鹽和糖含量對食品復合袋中二氨基二苯甲烷遷移的影響

馬俊杰，胡長鷹,2,*，王志偉

（1.暨南大學包裝工程學院，廣東省普通高校產品包裝與物流重點實驗室，廣東 珠海 519070；2.暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州 510632）

食品接觸材料（food contact materials，FCM）是影響食品安全的重要因素之一，包括各種已經或預期可能與食品接觸的材料和制品。這種接觸可能會導致化學物質從材料遷移到食品中，這意味著有必要通過直接分析食品或使用標準制定的食品模擬物進行遷移實驗以及進一步評判可能導致的食品安全隱患。GB 31604.1—2015《食品接觸材料及制品遷移試驗通則》[1]規定，10%乙醇溶液或水作為非酸性（pH≥5）水性食品的食品模擬物、4%乙酸溶液作為酸性食品模擬物以及植物油作為油脂類食品模擬物等。值得注意的是，法規中沒有設置用于測試高鹽和高糖食品的模擬物。然而鹽和糖普遍存在一些食品中，它們的存在可能會對FCM中物質遷移產生影響[2]。

初級芳香胺（primary aromatic amines，PAAs）是一類典型的有毒有害物質，近年來受到普遍關注。一些PAAs已被國際癌癥研究機構列為“可能對人類致癌”[3]。歐盟FCM最新法修訂指令(EU)NO.1245-2020[4]規定一些PAAs遷移量不得檢出（檢出限（limit of detection，LOD）為2 μg/kg）。食品包裝用多層復合材料中聚氨酯黏合劑的使用可能會帶來PAAs的遷移，引起食品安全問題[5-7]。由于固化反應不完全而殘留在復合材料中的芳香族二異氰酸酯與水反應生成PAAs[8]，這一來源的芳香胺種類取決于黏合劑中固化劑類型。甲苯二異氰酸酯（toluene diisocyanate，TDI）與二苯甲烷二異氰酸酯（diphenyl methane diisocyanate，MDI）是常用的兩類固化劑主要成分[8]。當遇到水時，TDI型固化劑殘留可能產生2,4-二氨基甲苯（2,4-diaminotoluene，2,4-TDA）、2,6-二氨基甲苯（2,6-diaminotoluene，2,6-TDA），MDI型固化劑殘留可能會產生4,4’-二氨基二苯甲烷（4,4’-diaminodiphenylmethane，4,4’-MDA）、2,4’-二氨基二苯甲烷（2,4’-diaminodiphenylmethane，2,4’-MDA）、2,2’-二氨基二苯甲烷（2,2’-diaminodiphenylmethane，2,2’-MDA）及其他同分異構體[9]。氣相色譜-質譜法和液相色譜-質譜或串聯質譜法是常用的PAAs遷移量檢測方法[10-14]。GB 31604.52—2021《食品接觸材料及制品芳香族伯胺遷移量的測定》[15]采用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）定量分析FCM中PAAs遷移量。但儀器價格昂貴，常規的實驗室可能不具備儀器條件，此方法的使用受到一定程度的限制。

當食品模擬液中含有不揮發性鹽或糖時，直接檢測會對質譜造成損傷，因此需進行適當的樣品前處理將目標物與鹽、糖分離。在食品農殘檢測領域，固相萃取常用于除去樣品基質中的無機鹽，但該方法耗材成本高，操作繁瑣，同時也可能會影響微量物質的檢測精度[16]。鹽析、糖析輔助液液萃取已經被廣泛用于食品中農殘檢測、生物醫藥分析領域[17-21]，最近也被應用于FCM中物質遷移研究領域[22]。鹽析效應和糖化誘導使水相與有機相的混合溶液發生相分離，降低目標物在水中的溶解度，使目標物從水相轉移到有機相[23]。使用鹽析、糖析輔助液液萃取分別對含鹽、糖的食品模擬物進行樣品前處理，可將目標物與鹽、糖分離，并且能夠有效提取目標物，從而避免對質譜造成損傷。

