氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中的氟蟲腈及其代謝物

馬藝熒，郝 宇，張 鵬，劉萌萌，于 洋，孫欣瑤，于力濤,

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028；3.綏化學(xué)院招生就業(yè)處，黑龍江 綏化 152000）

氟蟲腈是一種具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子化合物，作為一類廣譜殺蟲劑[1-2]使用，因具有殺蟲活性高、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)，被廣泛用于蔬菜、水果等[3-4]農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域，故其可通過食物鏈生物積累進(jìn)入生物體內(nèi)。研究表明，短期攝入大量氟蟲腈可能出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛等急性中毒癥狀，同時(shí)會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷；長(zhǎng)期攝入可能損害肝、腎、甲狀腺等[5-6]器官組織，甚至產(chǎn)生生殖及發(fā)育毒性[7-9]。同時(shí)由于在自然環(huán)境中氟蟲腈可降解為氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜，且其3 種代謝產(chǎn)物毒性均高于氟蟲腈，并易儲(chǔ)存于富含脂質(zhì)的組織，對(duì)人體健康具有更大的威脅[10]。世界衛(wèi)生組織將氟蟲腈列為對(duì)人類有中等毒性化學(xué)品[11]。

中國是茶葉的發(fā)源地，是世界上第一產(chǎn)茶大國，生產(chǎn)的茶葉種類主要有紅茶、綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶和黑茶六大類。茶作為一種健康飲品，茶葉的品質(zhì)尤為重要。茶樹適宜生長(zhǎng)在地勢(shì)高、濕度大的地區(qū)，茶葉在生長(zhǎng)過程中易出現(xiàn)病蟲害，使用氟蟲腈殺蟲劑成為控制其危害茶樹的主要手段，與此同時(shí)茶葉農(nóng)藥殘留問題也日益嚴(yán)重。2006—2014年，我國出口到日本的烏龍茶和綠茶因農(nóng)藥殘留超標(biāo)分別被通報(bào)87 次和12 次，其中氟蟲腈超標(biāo)被通報(bào)22 批次，占被通報(bào)總次數(shù)的22%[12]。2017年，我國出口烏龍茶被日本通報(bào)氟蟲腈超標(biāo)，檢出量為0.009 mg/kg，超出了日本對(duì)茶葉中氟蟲腈的限量0.002 mg/kg[13]。歐洲食品安全局規(guī)定雞蛋中的氟蟲腈最高限量為0.01 mg/kg；GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定水果、蔬菜、蛋類中的氟蟲腈最大限量為0.005～0.02 mg/kg，小麥、大麥、燕麥等谷物的氟蟲腈最大限量為0.002 mg/kg；歐盟委員會(huì)規(guī)定氟蟲腈在谷物、蔬菜、茶葉等食品中的限量為0.005 mg/kg。因此建立高效、快速、準(zhǔn)確的茶葉中氟蟲腈及其代謝物檢測(cè)方法，對(duì)茶葉中的氟蟲腈及其代謝物殘留的監(jiān)測(cè)具有重要意義。

目前，食品中氟蟲腈及其代謝物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[14-16]、液相色譜法[4,17-18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-20]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-24]等。其中氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是氟蟲腈的主要定量分析方法，具有檢測(cè)線性關(guān)系良好、分析定性及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是目前較理想的檢測(cè)方法[25-26]。尤其是氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法，具有離子碎裂少、響應(yīng)值高[27]、抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)殘藥殘的檢測(cè)中有廣泛應(yīng)用[5]，而其在茶葉中檢測(cè)氟蟲腈及其代謝物的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)茶葉氟蟲腈及其代謝物中樣品處理?xiàng)l件：提取劑的選擇、提取劑的用量和凈化柱的選擇進(jìn)行研究，從而建立一種適合測(cè)定茶葉中氟蟲腈及其代謝物含量的氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法，并使用建立的方法測(cè)定市售茶葉中的氟蟲腈及其代謝物，該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性良好、準(zhǔn)確度和靈敏度高，能為茶葉的質(zhì)量安全控制提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉30 份：綠茶10 份、紅茶10 份、烏龍茶5 份、黑茶5 份均為市售。

