基于可培養技術的中國家用洗衣機中真菌多樣性研究

曹運奕 張晶晶 高源 陳劍 康佳麗 姚粟

摘 要：本文通過可培養方法分析中國家用洗衣機中的真菌多樣性，采用不同培養基對洗衣機不同位置的真菌進行分離，通過序列分析進行鑒定。結果表明從14臺洗衣機的57個樣品中共分離獲得真菌253株，涵蓋36個屬。洗衣機中優勢真菌主要有青霉屬（Penicillium）、枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、紫霉屬（Purpureocillium）等。研究結果為洗衣機中具有致味、致污、致病和抗逆功能的特征微生物的定向篩選、抗菌抑菌試驗的開展以及作用機制的研究奠定了基礎。

關鍵詞：洗衣機，真菌多樣性，可培養方法

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.05.037

0 引 言

洗衣機是現代家庭必不可少的家用電器，保有量逐年增加[1]。在全球倡導“健康環保”大背景下，疊加新冠疫情影響，消費者健康需求不斷升級，“健康洗護”功能開發成為行業提速發展的主賽道[2-4]。由于洗衣機存在內環境潮濕、內筒和外筒夾層存在大量污垢、消毒管理頻率低等問題，造成洗衣機內部微生物的大量滋生，引起衣物的二次污染，甚至成為致病微生物傳播的載體，進而增加人們感染疾病的風險[5-7]。圍繞洗衣機長時間使用存在的潛在微生物污染問題，全面開展家用洗衣機微生物群落狀況調研，將為推動洗衣機抗除菌技術實現專業化、細分化升級，構建科學、健康的洗護生態環境奠定基礎[8，9]。

目前，平板培養法仍然是研究洗衣機內微生物的主要方法。Jacksch等人[10]采集了洗衣機洗滌劑抽屜和門封圈樣品，發現洗衣機內平均生物量為2.1±1.0×104 CFU/cm2，門封圈頂部的生物量為11.1±9.2×101 CFU/cm2。Gattlen等人研究表明，以培養法分離出的真菌達上百種，包括近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis），曲霉屬（Aspergillus），枝孢菌屬（Cladosporium），膠紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa）等[11，12]。李炎等人[13]研究發現115份洗衣機洗滌水水樣中真菌菌落總數平均為2.3×102CFU/mL。Tischner Z等[14]人對來自匈牙利的61臺洗衣機的門封圈、料盒（洗衣粉、柔順劑）開展真菌的分離研究，共分離得到71株真菌，其中32株屬于酵母菌，39株屬于絲狀真菌，枝孢霉屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉菌屬（Penicillium）、紅酵母屬（Rhodotorula）均為優勢分離菌屬。綜上所述，洗衣機內部存在潛在的微生物污染風險，但是目前我國在這方面的研究鮮有報道。

因此，本研究基于可培養技術系統開展了我國家用洗衣機真菌多樣性分析，旨在探究洗衣機內部不同位點的可培養真菌多樣性，分離一批優勢的真菌微生物菌株，為后期定向篩選洗衣機中具有致味、致污、致病和抗逆功能的特征微生物資源奠定基礎，為洗衣機抗菌、抑菌試驗的開展以及抗菌材料的開發提供研究基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

生物安全柜（ESCO AC2-6S1 CLASS II TYPEA 2）；隔水式培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；高速冷凍離心機（5424 R），德國Eppendorf 公司；PCR儀（TRIO48），德國Biometra公司；微量核酸蛋白分析儀（BioDrop-μLite），英國Biochrom有限公司；電泳儀（EC250-90），美國BIO-RAD公司；恒溫培養箱（GHP-9160），上海一恒科學儀器有限公司；測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2 材料

麥芽提取粉瓊脂（MEA），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），均購自北京陸橋技術股份有限公司；氯硝胺甘油瓊脂培養基（DG-18），購自海博科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒，磁珠組織DNA提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；PCR MasterMix，DL2000 Marker購自北京全式金生物技術有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

本研究收集了來自北京、廣州、青島、無錫地區共14臺在使用期的波輪和滾筒洗衣機作為研究對象，詳細信息見表1。每臺洗衣機設置5個采樣位點，包括洗衣機的門封圈、料盒、內筒外壁、外筒內壁和下水口，共采集57份樣品。參考GB/T 18204.4-2013《公共場所衛生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物》[15]對洗衣機的待采樣部位進行了采樣：使用無菌干燥棉拭子，于5mL滅菌生理鹽水內浸潤，在洗衣機的待采樣部位均勻涂抹進行樣品的采集，用滅菌剪刀剪去棉簽手接觸部位，將棉拭子放入剩余的生理鹽水內，制備成待檢樣品。