本實驗應用LC-MS建立TDA和MDA及其同分異構體等7 種PAAs遷移量的檢測方法，用于快速分析市場上10 種食品包裝袋中TDA和MDA遷移量。同時，將鹽析和糖析輔助液液萃取方法與LC-MS方法結合，探討氯化鈉和蔗糖對食品復合袋中2,4’-MDA和2,2’-MDA向10%乙醇溶液和水遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 種聚酰胺/聚丙烯（polyamide/cast polypropylene，PA/CPP）食品復合蒸煮袋（樣品編號：1～10號），分別購自不同廠家。包裝袋規格：12 cm×17 cm，熱封寬度1 cm。所有包裝袋均未印刷，排除油墨中可能存在的PAAs對實驗造成干擾。

2,4-TDA（99%）、2,6-TDA,（97%）、4,4’-MDA（＞97.6%），2,4’-MDA（＞98%）、2,2’-MDA（＞95%）、3,3’-二氨基二苯甲烷（3,3’-diaminodiphenylmethane，3,3’-MDA，＞98%）、3,4’-二氨基二苯甲烷（3,4’-diaminodiphenylmethan，3,4’-MDA，＞98%）標準品 德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、乙酸、乙醇（均為色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；蔗糖、氯化鈉 天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

EC-C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）、InfinityLab LC/MSD單四極桿HPLC-MS（配有電噴霧離子源） 安捷倫科技（中國）有限公司；DHG-9145A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FA1604 N電子天平（準確度等級I） 上海菁海儀器有限公司；TPTC超純水器 湖南力辰儀器科技有限公司；Vortex-Genie2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：EC-C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫36 ℃；進樣量10 μL；流速0.6 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸溶液（甲酸-水，0.1∶99.9，V/V），B為甲醇溶液；梯度洗脫條件：0～1.0 min，70% A、30% B；1.0～2.0 min，70%～30% A、30%～70% B；2.0～4.0 min，30%～60% A、70%～40% B；4.0～5.0 min，60%～90% A、40%～10% B；5.0～6.0 min，90% A、10% B；6.0～7.0 min，90%～70% A、10%～30% B，7.0～8.0 min，70% A、30% B。

1.3.2 質譜條件

電噴霧電離正離子模式；掃描模式為選擇離子模式；正電噴霧電壓4500 V；離子傳輸溫度320 ℃；霧化氣流速8 L/h；干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速35 L/h。7 種PAAs的質譜參數見表1。

表1 7 種PAAs質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of seven PAAs

1.3.3 標準溶液的配制

標準儲備溶液（1000 mg/L）：準確稱取7 種PAAs標準品各0.01 g并分別放入10 mL容量瓶中，用甲醇進行稀釋定容，得到質量濃度為1000 mg/L的標準儲備液，于4 ℃冰箱避光密封保存。

標準中間溶液（10 mg/L）：分別吸取100 μL 7 種標準儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇進行稀釋定容后，即得到質量濃度為10 mg/L的混合標準中間液，中間液于4 ℃冰箱保存。

標準工作溶液：準確吸取100 μL混合標準中間液于10 mL容量瓶中，用4%乙酸溶液、20%乙腈溶液進行稀釋定容，得到質量濃度100 μg/L工作溶液。再依次將100 μg/L的混合標準工作溶液依次稀釋得到質量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的混合標準工作溶液。

基質匹配標準溶液：根據樣品前處理，對水和10%乙醇溶液食品模擬物分別采用優化后的鹽析、糖析輔助液液萃取，將上層提取清液與水按照體積比1∶4稀釋，得到基質溶液。準確吸取100 μL混合標準中間液于10 mL容量瓶中，使用基質溶液進行稀釋定容，得到質量濃度100 μg/L混合標準工作溶液。再分別用4 種基質溶液依次將100 μg/L混合標準工作溶液依次稀釋，得到質量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的基質標準工作溶液。