標(biāo)準(zhǔn)品：氟蟲腈（CAS號(hào)：120068-37-3，100 μg/mL）、氟甲腈（CAS號(hào)：205060-65-3，100 μg/mL）、氟蟲腈砜（CAS號(hào)：120068-36-2，100 μg/mL）、氟蟲腈亞砜（CAS號(hào)：120067-83-6，100 μg/mL） 北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；乙腈、丙酮、正己烷、甲醇（均為殘留級(jí)），氯化鈉（優(yōu)級(jí)純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；CNWBOND PSA SPE Cartridge（PSASPE柱）（規(guī)格為500 mg/6 mL）、CNWBOND Carbon-GCBSPE Cartridge（GCB-SPE 柱）（規(guī)格為500 mg/6 mL）、0.22 μm針式過濾器（有機(jī)相） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；SUPELCLEAN ENVI-18（ENVI-18-SPE柱）（規(guī)格為500 mg/6 mL） 默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

8890-7000D三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配化學(xué)源及Mass hunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫科技有限公司；FS-100粉碎機(jī) 華能科技有限公司；Dynamica VELOCITY 18R高速臺(tái)式離心機(jī) 上海馭锘實(shí)業(yè)有限公司；MMS-520·5020型振蕩器 東京理化有限公司；T 10 basic ULTRA-TURRAX?均質(zhì)器 德國IKA公司；LabTech H150-100LT旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 萊伯泰科儀器股份有限公司；TTL-DCII?氮吹儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，用丙酮分別定容到10 mL，配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL的氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18 ℃貯存?zhèn)溆谩７謩e取上述溶液0.2 mL，用丙酮-正己烷（3∶7，V/V）定容到10 mL，充分混勻，配制成質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。

1.3.2 樣品處理

取茶葉樣品500 g，用磨碎機(jī)全部磨碎，并通過2.0 mm圓孔篩，混勻，放入密封瓶中備用。

稱取2.0 g茶葉樣品，加入10 mL水混勻，再加入20 mL乙腈，高速勻漿提取2 min，再加入1 g氯化鈉，400 r/min劇烈振蕩20 min，5000 r/min離心10 min，待凈化。

取10 mL上層提取液至50 mL具塞離心管中，加入10 mL正己烷，振搖3 min，靜置分層后棄去上層正己烷相，再加入10 mL正己烷重復(fù)操作1 次；將下層乙腈相轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1.0 mL丙酮-正己烷（3∶7，V/V）溶解。

使用5 mL丙酮-正己烷（3∶7，V/V）活化PSA-SPE柱。將樣液傾入PSA-SPE柱中，用10 mL丙酮-正己烷（3∶7，V/V）進(jìn)行洗脫，控制流速不大于2 mL/min。收集全部洗脫液于濃縮瓶中，40 ℃氮吹至近干，用丙酮-正己烷（3∶7，V/V）溶解并定容至1.0 mL，使用0.22 μm濾膜針頭濾器過濾后裝入進(jìn)樣瓶，待測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別取適量氟蟲腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)混合使用液，用丙酮-正己烷稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.002、0.010、0.050、0.100、0.200 μg/mL的氟蟲腈及其代謝物系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.4 色譜條件

HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度70 ℃，保持0 min，然后以30 ℃/min升溫至200 ℃保持10 min，再以50 ℃/min升溫至270 ℃保持4 min；接口溫度280 ℃；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；流量1 mL/min。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電離方式：負(fù)化學(xué)電離；離子源溫度150 ℃；四極桿溫度150 ℃；反應(yīng)氣：甲烷；測(cè)定方式：選擇離子監(jiān)測(cè)方式；溶劑延遲6 min。4 種目標(biāo)物的檢測(cè)參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的檢測(cè)參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for fipronil and its metabolites

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配備的定量分析軟件Mass hunter、Microsoft Excel和Origin 2021對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

常見的提取劑有甲醇、丙酮、乙腈和正己烷等[21]。由于加入氯化鈉后甲醇與水相分層效果不明顯。故選擇丙酮、乙腈和正己烷為提取劑，以加標(biāo)量為0.010 mg/kg的空白茶葉樣品為研究對(duì)象，提取劑添加量為20 mL，經(jīng)過PSA-SPE柱凈化，進(jìn)行氟蟲腈及其代謝物的提取效果的研究，結(jié)果見表2、圖1。

表2 不同提取劑對(duì)氟蟲腈及其代謝物的提取效果Table 2 Extraction efficiencies of different solvents for fipronil and its metabolites

圖1 不同提取劑對(duì)氟蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig.1 Effects of different extractants on the recoveries of fipronil and its metabolites

