當歸多糖通過調控miR-148a-3p 抑制高糖誘導的視網膜神經節細胞氧化應激損傷及凋亡研究

曹 朗，王艷新，賈冠美

（保定市第二中心醫院眼科，河北 保定 072750）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病高發眼部并發癥，隨著病情加重患者視力逐漸降低，嚴重時引發黃斑區牽引性視網膜脫落，導致失明[1]。DR 病理過程復雜，目前認為長期慢性高血糖是其重要的發病基礎，視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell，RGC）是視神經的主要構成成分，在高糖刺激下將發生氧化損傷與過度凋亡，引發DR[2]。當歸多糖是當歸主要活性物質之一，具有抗氧化、抗炎、抗輻射、增強免疫力、助造血及抗腫瘤等藥理活性，近年來在糖尿病相關并發癥中的作用逐漸受到關注。研究[3]認為，當歸多糖可通過降低糖尿病腎病大鼠血糖及腎組織中炎性指標延緩病情發生。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來發現的一種非編碼RNA 分子，在進化中具有高度保守性，且在細胞炎癥反應、氧化應激及凋亡中起到重要作用。研究[4]顯示，不同濃度梯度的高葡萄糖處理可降低人視網膜微血管內皮細胞中miR-148a-3p 水平，其過表達導致細胞活力增加和細胞凋亡減少，表明其或可作為DR 診斷或治療的潛在靶點。本研究采用高糖誘導RGC 細胞株RGC-5，建立RGC-5 損傷模型，觀察當歸多糖對其氧化應激損傷及凋亡的影響，以及miR-148a-3p 在該過程中的作用，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞系 大鼠RGC 細胞株RGC-5，購自上海復旦細胞中心。

1.2 藥物、主要試劑、儀器 當歸多糖，陜西慈緣生物技術有限公司；陰性對照載體miR-NC、miR-148a-3p 過表達載體miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p 低表達載體miR-148a-3p inhibitor，上海雅吉生物科技有限公司合成；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒，舜冉（上海）生物科技有限公司；兔抗大鼠B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗，美國Abcam 公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒，上海欽誠生物科技有限公司。

DxFLEX 流式細胞儀，美國貝克曼庫爾特公司；qRT-PCR 儀，美國ABI 公司；CheniDoc XRS 化學發光成像分析系統，美國Bio-rad 公司。

1.3 細胞培養 RGC-5 細胞培養于DMEM 培養基（含10%胎牛血清）中，培養箱標準條件下（37℃，5%CO2）培育，每3 天傳代培養1 次，取對數期細胞進行后續實驗。

1.4 分組 取對數期RGC-5 細胞，以每孔2.5×104個接種至24 孔板中。將細胞分為對照組（常規培養基培養）、高糖組（含葡萄糖30 mmol/L 的培養基培養）、高糖+低劑量組（含葡萄糖30 mmol/L 與當歸多糖100 mg/L 的培養基培養）、高糖+中劑量組（含葡萄糖30 mmol/L 與當歸多糖200 mg/L 的培養基培養）、高糖+高劑量組（含葡萄糖30 mmol/L 與當歸多糖400 mg/L 的培養基培養）[5]。培養48 h 后用于后續實驗。

1.5 ELISA 法檢測細胞SOD 活性及MDA 水平 收集培養48 h 后的各組細胞，加入細胞裂解液冰上裂解，4 000 r/min 離心15 min，取上清液，冷凍保存備用。采用SOD 及MDA 試劑盒檢測上清液中SOD 活性及MDA 水平。

1.6 AnnexinV/PITC 雙染法檢測細胞凋亡率 收集培養48 h 后的各組細胞，PBS 溶液洗滌，棄上清，取100 μL 細胞懸液（每毫升1×106個）接種至6 孔板，繼續培養24 h，離心，PBS 洗滌，棄上清，與Anexin V-FITC 染液5 μL、PI 染液10 μL 混合均勻，避光孵育20 min，加入binding buff er 200 μL 標記液洗滌2 次，60 min 內經流式細胞儀測定凋亡情況，Cell Quest TMD Analysis 軟件分析凋亡率。