1.3.4 液液萃取含鹽、糖食品模擬物中的PAAs

1.3.4.1 鹽析輔助液液萃取

將2 mL水和10%乙醇溶液食品模擬物分別轉移到含有NaCl（20、30、40 g/100 mL）和2,4’-MDA、2,2’-MDA混標（質量濃度均為50 μg/L）的離心管中。然后均勻混合至氯化鈉充分溶解，加入等體積2 mL乙腈，渦旋振動5 min，將小瓶以4000 r/min離心5 min，得到含有目標物的上層乙腈溶液。為減少基質乙腈的溶劑效應，將上層提取溶液取出并超純水稀釋5 倍，最終獲得20%乙腈溶液。每組3 個平行，同時做空白對照。將等分試樣通過PTFE 0.22 μm針式過濾器過濾，并在LC-MS系統上注入10 μL。共研究了輔助萃取劑含量、渦旋時間并進行評估，以優化目標物的提取效率。

1.3.4.2 糖析輔助液液萃取

當蔗糖質量濃度至40 g/100 mL時，食品模擬物（水、10%乙醇溶液）和乙腈等體積（2 mL）混合溶液出現相分離?？疾?0、50、60、70 g/100 mL蔗糖的萃取效率。同1.3.4.1節鹽析輔助同樣操作步驟。

1.3.5 樣品分析

酸性食品模擬物被認為是PAAs遷移的最惡劣情況，因此選擇4%乙酸溶液作為遷移實驗的食品模擬物，以了解樣品中TDA和MDA遷移情況。根據GB 23296.1—2009《食品接觸材料 塑料中受限物質 塑料中物質向食品及食品模擬物特定遷移試驗和含量測定方法以及食品模擬物暴露條件選擇的指南》[24]，按照2 dm2食品接觸面積比100 mL食品模擬物，將10 種食品復合袋統一制成10 cm×10 cm大小的食品復合袋，倒入100 mL 4%乙酸食品模擬物，使用熱封機封口。由于所有樣品均可用作高溫蒸煮袋在高溫下使用，考慮到消費者可能會使用蒸、煮等方式對包裝內的食物進行復熱，因此選擇100 ℃，2 h的條件組合進行遷移實驗。遷移實驗完成后，待樣品袋冷卻至室溫，用注射器抽取1 mL模擬液過0.22 μm有機濾膜后裝入進樣瓶，存放在4 ℃冰箱中待測，每組3 個平行，同時做空白對照。

1.3.6 水性食品模擬物中鹽和糖對PAAs遷移的影響

對于鹽和糖對PAAs遷移影響研究，選擇氯化鈉和蔗糖分別作為食品中鹽和糖的替代物加入到食品模擬物（水、10%乙醇溶液）中，測試6 種不同質量濃度的氯化鈉和蔗糖，0、2、5、10、15、20 g/100 mL。根據樣品分析結果，選擇10號樣品用于實驗。將100 mL含鹽、糖食品模擬物裝入2 dm2（10 cm×10 cm）的食品復合袋中，進行60 ℃、10 d的遷移實驗，以模擬長期貯存期間PAAs的遷移情況。遷移實驗完成后，待樣品袋冷卻至室溫，按照最終萃取方案，分別對含不同質量濃度的鹽、糖食品模擬液進行液液萃取。每組3 個平行，同時做空白對照。

1.4 數據處理與統計分析

利用Chemstation工作站進行數據分析，用Excel和Origin 9.0軟件對數據結果進行統計分析和作圖，SPSS 26.0軟件對結果進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 流動相選擇

以EC-C18為色譜柱，考察不同流動相對7 種PAAs混合標準品的影響。相關研究表明，PAAs在甲醇中的信號響應優于乙腈。因此選擇甲醇作為分離物質的流動相，在此基礎上分別比較甲醇、0.1%甲酸溶液、水和它們不同比例混合物的響應。結果表明，甲醇-甲酸水體系對PAAs的離子化、色譜峰、信號響應均優于甲醇-水體系、以流動相A為體積分數0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇溶液，進一步優化洗脫梯度。7 種PAAs標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 LC-MS檢測7 種PAAs總離子流圖（10 μg/L）Fig.1 LC-MS Total ion current chromatograms of seven PAAs (10 μg/L)

