法

1.糞便GeneXpert MTB/RIF檢測：稱取0.6 g待檢測的糞便標本，加入2 ml生理鹽水、2 ml樣本處理液(NaOH+異丙醇溶液)及約10顆玻璃珠，多次短暫渦旋振蕩(<10 s/次)以充分混勻，室溫下孵育30 min，將孵育后的混合物通過帶有玻璃棉的注射器過濾，過濾后的產物置于1個另外的干凈容器中，使用新的移液管，吸取2 ml過濾后的樣本加入試劑匣，進行GeneXpert MTB/RIF檢測。

2.糞便熒光涂片顯微鏡鏡檢：采取直接涂片法進行檢測，取糞便標本與生理鹽水混勻后，充分振蕩使之成為混懸液；取沉淀行涂片、固定、染色，于顯微鏡下查找結核分枝桿菌并計數，整個過程嚴格按照《臨床技術操作規范：結核病分冊》[3]進行。

3.糞便BACTEC MGIT 960 液體培養：取糞便標本與生理鹽水混勻后，充分振蕩使之成為混懸液；加入標本體積1.5～2倍的處理液(3%NaOH+1.47%檸檬酸三鈉+1%乙酰半胱氨酸溶液)，充分振蕩后靜置15 min。再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至 50 ml，顛倒混勻后在4 ℃條件下，3000×g離心15 min，棄去上清液，加入 2 ml PBS 重懸，取 500 μl接種至BACTEC MGIT 960結核分枝桿菌液體培養系統。液體培養嚴格按照操作說明書進行。標本經抗酸涂片染色顯示陽性，革蘭染色無雜菌生長且經結核分枝桿菌MPB64膠體金檢測為陽性，即確定為結核分枝桿菌生長。

四、統計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行統計學處理。計數資料以“例數”和“百分率(%)”描述，計量資料呈偏態分布時以“中位數(四分位數)[M(Q1，Q3)]”描述。以臨床診斷結果為標準，計算GeneXpert MTB/RIF檢測、熒光涂片顯微鏡鏡檢及BACTEC MGIT 960液體快速培養診斷腸結核的效能，同時繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，比較上述各種方法診斷腸結核的效能。

結 果

一、兩組患者一般資料

538例患者中，男性343例，女性195例；年齡9～92歲，M(Q1，Q3)為49(30，65)歲。腸結核組患者189例，男性132例，女性57例；年齡15～92歲，M(Q1，Q3)為50(30.5，67)歲。非腸結核組患者349例，男性211例，女性138例；年齡9～91歲，M(Q1，Q3)為44(29，57)歲。

二、不同方法對腸結核診斷效能的評價

以臨床診斷結果為標準，采用糞便標本進行3種方法的檢測，其中GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度最高，特異度最低；熒光涂片顯微鏡鏡檢敏感度最低，特異度最高。見表1。

表1 三種方法檢測腸結核效能的比較

通過繪制ROC曲線比較3種檢測方法的診斷效能，GeneXpert MTB/RIF檢測、熒光涂片顯微鏡鏡檢、BACTEC MGIT 960液體快速培養診斷腸結核的ROC曲線下面積分別為0.641、0.581和0.564。見圖1。

圖1 各項檢測診斷腸結核的ROC曲線

三、非腸結核患者糞便標本GeneXpert MTB/RIF檢測結果陽性病例分析

349例非腸結核患者中，171例糞便標本GeneXpert MTB/RIF檢測結果為陽性，該171例患者因伴有腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等消化道癥狀就診，其最終診斷均包括肺結核，其中56例合并糖尿病。根據本研究的臨床診斷標準，該171例患者排除腸結核的診斷。對其進行痰液GeneXpert MTB/RIF檢測，其中152例痰液GeneXpert MTB/RIF檢測結果為陽性，9例為陰性，10例患者因無痰未進行該項檢測。

討 論

根據目前的研究，引起腹部結核的原因可能為原發性感染，也可能為來自原發性肺部病灶的繼發性感染[4]。具體原因包括：(1)含結核分枝桿菌的腸內容物在回盲部停留較久，腸黏膜感染機會增加；(2)回盲部有豐富的淋巴組織，易受結核分枝桿菌侵犯；(3)機體免疫力下降時隱性結核感染進展為腸結核。腸結核由于其診斷方式有限，因此確診存在一定難度。臨床上腸結核易與克羅恩病、腸道白塞病、腸道淋巴瘤、缺血性腸病、潰瘍性結腸炎等腸道潰瘍性疾病相混淆，有時鑒別起來非常困難，甚至需要手術病理來協助診斷。有時憑借內鏡下表現乃至組織病理學仍不能確診，如腸結核與克羅恩病的誤診率達50%～70%[5-7]。傳統的檢測方法有結核菌素皮膚試驗、抗酸染色等，但均因敏感度和特異度低而不能滿足臨床快速診斷的需求，新近的結核感染T細胞斑點試驗敏感度不足以支持其用于腸結核的診斷。因此，需要簡單、快速的診斷工具，以便盡早開始治療[8]，從而減少腸結核造成的致殘率和病亡率，有助于緩解和控制我國日趨嚴峻的結核病疫情。

