不同產地兔眼藍莓花青素含量分析

粱光麗，和玉鳳，李南，呂燕，和春龍，穆洪瑞

（1.云南商測質量檢驗技術服務有限責任公司，云南 昆明 650217；2.昆明市糧油飼料產品質量檢驗中心，云南 昆明 650106；3.云南聯大科技產業有限責任公司，云南 昆明 650500）

藍莓（Vaccinium Spp.），又名藍漿果、越橘、都柿、篤斯等，為杜鵑花科越橘屬多年生常綠或落葉灌木[1]，原產于加拿大東部和美國東北部，現在中國的山東半島、大興安嶺、小興安嶺、四川盆地、滇西、湖北等地區均有種植[2]。藍莓果實為漿果，富含氨基酸類[3]、有機酸類[4]、糖類[5]、黃酮類[6]、多酚類[7]、礦物質類[8]等營養成分。

藍莓中的花青素是一類天然的水溶性色素，具有抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗炎、抑菌、預防肥胖、保護心血管、降血糖、改善視力、提高認知能力、預防老年癡呆、預防癌癥、調節腸道菌群等活性作用[9-11]，所以藍莓廣泛應用在食品、醫藥、保健品、化妝品等領域。文章以云南省不同地區的藍莓為研究對象，在探討不同區域藍莓中花青素含量差異的同時，也可以為今后藍莓的種植和深加工提供數據支持[12]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

產地及來源見表1。新鮮兔眼藍莓，乙腈、無水乙醇、甲醇、甲酸均為色譜純，鹽酸（HCl）：優級純；標準品：飛燕草色素（純度≥95.0%）、矢車菊色素（純度≥98.0%）、芍藥色素（純度≥97.6%）購自國藥集團化學試劑有限公司。Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（PDA檢測器，Version 41Empour工作站），美國Waters公司；UPT-II-5/10/20T超純水機，西安優普；OSB-2200 220V油浴鍋，上海愛朗儀器有限公司；DK3000D數碼超聲波清洗機，深圳市德康洗凈電器有限公司；電子天平，萬分之一，BSM-220.4（220 g；0.0001g），上海卓精電子科技有限公司。

表1 兔眼藍莓產地來源

1.2 試驗方法

采用四分法分取樣品，取約100 g于勻漿機中勻漿，在-18℃條件下保存，備用。稱取樣品5 g置于50 mL具塞比色管中，加入提取液至刻度，定容，搖勻，常溫下超聲提取40 min，取出，油浴鍋（100℃）中水解90 min，取出后冷卻至常溫，用提取液定容至25 mL，搖勻，靜置30 min，取上清液，用0.22 μm微孔水相濾膜過濾，裝瓶上機測定。樣品制備好后，在4℃條件下，保存時間不超過3 d。

1.3 條件的優化

1.3.1 儀器條件的選擇

色譜柱：C18/PFP柱100 mm×2.1 mm×2.7 μm；流動相A為20 mmol乙酸銨溶液，流動相B為乙腈溶液，洗脫梯度為0～0.83 min，95%A，5%B；0.83～1.95 min，65%A，35%B；1.95～2.81 min，100%B；2.81～5.84 min，95%A，5%B；檢測波長：254 nm；柱溫：35℃；進樣量：2 μL；流速：0.3 mL·min-1。

1.3.2 提取溫度和時間

將油浴溫度設為固定值95℃，從40 min到120 min每間隔10 min（9個時間段）對比測定花青素含量，同理將油浴時間固定在90 min，80~120℃每間隔10℃增加油浴溫度，通過對比花青素含量的變化選擇最優的提取溫度和時間。

1.3.3 提取液的選擇及花青素含量測定

在提取液選擇方面，固定油浴溫度100℃和油浴時間90 min，以40%、50%、60%、70%、80%的酸性乙醇溶液為提取劑測定的花青素含量。

2 結果與分析

2.1 方法優化結果

相較于傳統的液相色譜法，采用UPLC法，飛燕草色素、矢車菊色素和芍藥色素3種色素均能在3 min內全部出峰，盡管分離效果未完全達到基線，但對比相關同類UPLC法，出峰時間是同類方法的1/2，大大縮短了花青素的分析時間，大幅度提高了花青素分析工作的工作效率。

固定最佳提取時間90 min，隨油浴溫度的升高，80～90℃花青素提取效率顯著升高，90～110℃趨于平緩，110～120℃逐漸降低，發現提取效率逐漸升高而后降低，過高的溫度（大于110℃）對花青素提取不利。固定100℃，隨著提取時間的增加，提取效率則呈拋物線趨勢變化。所以在藍莓花青素提取的前處理水解步驟上，選擇用100℃油浴90 min作為最終的油浴條件。

針對上述不同比例提取液，提取效率則是呈先上升后下降的趨勢，乙醇濃度在50%的時候提取效率最佳，即無水乙醇∶水∶鹽酸=2∶1∶1（體積比），即取無水乙醇200 mL、水100 mL和鹽酸100 mL。

2.2 線性方程的建立

分別準確稱取飛燕草色素（Delphinidin）、矢車菊色素（Cyanidin）、芍藥色素（Peonidin）標準品5.0 mg用10%鹽酸甲醇溶液溶解并分別定容至10 mL容量瓶中，得到500 mg·L-1的單標儲備液，將單一標準儲備液進行混合后，用10%鹽酸甲醇溶液作為溶劑，并分別配成1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100.0 mg·L-1、200.0 mg·L-1的花青素混合標準使用液，對7個質量濃度水平的系列混合標準溶液進行測定，以各組分的峰面積（y）為縱坐標，對應的質量濃度（x，mg·L-1）為橫坐標繪制標準曲線。從表2可見，6種花青素標液在一定質量濃度范圍內具有良好的線性關系，線性范圍廣，相關系數（r）為0.9992～0.9998。

表2 花青素標液的線性方程及相關系數

2.3 色素含量分析

從圖1可以看出，在兔眼藍莓中花青素含量較為豐富，按色素類型分析呈現規律是飛燕草色素＞矢車菊色素＞芍藥色素，其中飛燕草色素含量在1141～1893 mg·kg-1；矢車菊色素含量在203～529 mg·kg-1，芍藥色素含量在117～376 mg·kg-1，飛燕草色素含量是矢車菊色素含量的3.5～5.7倍；飛燕草色素含量是芍藥色素含量的3.7～10.0倍。

圖1 云南5個地區兔眼藍莓花青素含量

按地區類別分析，花青素總含量為麗江＞官渡＞玉溪＞楚雄＞紅河、矢車菊色素含量為麗江＞官渡＞玉溪＞楚雄＞紅河；飛燕草色素含量為麗江＞官渡＞玉溪＞紅河＞楚雄；芍藥色素含量為官渡＞玉溪＞楚雄＞麗江＞紅河。

3 結論

不同產地兔眼藍莓花青素含量存在較大的差異，可能是受不同氣候和水地文條件影響。云南地處低緯度的云貴高原地區，由于地勢北高南低，大大地加劇了因緯度而造成的氣候差異。麗江取樣點處于云南省的滇西北高原，屬寒帶型氣候，境內水利資源豐富，動植物種類繁多，昆明、楚雄和玉溪取樣點處于滇中高原，屬溫帶型氣候，四季如春，遇雨成冬；紅河取樣點處于滇南地區，屬亞熱帶季風氣候區，長夏無冬，一雨成秋。溫差與花青素含量可成正比關系，建議在藍莓種植的選址上可依據溫差的大小進行甄選。