2.2 液液萃取條件優化

2.2.1 輔助萃取劑選擇

考慮到本實驗待測的食品模擬液中已含有不同質量濃度的氯化鈉或蔗糖，且氯化鈉和蔗糖均能在合適的萃取溶劑下觸發水相和有機相混合液的相分離[23]，因此對含鹽模擬液和含糖模擬液萃取時，分別使用氯化鈉和蔗糖作為輔助萃取劑，作為觸發相分離的物質。

2.2.2 萃取溶劑

將等體積（2 mL）甲醇加入分別含20 g/100 mL氯化鈉和蔗糖的水中，混合溶液未能發生分層。異丙醇、乙腈和乙醇是鹽析萃取中使用最廣泛的3 種溶劑，它們在各種比例下都可與水混溶[25]。相關研究表明，使用等體積的水和上述3 種溶劑進行鹽析萃取，異丙醇和乙醇的結果非常相似，氯化鈉不能夠促使兩相的分離，且大多使用醇-水混合物進行相分離的實驗都導致上層相具有較高的水含量，這不利于目標物與氯化鈉的分離。另一方面，乙腈也是本研究檢測方法中的流動相，具有較好的色譜分離效果，避免目標物的峰形失真[25-26]，因此選擇乙腈作為萃取溶劑?？疾煲译媾c食品模擬液不同體積比（1∶2、1∶1和2∶1）的萃取效果，1∶1的萃取效果最好。確定最終萃取溶劑與食品模擬液體積比為1∶1。

2.2.3 輔助萃取劑含量

圖2顯示了輔助萃取劑（氯化鈉、蔗糖）的不同質量濃度對目標物的萃取效率。在等體積（2 mL）的乙腈和水、乙腈和10%乙醇溶液的混合溶液的加標溶液中，分別加入不同質量濃度的氯化鈉（20、30、40 g/100 mL）和蔗糖（40、50、60、70 g/100 mL），根據萃取效率優化選擇萃取劑的最佳質量濃度。隨著氯化鈉質量濃度的增加，2 種MDA回收率并未發生顯著變化（P＞0.05），因此選擇20 g/100 mL的氯化鈉作為合適的質量濃度，在此條件下2,4’-MDA和2,2’-MDA在10%乙醇溶液中回收率分別為95.6%、94.2%，在水中的回收率分別為105.9%、104.1%。

圖2 輔助萃取劑不同質量濃度下2,4’-MDA和2,2’-MDA的回收率Fig.2 Recoveries of 2,4’-MDA and 2,2’-MDA at different auxiliary extractant concentrations

隨著蔗糖質量濃度的增加，兩目標物的回收率均顯著升高（P＜0.05）。當質量濃度為70 g/100 mL時，兩物質的回收率均達到最大，在10%乙醇溶液中回收率分別為92.6%、90.1%，在水中回收率分別為103.4%、104.7%。最終選擇質量濃度70 g/100 mL蔗糖。

2.2.4 萃取時間

選擇渦旋是為了增強乙腈與水之間的接觸，渦旋時間影響目標物的回收率[26]。研究1、2、5、8、10 min五個渦旋時間，選擇20 g/100 mL氯化鈉溶液根據1.3.4.1節進行實驗。如圖3所示，隨著渦旋時間的延長，兩物質回收率先增加后降低，在5 min時觀察到2,4’-MDA和2,2’-MDA的回收率均達到最高，分別為104.3%、103.4%。最終渦旋時間為5 min。

圖3 不同渦旋時間下2,4’-MDA和2,2’-MDA的回收率Fig.3 Recoveries of 2,4’-MDA and 2,2’-MDA at different vortex times

2.3 LOD、線性范圍及線性方程

分別以不含目標物質的4%乙酸食品模擬物和20%乙腈溶液作為樣品空白，配制7 種PAAs混合標準工作溶液。以定量離子峰面積（y）為縱坐標，對應的質量濃度（x，μg/L）為橫坐標，繪制標準曲線，外標法定量。以信噪比不小于3計算LOD，以信噪比不小于10計算定量限（limit of quantitation，LOQ），所有物質的LOQ均低于2 μg/L，滿足歐盟對PAAs的檢測要求。表2結果顯示，PAAs的定量離子峰面積與其質量濃度在一定范圍內呈良好的線性關系，相關系數（R2）均不低于0.991。