1.7 Western blot 法檢測細胞Bax、Bcl-2 蛋白表達量收集培養48 h 后的各組細胞，PBS 溶液洗滌，移至離心管，RIPA 裂解液裂解，離心15 min，BCA 試劑盒測定并定量總蛋白。取待測蛋白50 μg，與4 倍上樣緩沖液混合，沸水浴變性，離心取上清，恒壓下電泳分離、轉膜，封閉液封閉2 h，加入兔抗大鼠Bax、Bcl-2 一抗（1:500），4 ℃冷藏過夜，TBST 清洗，加入二抗（1:2 000），搖床孵育2 h，TBST 清洗，ECL液發光，暗室顯影，成像分析儀分析，以Bax、Bcl-2蛋白與內參GAPDH 的灰度值比值代表蛋白表達量。

1.8 qRT-PCR 法檢測細胞miR-148a-3p 表達量 收集培養48 h 后的各組細胞，PBS 溶液洗滌，Trizol 法提取總RNA，反轉錄獲取cDNA，根據qRT-PCR 試劑盒說明書設置反應體系：雙倍核酸染料12 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 1 μL，加dd H2O 補充至總體積20 μL。擴增條件：92 ℃預變性4 min；92 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，重復35個循環。以GAPDH 為管家基因，2-△△Ct為目的基因相對表達強度，所有實驗重復3次取CT平均值。以U6為內參基因，檢測miR-148a-3p 表達，2-△△Ct法分析并計算相對表達強度。實驗所用引物：miR-148a-3p Forward primer，5’-ACTGTGTCATGCACGCGTCAGTGG-3’；Reverse primer，5’-CGTACGCGTGCACCGCCTTGTGTA-3’；U6 Forward primer，5’-TACACAACAGTGCACACACC GTGC-3’；Reverse primer，5’-AAACTGTGCACGGTT CTGTCACGC-3’。

1.9 細胞轉染及分組 取對數期RGC-5 細胞，以每孔2.5×104個接種至24 孔板中。將細胞分為高糖+miR-NC 組（含葡萄糖30 mmol/L 的培養基培養，按照LipofectamineTM3000 脂質體法轉染說明書轉染陰性對照載體miR-NC）、高糖+miR-148a-3p mimics 組（含葡萄糖30 mmol/L 的培養基培養，轉染miR-148a-3p 過表達載體miR-148a-3p mimics）、高糖+miR-148a-3p inhibitor 組（含葡萄糖30 mmol/L 的培養基培養，轉染miR-148a-3p 低表達載體miR-148a-3p inhibitor）、高糖+當歸多糖+miR-148a-3p mimics 組（含葡萄糖30 mmol/L 與當歸多糖400 mg/L 的培養基培養，轉染miR-148a-3p 過表達載體miR-148a-3p mimics）、高糖+當歸多糖+miR-148a-3p inhibitor 組（含葡萄糖30 mmol/L 與當歸多糖400 mg/L 的培養基培養，轉染miR-148a-3p 低表達載體miR-148a-3p inhibitor）。轉染48 h 后用于后續實驗。

1.10 qRT-PCR 法檢測細胞miR-148a-3p 表達量 收集轉染48 h 后的各組細胞，操作同1.8，檢測細胞miR-148a-3p 表達量。

1.11 檢測高糖誘導的RGC 氧化應激損傷及凋亡 收集轉染48 h 后的各組細胞，操作同1.5、1.6、1.7，檢測細胞SOD 活性及MDA 水平，細胞凋亡率，細胞Bax、Bcl-2 蛋白表達量。

1.12 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，以均數±標準差（）表示計量資料，以單因素方差分析比較多樣本資料，兩兩樣本資料比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 當歸多糖對高糖誘導的RGC 氧化應激損傷的影響 與對照組比較，高糖組SOD 活性降低，MDA 水平升高（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+低劑量組SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）；與高糖+低劑量組比較，高糖+中劑量組SOD活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）；與高糖+中劑量組比較，高糖+高劑量組SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組SOD 活性、MDA 水平比較（）