1.3.2 樣品中可培養真菌的分離純化

洗衣機采集的樣品以10倍梯度逐級稀釋，制得1∶10和1∶100的樣品懸液，分別吸取100μL原液和稀釋液涂布于PDA、MEA、DG18培養基上，每種培養基涂布兩個平板，分別放置于28℃和20℃，好氧培養3-10d。選取培養基上形態特征不同的菌落進行純化和計數。

1.3.3 樣品中可培養真菌的菌種鑒定

利用真菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的DNA，再利用核糖體翻譯間隔序列（ITS）、核糖體rDNA大亞基（26S D1/D2）[16]等分子標記引物對絲狀真菌和酵母菌的核酸序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×PCR MasterMix 21μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA 30ng，ddH2O補足至50μL。PCR反應條件：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 45s，72℃45s，共27個循環；72℃ 10min[17 ]。擴增后獲得約600bp的DNA片段，并進行測序。根據測序結果，用菌株的26S rDNA和ITS基因作為靶序列，在GenBank數據庫中用BLAST程序搜索同源序列，挑選與靶序列最相近的參考菌株系列，以97%序列相似性為判定標準完成菌種鑒定。

2 結果與分析

2.1 不同采樣位置真菌分離結果分析

從14臺洗衣機的不同采樣位置共分離得到253株真菌，其中，下水口分離到的菌株數量最多，分離到63株真菌；內筒外壁和外筒內壁次之，分別分離到61株和55株真菌；料盒和密封圈分別分離到42株和32株。洗衣機不同采樣位點優勢真菌詳見表2。在優勢真菌中，木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）菌株易形成生物被膜，赭霉屬（Ochroconis）菌株可從人體呼吸道、表皮組織中分離出，對人類健康具有潛在影響；枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）的部分菌株具有致病性；內筒外壁和外筒內壁不易清潔，在清洗過程中微生物可能間接污染衣物，需要重點防控相關致病菌的產生；洗衣機的料盒主要是洗滌劑存放處，若污染真菌，會隨洗衣液污染衣物。

在洗衣機的5個采樣位點中，洗衣機不同采樣位置有6個共有菌屬（詳見圖1），分別為青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、枝孢菌屬 （Cladosporium）、木霉屬（Trichoderma）、紫霉屬（Purpureocillium），說明這幾類真菌在洗衣機不同位點中廣泛分布，是洗衣機真菌污染重點關注的菌種。洗衣機不同位點分布的真菌具有一定的差異性，洗衣機下水口、內筒外壁和外筒內壁分離到的特有菌屬較多，推測可能由于內筒外壁和外筒內壁與下水口直接接觸衣物和污水，且潮濕不易清潔，因而菌株多樣性豐富。

2.2 不同地理位置真菌分離結果分析

通過對不同城市分離菌株的數據進行統計分析發現，無錫地區分離到的菌株數量最多，總共分離到82株；北京次之，分離到70株；青島和廣州分別分離到53株和48株。洗衣機不同地理位置優勢真菌詳見表3。洗衣機不同地理位置有3個共有菌屬，詳見圖2，分別為青霉屬（Penicillium）木霉屬（Trichoderma）、紫霉屬（Purpureocillium）。這三個屬的菌株在洗衣機不同位點中也均有分布，表明這三類菌在洗衣機中易傳播，且環境適應性較強，可在后續研究中重點關注。

為進一步研究不同地域對洗衣機中微生物多樣性的影響，將北京和青島作為北方代表城市，無錫地區和廣州作為南方代表城市進行分析。北方總共分離到12 3株，南方總共分離到13 0株。北方樣品分離頻次前五的菌種分別為青霉屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、曲霉屬（Aspergillus）、紫霉屬（Purpureocillium）和赭霉屬（Ochroconis），北方地區中青島滾筒分離到的菌株數最多；南方樣品分離頻次前五的菌種分別為青霉屬（Penicillium）、紫霉屬（Purpureocillium）、枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）和木霉屬（Trichoderma），南方地區廣州滾筒分離到的菌株數最多。綜上所述，青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、紫霉屬（Purpureocillium）、枝孢菌屬（Cladosporium）為不同地域洗衣機中的共同優勢菌，其中青霉屬（Penicillium）是兩個地域分離頻次均最高的菌屬。