選取經檢測不含7 種PAAs的空白樣品，裝入用4%乙酸溶液分別配制成2、10、50 μg/L 3 個質量濃度的7 種PAAs的加標溶液，進行遷移實驗。每個質量濃度做6 個平行實驗，計算加標回收率和精密度。由表2可知，3 個加標水平下的回收率為76.7%～95.7%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）（n=6）為1.0%～6.5%，滿足分析方法相關要求。

表2 7 種PAAs的LOD、線性范圍及線性方程Table 2 Detection limits,linear ranges and linear equations of seven PAAs

2.4 基質效應

分別配制基質溶液標準曲線和食品模擬物溶劑標準曲線，通過斜率比較法評估基質效應[2]。

結果顯示，2,4’-MDA和2,2’-MDA在4 種基質溶液中的基質效應較弱（η值在-0.71～9.87之間），基質效應可忽略不計，實驗中氯化鈉、蔗糖實驗均采用20%乙腈溶液配制的標準曲線定量目標物。

2.5 樣品分析結果

應用方法檢測市場上10 種食品復合袋中PAAs的遷移量，遷移結果見表3。由于樣品用途廣泛，無法估計包裝袋的實際接觸面積（S）與食品或食品模擬物的體積（V）的比率（S/V）。根據GB 31604.1—2015，所有測得含量均按照每1 kg食品模擬物接觸6 dm2的包裝材料比率進行校正。所有食品模擬物的相對密度按慣例假定為1。

表3 10 種食品復合袋中PAAs在4%乙酸中的遷移量（100℃，2 h）Table 3 Migration of PAAs from laminated food packaging bags to 4%acetic acid (100℃,2 h)

歐盟法規規定4,4’-MDA特定遷移限量不超過2 μg/kg（在食品模擬液中）、總PAAs遷移量不超過10 μg/kg。在檢測的10 種樣品中，1、3、5、10號的食品模擬液中檢測到4,4’-MDA、2,4’-MDA和2,2’-MDA。其中，10號樣品中MDA總遷移量為16.3 μg/kg，超出總遷移限量。由于2,4’-MDA和2,2’-MDA遷移量相對較高，作為后續鹽、糖含量對PAAs遷移影響的研究對象。

2.6 氯化鈉、蔗糖對2 種MDA向10%乙醇溶液和水中遷移的影響

由聚酰胺/聚丙烯組成的多層復合包裝袋常用于包裝新鮮肉類、蒸煮食品。根據實際食品（例如肉類、飲料、液體醬汁）中的鹽糖含量選擇測試范圍。食品中氯化鈉質量濃度最高可達15 g/100 mL，例如咸鱈魚被發現含有15 g/100 mL的氯化鈉[2]。蔗糖組分在大部分含糖食品中含量高于其他單體糖成分，液態食品如飲料中糖類物質質量濃度在1.75～21.45 g/100 mL范圍內[27]。

如圖4A、B所示，在60 ℃、10 d遷移實驗后，2,4’-MDA和2,2’-MDA在10%乙醇溶液和水中的遷移量隨著氯化鈉質量濃度的增加顯著減少（P＜0.05）。與不含氯化鈉的食品模擬物相比，氯化鈉質量濃度20 g/100 mL時2,4’-MDA和2,2’-MDA向10%乙醇溶液中遷移量分別下降了31%和64%，向水中遷移量分別下降了39%和59%，而且無論是在10%乙醇溶液還是水中，2,2’-MDA比2,4’-MDA遷移量下降更多，表明2,2’-MDA遷移量更易受到氯化鈉的影響。可見氯化鈉對不同物質遷移影響有差異。如圖4C、D所示，當蔗糖質量濃度大于15 g/100 mL時，兩物質在10%乙醇溶液和水中的遷移量均發生顯著下降（P＜0.05）。課題組前期研究[28]發現4,4’-MDA的遷移量隨著蔗糖質量濃度的升高而降低，與本實驗結果一致。