結(jié)果表明，當(dāng)4 種目標(biāo)物添加量為0.010 mg/kg，丙酮提取目標(biāo)物時(shí)，其對(duì)4 種目標(biāo)物的提取回收率為85.23%～90.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）不大于5.87%；乙腈對(duì)4 種目標(biāo)物的提取回收率為96.00%～98.52%，RSD不大于3.00%；正己烷對(duì)4 種目標(biāo)物的提取回收率為89.34%～95.75%，RSD不大于5.92%。由此可見使用乙腈作為提取劑時(shí)目標(biāo)物的回收率均高于使用丙酮和正己烷作為提取劑時(shí)目標(biāo)物的回收率，差異顯著（P＜0.05），這是由于乙腈極性大、穿透性強(qiáng)，與4 種目標(biāo)物極性更相似，故乙腈的提取率最高[28]。

2.2 提取劑的用量

分別添加5、10、15、20、25、30、35 mL乙腈對(duì)加標(biāo)量為0.200 mg/kg的空白茶葉樣品中4 種目標(biāo)物進(jìn)行提取，經(jīng)過PSA-SPE柱凈化，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取劑用量對(duì)氟蟲腈及其代謝物的提取效果Fig.2 Effect of acetonitrile dosage on the recoveries of fipronil and its metabolites

由圖2可以看出，隨著乙腈添加量的增加，4 種目標(biāo)物的響應(yīng)值也不斷增加，當(dāng)乙腈添加量為20 mL時(shí)，氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜響應(yīng)值達(dá)到最大，且隨著乙腈用量繼續(xù)增加，4 種目標(biāo)物的響應(yīng)值與乙腈添加量為20 mL時(shí)相當(dāng)，這說明在乙腈添加量為20 mL時(shí)4 種目標(biāo)物能被完全提取出來，故選擇20 mL作為提取劑的最適用量。

2.3 凈化柱的選擇

PSA可吸附蛋白質(zhì)、色素以及極性較高的酸性物質(zhì)[29]。C18可除去脂類、花青素、蠟質(zhì)等物質(zhì)，GCB可除去葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等色素和甾醇等[19]。以加標(biāo)量為0.010 mg/kg的空白茶葉樣品為研究對(duì)象，對(duì)比3 種凈化柱對(duì)氟蟲腈及其代謝物的凈化效果，結(jié)果見圖3。

圖3 ENVI-18-SPE柱（A）、GCB-SPE柱（B）和PSA-SPE柱（C）凈化氟蟲腈及其代謝物的色譜圖Fig.3 Chromatograms of fipronil and its metabolites purified by ENVI-18-SPE cartridge (A),GCB SPE cartridge (B) or PSA SPE cartridge (C)

結(jié)果顯示，3 種小柱均可起到凈化的效果，但經(jīng)ENVI-18-SPE柱凈化后的4 種目標(biāo)物，雜質(zhì)峰較多，且響應(yīng)值較高，對(duì)目標(biāo)化合物檢出限附近濃度影響較大，這是由于茶葉樣品經(jīng)其凈化后還殘留其他雜質(zhì)。GCB-SPE柱凈化后的4 種目標(biāo)物存在被吸附的現(xiàn)象，響應(yīng)值均低于其他2 種凈化柱的凈化結(jié)果。PSA-SPE柱凈化的4 種目標(biāo)物分離效果較好，響應(yīng)值較高，故選擇PSA-SPE柱。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系

由圖4可知，4 種目標(biāo)物在16 min內(nèi)可以完全分離，分離效果好，達(dá)到了基線分離。

圖4 氟蟲腈及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)圖譜Fig.4 Chromatogram of standard mixture of fipronil and its metabolites

以氟蟲腈及其代謝物系列標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性范圍；采用空白樣品添加目標(biāo)化合物的方法，選取同一空白茶葉樣品，向其添加目標(biāo)化合物，添加水平為0.002 mg/kg，平行測(cè)定10 次，根據(jù)信噪比法，典型可接受的信噪比為2∶1或3∶1[30]，本方法將平均信噪比為10∶1時(shí)的含量作為檢出限，結(jié)果見表3。

表3 氟蟲腈及其代謝物的線性回歸方程Table 3 Linear regression equations of fipronil and its metabolites

由表3可知，4 種目標(biāo)物在0.002～0.200 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2大于0.999，響應(yīng)值和氟蟲腈及其代謝物含量之間具有顯著的線性相關(guān)性。檢出限均為0.002 mg/kg，該方法靈敏度高，可以滿足氟蟲腈及其代謝物測(cè)定的要求。