既往腸結核的診斷大多憑借結腸鏡及鏡下組織活檢病理結果進行診斷，2017年的一項對腸結核確診患者的回顧性研究中，結腸鏡檢查幫助了77%的患者確診[9]。近年來，分子診斷技術發展迅速，GeneXpert MTB/RIF因具有良好的敏感度、特異度、安全性及時效性而在結核病的臨床診斷中被廣泛使用[8,10]。相關研究提示，GeneXpert MTB/RIF檢測對成年人結核病[11]、兒童結核病[12]及肺外結核[13]有較好的診斷價值。與糞便GeneXpert MTB/RIF檢測相比，結腸鏡檢查為有創檢查，存在檢測禁忌證，同時結腸鏡檢查可能會導致并發癥的發生。Patel和Yagnik[14]研究顯示，84%的腸結核患者拒絕接受結腸鏡檢查和盲回腸活組織檢查等侵入性手術。很多患者因存在禁忌證不能及時進行腸鏡檢查，從而延誤了疾病的診斷及治療。糞便GeneXpert MTB/RIF檢測為無創檢測，無禁忌證，對患者無特殊要求，操作簡便，患者更容易接受，能夠有效縮短診治時間。

本研究采用GeneXpert MTB/RIF檢測技術進行腸結核的診斷，納入538例疑似腸結核患者，經臨床診斷標準診斷，糞便GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度優于熒光涂片顯微鏡鏡檢，同樣優于糞便BACTEC MGIT 960液體快速培養。梅玫等[15]對腸黏膜研磨液行抗酸染色、BACTEC MGIT 960液體快速培養及GeneXpert MTB/RIF檢測，GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度為59.4%，特異度為100.0%。Bellam等[16]對回腸結腸潰瘍患者進行組織GeneXpert MTB/RIF檢測，結果顯示其敏感度為32%(95%CI：14.95%～53.50%)，特異度為100%(95%CI：78.2%～100%)，Talib等[17]的研究顯示，糞便標本GeneXpert MTB/RIF診斷腸結核的敏感度為39.1%，特異度為85.7%。與上述研究相比，本研究敏感度較高，特異度低于既往研究，分析原因可能與兩方面因素有關，一是本研究以臨床診斷為標準，僅129例患者經結腸鏡活檢組織病理學檢查確診，其余患者均經臨床診斷標準進行診斷，存在診斷準確度降低的可能性。二是非腸結核組患者很多合并肺結核，本研究538例疑似腸結核患者中合并肺結核292例，其中腸結核組102例，非腸結核組190例。190例非腸結核合并肺結核的患者中，171例糞便標本GeneXpert MTB/RIF檢測結果為陽性。肺結核患者糞便GeneXpert MTB/RIF檢測陽性可能導致診斷受到干擾。因此，針對肺結核患者出現腹部癥狀，為明確患者是否存在腸結核，建議條件允許下完善結腸鏡檢查，明確是否存在腸道器質性病變。如患者因存在結腸鏡檢查的禁忌證無法進行檢查，臨床醫生在缺乏細菌學診斷證據時可進行糞便GeneXpert MTB/RIF檢測，結合患者影像學檢查等綜合分析做出診斷。此外，本研究GeneXpert MTB/RIF檢測的特異度較低，然而熒光涂片顯微鏡鏡檢及培養法的特異度卻比較高，分析原因為GeneXpert MTB/RIF檢測針對的是結核分枝桿菌的DNA片段，熒光涂片法及培養法檢測的是結核分枝桿菌。患者將痰液吞咽入胃部，呼吸道的結核分枝桿菌經消化道排出體外，結核分枝桿菌在消化液的作用下，糞便中僅殘存結核分枝桿菌的DNA片段，因此糞便標本的GeneXpert MTB/RIF檢測結果為陽性，而熒光涂片顯微鏡鏡檢法及培養法檢測結果均為陰性。如患者腸道存在病變，結核分枝桿菌自病變部位排出體外，未經歷多種消化液的消化作用，更容易出現熒光涂片法及培養法檢測陽性，所以糞便熒光涂片顯微鏡鏡檢法及培養法檢測陽性更傾向于腸結核的診斷。

本研究針對非腸結核患者中171例糞便標本GeneXpert MTB/RIF檢測陽性患者進一步分析發現，該171例患者均為肺結核患者，其中56例合并糖尿病。對該171例患者進一步行痰液GeneXpert MTB/RIF檢測，其中152例痰液GeneXpert MTB/RIF檢測結果為陽性，9例為陰性，10例患者因無痰未進行該項檢測。因此，非腸結核患者糞便標本GeneXpert MTB/RIF檢測陽性與患者患有肺結核有關，考慮患者為痰液吞咽導致糞便GeneXpert MTB/RIF檢測陽性。綜上，建議臨床醫生診斷腸結核時需結合患者病史、臨床表現、腸鏡檢查、病理結果及糞便標本GeneXpert MTB/RIF檢測結果等進行綜合判斷。

臨床工作中，不能除外來源于呼吸道的結核分枝桿菌的DNA片段(患者將痰液吞咽入胃部)引起糞便標本GeneXpert MTB/RIF檢測結果為陽性，尤其對于肺結核合并腸結核的患者。本研究中，腸結核患者為189例，其中包含102例腸結核合并肺結核患者，該102例患者中19例經腸鏡病理確診，51例同時行痰液GeneXpert MTB/RIF檢測，結果均為陰性，可能與患者通過呼吸道排菌量少有關，其余32例未行痰液GeneXpert MTB/RIF檢測。本研究不足之處在于未完善該32例患者的痰液檢查，以排除呼吸道結核分枝桿菌DNA片段對本研究結果的影響，需要在今后的工作中進一步完善。

綜上所述，采用糞便標本行GeneXpert MTB/RIF檢測操作簡便，敏感度高，可有效提高患者診斷的準確度，縮短診斷時間，減少腸結核的致殘率和病亡率。建議臨床醫生診斷腸結核時結合患者病史、臨床表現、病理結果、糞便標本GeneXpert MTB/RIF檢測結果及患者的治療效果等進行綜合判斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻劉榮梅：實施研究、論文撰寫和修改；呂子征、馬麗萍、李強、宋艷華、陳紅梅、孔忠順：患者納入及標本收集；高孟秋：實施研究、論文修改