圖4 2,4’-MDA和2,2’-MDA在不同鹽（A、B）、糖（C、D）含量的食品模擬物中的遷移量（60℃，10 d）Fig.4 Migration levels of 2,4’-MDA and 2,2’-MDA into food simulants with different salt and sucrose contents

與其他的FCM添加劑遷移行為不同，2,4’-MDA和2,2’-MDA分別是復合材料中殘留的2,4’-MDI和2,2’-MDI遷移到食品模擬液中與水的反應產物[8]，屬于非有意添加物（non-intentional added substances，NIAS）。鹽能夠對非電解質物質的溶解度產生影響[29]。當氯化鈉加入水或10%乙醇溶液中時，電離出氯離子和鈉離子，通過分子間作用力和靜電作用結合水分子形成不穩定水合氯離子和水合鈉離子[30]。蔗糖加入水中后，與水分子通過氫鍵結合[23]。有研究表明，蔗糖的存在同樣會對物質的溶解度產生影響[31]。當鹽、糖加入食品模擬物后，一定程度上改變了食品模擬物原有的溶液性質。一方面降低了MDI在水中的溶解度，不利于MDI向食品模擬物中的遷移。另一方面，離子或蔗糖分子與水的結合減少了可參與反應的自由水分子，一定程度上抑制了MDI與水的反應。最終導致MDAs遷移量減少。

水性食品模擬物中鹽、糖的存在會對2 種MDAs遷移量產生顯著影響，氯化鈉和蔗糖的存在降低了物質的遷移量。但Tsochatzis等[2]發現，在所有遷移測試條件下，己內酰胺從聚酰胺/聚乙烯復合膜向10%乙醇溶液中的遷移量隨著氯化鈉質量濃度的增加（2、5、10、15 g/100 mL）顯著增加（P＜0.05）。因此，應該重視鹽、糖含量可能對FCM中小分子物質遷移產生的影響，包括對產生NIAS的過程影響從而對NIAS遷移量的影響。我國食品安全國家標準和歐盟法規(EU) No.10/2011號條例均沒有設置含高鹽、高糖類型的食品模擬物。建議在將來可以增設鹽糖類型的食品模擬物或修正現有的FCM遷移實驗中的食品模擬物。此外，目前關于遷移過程中食物/食品模擬物的鹽、糖含量對遷移物質的影響研究尚少，還需要進一步深入研究。

3 結論

通過LC-MS建立一種快速檢測TDA和MDA的方法，能夠用于檢測復合食品包裝材料中7 種PAAs的遷移量。分析市場上10 種復合包裝袋中PAAs遷移量，發現4,4’-MDA、2,4’-MDA和2,2’-MDA是主要遷移物質。

將鹽析、糖析輔助液液萃取與LC-MS結合，探討氯化鈉和蔗糖對食品復合袋中2,4’-MDA和2,2’-MDA向10%乙醇溶液和水遷移的影響。鹽析輔助液液萃取降低了無機鹽對MS系統的潛在危害，同時它比傳統的液體萃取更快，溶劑使用量也更低，比固相萃取和其他樣品制備技術更具成本效益[16]。

研究了水性食品模擬物中鹽、糖含量對食品復合袋中2,4’-MDA和2,2’-MDA遷移的影響。測試了在60 ℃、10 d遷移條件下，2,4’-MDA和2,2’-MDA向不同鹽、糖含量的水性食品模擬物（10%乙醇、水）中的遷移水平。結果表明，鹽和糖的存在對MDAs的遷移產生顯著影響：鹽和糖的存在降低了2 種MDA的遷移量。盡管這里的研究表明對MDAs安全評價沒有影響，但是鹽、糖對化學物質的遷移會產生影響，甚至可能促進某些小分子物質的遷移。說明對用于高鹽、糖含量食品的包裝遷移測試時，可能需要調整食品模擬物。