表1 各組SOD 活性、MDA 水平比較（）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與高糖組比較，△P ＜0.05；與高糖+低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高糖+中劑量組比較，□P ＜0.05

2.2 當歸多糖對高糖誘導的RGC 凋亡率的影響 與對照組比較，高糖組凋亡率升高（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+低劑量組凋亡率降低（P＜0.05）；與高糖+低劑量組比較，高糖+中劑量組凋亡率降低（P＜0.05）；與高糖+中劑量組比較，高糖+高劑量組凋亡率降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組凋亡率比較（ ） %

表2 各組凋亡率比較（ ） %

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與高糖組比較，△P ＜0.05；與高糖+低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高糖+中劑量組比較，□P ＜0.05

2.3 當歸多糖對高糖誘導的RGC 凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 表達的影響 與對照組比較，高糖組Bax 蛋白表達量升高，Bcl-2 蛋白表達量降低（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+低劑量組Bax 蛋白表達量降低，Bcl-2 蛋白表達量升高（P＜0.05）；與高糖+低劑量組比較，高糖+中劑量組Bax 蛋白表達量降低，Bcl-2蛋白表達量升高（P＜0.05）；與高糖+中劑量組比較，高糖+高劑量組Bax 蛋白表達量降低，Bcl-2 蛋白表達量升高（P＜0.05）。見表3，圖1。

表3 各組Bax、Bcl-2 蛋白表達量比較（）

表3 各組Bax、Bcl-2 蛋白表達量比較（）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與高糖組比較，△P ＜0.05；與高糖+低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高糖+中劑量組比較，□P ＜0.05

圖1 細胞Bax、Bcl-2 蛋白表達

2.4 當歸多糖對高糖誘導的RGC 中miR-148a-3p 表達的影響 與對照組比較，高糖組miR-148a-3p 表達量降低（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+低劑量組miR-148a-3p 表達量升高（P＜0.05）；與高糖+低劑量組比較，高糖+中劑量組miR-148a-3p 表達量升高（P＜0.05）；與高糖+中劑量組比較，高糖+高劑量組miR-148a-3p 表達量升高（P ＜0.05）。見表4。

表4 各組miR-148a-3p 表達量比較（ ）

表4 各組miR-148a-3p 表達量比較（ ）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與高糖組比較，△P ＜0.05；與高糖+低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高糖+中劑量組比較，□P ＜0.05

2.5 miR-148a-3p 表達對高糖誘導的RGC 氧化應激損傷的影響 與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-148a-3p mimics 組miR-148a-3p 表達量及SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05），高糖+miR-148a-3p inhibitor 組miR-148a-3p 表達量及SOD 活性降低，MDA 水平升高（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，高糖+當歸多糖+miR-148a-3p mimics組miR-148a-3p 表達量及SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，高糖+當歸多糖+miR-148a-3p inhibitor 組miR-148a-3p 表達量及SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）。見表5，表6。

表5 各組miR-148a-3p 表達量比較（ ）

表5 各組miR-148a-3p 表達量比較（ ）

注：與高糖+miR-NC 組比較，# P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，△P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，▲P ＜0.05

表6 各組SOD 活性、MDA 水平比較（）

表6 各組SOD 活性、MDA 水平比較（）

注：與高糖+miR-NC 組比較，# P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，△P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，▲P ＜0.05

2.6 miR-148a-3p 表達對高糖誘導的RGC 凋亡率的影響 與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-148a-3p mimics 組凋亡率降低（P＜0.05），高糖+miR-148a-3p inhibitor 組凋亡率升高（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，高糖+當歸多糖+miR-148a-3p mimics 組凋亡率降低（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，高糖+當歸多糖+miR-148a-3p inhibitor 組凋亡率降低（P＜0.05）。見表7。