2.3 洗衣機中優勢真菌的特性分析

基于可培養技術分離篩選洗衣機中特征性微生物，結合不同地域、不同采樣位置中微生物的分布以及生物學特性，分析造成洗衣機使用過程中異味、生物膜等問題的關鍵微生物，篩選出的關鍵真菌微生物類群主要為青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢菌屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、紫霉屬（Purpureocillium）、假絲酵母屬（Candida）和赭霉屬（Ochroconis）等。其中，枝孢霉屬（Cladosporium）、假絲酵母屬（Candida）、紅酵母屬（Rhodotorula）、赭霉屬（Ochroconis）均為多篇文獻通過可培養分離得到的菌株，木霉屬（Trichoderma）和紫霉屬（Purpureocillium）、黑酵母屬（Aureobasidium）、毛殼菌屬（Chaetomium）等為本研究從洗衣機中分離到的特有菌株。

青霉屬（Penicillium）在腐爛的水果、蔬菜、肉類和各種潮濕的有機物上常見[18，19]，洗衣機中環境較為潮濕，容易滋生青霉。該屬部分種可引起角膜、皮膚、外耳、呼吸道、泌尿系統感染，以及人工瓣膜植入后發生的心內膜炎。已有文章報道，青霉在嚴重免疫功能低下患者中引起播散性疾病，許多菌株產生真菌毒素[20]。曲霉屬（Aspergillus）在自然界分布廣泛，可分離自空氣、土壤、腐敗食物和臨床呼吸道組織，37℃生長，可侵害家禽、家畜甚至人體內臟特別是呼吸道器官，菌絲體發達可形成生物膜[21]。枝孢菌屬（Cladosporium）也是非培養結果中分離到的關鍵菌種，可形成生物膜，部分種可引起角膜炎，可廣泛引起哮喘病人或有類似呼吸系統疾病患者的過敏反應[22]。鐮刀菌屬（Fusarium）中有些種可產生玉米赤酶烯酮、T-2毒素、嘔吐毒素等對人和動物有強烈毒性的真菌毒素，可引起人體心血管、食管癌、角膜潰瘍等疾病，污染糧食、蔬菜和飼料，人畜誤食會中毒，鐮刀菌菌絲體發達可形成生物膜，具有致污特性[23]。紫霉屬（Purpureocillium）在不同位點和不同地域均有被分離到，菌株生長速度較快，能快速產生孢子，廣泛存在于土壤和空氣中，可導致皮膚感染[24]。假絲酵母屬（Candida）可形成生物膜，導致菌血癥，可感染免疫力低下的病人和其他動物[25]，導致鵝口瘡癥。赭霉屬（Ochroconis）也是非培養結果中分離到的關鍵菌種，可能導致真菌病[26]。

3 結 論

本研究選取14臺洗衣機，通過可培養方法共分離獲得真菌253株，涵蓋36個屬，97個種。洗衣機中的優勢真菌主要有青霉屬（Penicillium）、枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、紫霉屬（Purpureocillium）等。分離到的優勢菌屬中，青霉屬（Penicillium）、枝孢菌屬（Cladosporium）、紫霉屬（Purpureocillium）和曲霉屬（Aspergillus）在自然界分布極廣。青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）是引起多種物質霉腐的主要微生物。青霉屬（Penicillium）、枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus），這三個屬的菌株在洗衣機中易傳播，且環境適應性較強，可作為洗衣機中重點關注菌屬。紫霉屬（Purpureocillium）和木霉屬（Trichoderma）在不同位點和不同地域均有被分離到，這兩類菌株生長速度較快，且能快速產生孢子，易傳播，屬于臨床常見報道的風險菌種，后續需進一步跟蹤研究。按照洗衣機的不同采樣位置和不同地理位置，對洗衣機中分離真菌的多樣性進行了分析。洗衣機不同采樣位置的材質和結構不同，真菌種類具有一定的特異性，下水口和內筒外壁相較于其他位置分離到的真菌株數較多；南方城市的洗衣機分離到的真菌數量多于北方城市。針對洗衣機的真菌污染情況應加強關注，一方面研究新型抗菌材料，減少洗衣機中微生物的附著和增殖；另一方面應建立良好的使用習慣，定期對洗衣機清潔消毒，以減少微生物污染。研究結果為洗衣機中具有致味、致污、致病和抗逆功能的特征微生物的定向篩選、抗菌抑菌試驗的開展、關鍵特征微生物的作用機制的研究以及抗菌材料的開發奠定了基礎。

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作者簡介

曹運奕，博士，工程師，研究方向為家電微生物。

姚粟，通信作者，博士，教授級高級工程師，研究方向為工業微生物。

（責任編輯：張佩玉）