2.5 重復(fù)性、精密度及正確度

選取同一空白茶葉樣品，向其添加目標(biāo)化合物，添加量分別為0.010、0.050 mg/kg和0.100 mg/kg，平行測(cè)定7 次，RSD小于5%，表明該方法重復(fù)性良好，精密度良好，達(dá)到分析要求，結(jié)果見表4。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=7）Table 4 Results of precision tests (n =7)

選取同一空白茶葉樣品，向其添加目標(biāo)化合物，以檢出限的1、5 倍和10 倍，在線性范圍內(nèi)選取0.002、0.010 mg/kg和0.020 mg/kg三個(gè)添加水平，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行測(cè)定，得各水平加標(biāo)回收率在96.33%～102.50%之間，符合檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求[31]，結(jié)果見表5。

表5 正確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 5 Results of spiked recovery tests (n=3)

2.6 樣品測(cè)定

使用本研究建立的氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法對(duì)30 份不同種類、不同批次的市售茶葉進(jìn)行檢測(cè)分析，并對(duì)烏龍茶中未檢出樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試，理論加標(biāo)值為0.020 mg/kg，結(jié)果見表6。

表6 不同市售茶葉的氟蟲腈及其代謝物含量Table 6 Results of determination of fipronil and its metabolites in different types of commercial tea by GC-NICI-MS

由表6可知，30 份茶葉樣品中氟蟲腈及其代謝物檢出率為6.67%，其中10 份綠茶中有1 批次氟蟲腈含量為（0.003±0.001）mg/kg，10 份紅茶中有1 批次氟蟲腈砜含量為（0.004±0.001）mg/kg，5 份烏龍茶和5 份黑茶中未檢出氟蟲腈及其代謝物，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)回收率較好，說明本次市售茶葉檢測(cè)實(shí)驗(yàn)正確度較好，數(shù)據(jù)可信度高。

檢出樣品中氟蟲腈及其代謝物總量（以氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜之和計(jì)）高于日本規(guī)定的茶葉中氟蟲腈的最大殘留量0.002 mg/kg，但未達(dá)到歐盟規(guī)定蔬菜中氟蟲腈的最大殘留量0.005 mg/kg。GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中，未對(duì)茶葉中氟蟲腈及其代謝物做出限量規(guī)定，表明其作為農(nóng)藥禁止在茶葉中使用。鑒于氟蟲腈對(duì)甲殼類水生生物和蜜蜂具有較高風(fēng)險(xiǎn)，在水和土壤中降解慢，我國在2009年就對(duì)其限制使用[32]，只允許衛(wèi)生用或作為部分旱田種子包衣劑使用。茶葉樣品中氟蟲腈及其代謝物的檢出，可能存在茶農(nóng)非法使用氟蟲腈的現(xiàn)象，亦或是氟蟲腈被施用后，對(duì)環(huán)境造成污染，從而被茶樹吸收，導(dǎo)致茶葉中檢出氟蟲腈及其代謝物。針對(duì)該現(xiàn)象，國家應(yīng)加強(qiáng)對(duì)氟蟲腈的管理，如對(duì)食品中氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行定期抽檢和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，同時(shí)還應(yīng)對(duì)環(huán)境中氟蟲腈及其代謝物的污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)監(jiān)管，引導(dǎo)農(nóng)民科學(xué)選購與使用農(nóng)藥，確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境及食品安全。

茶葉中氟蟲腈及其代謝物超過最大殘留量也不能說明其對(duì)人體有高暴露風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)結(jié)合不同人群實(shí)際飲茶量和沖泡方式進(jìn)行綜合分析，可根據(jù)泡茶工藝展開研究并進(jìn)行暴露分析。

3 結(jié)論

本研究建立的氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法適用于茶葉中氟蟲腈及其代謝物：氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的測(cè)定。該方法線性范圍較廣、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，能快速簡(jiǎn)便的對(duì)茶葉中氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行檢測(cè)分析。使用本研究建立的氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法測(cè)定不同市售茶葉中氟蟲腈及其代謝物，結(jié)果準(zhǔn)確、回收率高，能準(zhǔn)確反映市售茶葉被氟蟲腈及其代謝物的污染情況，在氟蟲腈及其代謝物痕量檢測(cè)領(lǐng)域可廣泛應(yīng)用。