表7 各組凋亡率比較（ ） %

表7 各組凋亡率比較（ ） %

注：與高糖+miR-NC 組比較，# P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，△P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，▲P ＜0.05

2.7 miR-148a-3p 表達對高糖誘導的RGC 凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 表達的影響 與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-148a-3p mimics 組Bax 蛋白表達量降低，Bcl-2 蛋白表達量升高（P＜0.05），高糖+miR-148a-3p inhibitor 組Bax 蛋白表達量升高，Bcl-2 蛋白表達量降低（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p mimics組比較，高糖+當歸多糖+miR-148a-3p mimics 組Bax 蛋白表達量降低，Bcl-2 蛋白表達量升高（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，高糖+當歸多糖+miR-148a-3p inhibitor 組Bax 蛋白表達量降低，Bcl-2 蛋白表達量升高（P＜0.05）。見表8，圖2。

表8 各組Bax、Bcl-2 蛋白表達量比較（）

表8 各組Bax、Bcl-2 蛋白表達量比較（）

注：與高糖+miR-NC 組比較，# P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，△P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，▲P ＜0.05

圖2 細胞Bax、Bcl-2 蛋白表達

3 討論

RGC 是各級視網膜神經元中唯一參與視神經纖維形成且將視網膜視覺信息傳遞至視覺中樞的神經元，RGC 間相互鑲嵌構成視網膜的內層結構，其軸突集合形成視神經。RGC 損傷是DR 的早期特征及主要病因，持續高血糖是誘導其發生的重要原因之一[6]。研究[7]認為，高糖誘導RGC 損傷與線粒體功能障礙、自身免疫、鈣離子超載、谷氨酸興奮毒性、神經營養因子缺乏及氧化應激密切相關。研究[8]指出，保護RGC、減輕其高糖誘導的氧化應激損傷可延緩DR 發生。

正常生理狀態下，機體中氧自由基為動態平衡狀態，在高糖狀態下，RGC 中的SOD 活性降低，無法及時清除活性氧而致其聚集在細胞中，引起脂質過氧化，生成大量MDA，引發氧化損傷[9]。氧化應激進一步誘導細胞凋亡發生，其途徑與凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 有關，Bax 蛋白表達量升高對細胞凋亡具有促進作用，Bcl-2 蛋白表達量升高對細胞凋亡具有抑制作用[10]。本研究結果顯示，經當歸多糖處理后，高糖誘導的RGC 中SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達量升高，MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達量降低，且表現為劑量依賴性，提示當歸多糖可減輕高糖誘導的RGC 氧化應激損傷，減少凋亡。當歸多糖是傘形科植物當歸的提取物，含有D-木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-半乳糖、半乳糖醛酸等多種成分，具有顯著的免疫促進效應及抗氧化活性，可減輕胰島β 細胞損傷，增強胰、腎、心、腦及眼中SOD 活性，降低MDA 含量，減輕過氧化損傷[11]。

miRNA 廣泛存在于真核生物中，通過與靶向基因的mRNA 完全或者不完全互補結合，使其降解或抑制其蛋白翻譯，從而調控細胞功能[12-13]。本研究結果顯示，高糖可抑制miR-148a-3p 表達，過表達miR-148a-3p 可減輕高糖誘導的RGC 氧化應激損傷及凋亡，抑制其表達將加劇高糖誘導的RGC 氧化應激損傷及凋亡，提示miR-148a-3p 可作為治療DR 的潛在靶點。本研究結果顯示，當歸多糖可上調高糖誘導的RGC 中miR-148a-3p 表達，且表現為劑量依賴性，而抑制miR-148a-3p表達則可逆轉當歸多糖對高糖誘導的RGC 的影響，提示當歸多糖可能通過上調miR-148a-3p 表達減輕高糖誘導的RGC 氧化應激損傷，減少細胞凋亡。

綜上所述，當歸多糖可減輕高糖誘導的RGC 氧化應激損傷，減少細胞凋亡，且表現為劑量依賴性，其作用機制可能與上調miR-148a-3p 表達有關。