基于SNAIL 信號通路及腸道菌群研究密點麻蜥抑制胃癌肝轉移的作用機制

白 星，程翻娥，楊長沅，李 錚，李衛強,

1.寧夏醫科大學中醫學院，寧夏 銀川 750004

2.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510006

3.寧夏少數民族醫藥現代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004

胃癌是世界第4 大惡性腫瘤[1]，由于其發病隱匿、早期不易診斷且胃癌細胞具有循環擴散性，大多數患者在確診時已發展為晚期胃癌或伴有轉移。其中，肝臟是胃癌細胞血行轉移最常見的器官，其臨床治療仍是亟待解決的難題[2-3]。人類腸道菌群中既包含致癌菌群又包含抑癌菌群，共同維護腸道黏膜穩態環境，癌癥的發生及轉移與腸道菌群失調密切相關[4]。研究表明，胃癌肝轉移患者腸道菌群存在紊亂現象[5]。因此，從浸潤轉移相關的上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及腸道菌群調控等多靶點開展干預胃癌肝轉移的作用及機制闡釋為中醫藥抗癌研究提供科學依據具有重要意義。

EMT 是上皮細胞獲得間充質細胞表型的過程[6]。這一生物過程常被癌細胞利用則致使癌細胞具有抗凋亡、獲得侵襲等癌細胞特性。EMT 是腫瘤轉移的重要標志，SNAIL 是EMT 的標志物，能夠抑制Ecadherin 的表達，促進EMT 進程[7]。SNAIL 的異常激活與腫瘤的發生與轉移及其預后密切相關[8]。

密點麻蜥Eremias multiocellataGünther 始載于《中國藥用動物志》[9]，《本草綱目》載蜥蜴有活血化瘀、消癭散結之功。本課題組前期開展了密點麻蜥及其為主組成的復方中藥干預胃癌的相關研究，證實密點麻蜥含藥血清能夠抑制胃癌SGC-7091 細胞的增殖，抑制Sirt1 表達，降低p53 蛋白表達，促進胃癌細胞的調亡[10]；其復方能夠改善癌前病變大鼠病理形態，降低p53 和PUMA 表達，逆轉癌變趨勢[11]，且闡明蜥蜴復方中藥能夠通過上調Ecadherin、下調整合素β1和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）表達，阻斷EMT，抑制胃癌浸潤轉移[12]。本課題基于以上前期研究，進一步探索密點麻蜥基于SNAIL 信號通路影響EMT及腸道菌群調節，從多途徑、多靶點對胃癌肝轉移的抑制作用及機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性BALB/c 裸鼠36 只，4 周齡，體質量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SCXK（京）2021-0006。動物飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心SPF 級動物房，恒溫（22±1）℃，光照晝夜交替各12 h，自由進食飲水。動物實驗經寧夏醫科大學實驗動物倫理審查委員會批準（批準號2021-091）。

1.2 細胞株

人胃腺癌HGC-27 細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 藥材

密點麻蜥（批號20180501）購自寧夏醫科大學附屬中醫醫院門診，經寧夏醫科大學藥學院劉艷華教授鑒定為密點麻蜥E.multiocellataGünther。

1.4 藥品與試劑

5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-FU，批號2005181）購自天津金耀藥業有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色液（批號202010）購自北京博奧拓達科技有限公司；兔抗鼠β-actin 多克隆抗體（批號12w2944）、SNAIL 多克隆抗體（批號78m6660）、E-cadherin 多克隆抗體（批號32p9942）、N-cadherin多克隆抗體（批號12j8872）多克隆抗體購自Affinity Biosciences；HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體（批號ATTNO0301）購自亞科因生物技術有限公司；E.Z.N.A.?DNA 提取試劑盒（批號M9636020000J13V）購自美國 Bio-Tek 公司；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（批號11214KA1）購自Axygen Biosciences；Quantus? Fluorometer 檢測試劑盒（批號0000302722）購自美國Promega 公司。

1.5 儀器

CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；RM2255 型全自動輪轉式石蠟切片機（德國Leica 公司）；MiniProteanTetra 蛋白電泳系統（美國伯樂公司）；Amersham Imager 680RGB 型超靈敏多功能成像儀（美國GE 公司）；NovaSeqpE250 型平臺（美國Illumina 公司）。

2 方法

2.1 胃癌肝轉移模型制備、分組與給藥

36 只雄性BALB/c 裸鼠按照隨機數字表法隨機分為對照組（9 只）和造模組（27 只）。參考相關文獻，采用脾臟注射法[13]建立胃癌肝轉移模型。造模動物蘇醒后，隔天對傷口進行碘伏消毒處理。飼養4 周并對其精神狀態、活動度、體質量飲食、皮膚顏色、腫瘤生長等情況進行隔日觀察記錄。造模4周時，隨機取對照組1 只與造模組3 只剖腹探查驗證造模成功。對照組裸鼠肝組織色澤鮮明、表面光滑；造模組裸鼠肝組織出現肉眼可見白色結節，肝臟受損，部分肝組織被轉移性結節代替，表明胃癌肝轉移模型構建成功。

造模成功的裸鼠按照隨機數字表法隨機分為模型組、5-FU（0.025 g/kg）組和密點麻蜥（2.6 g/kg，臨床等效劑量）組，每組8 只，并由第3 方對實驗組進行隨機編碼，編號為不透明的密封信封以避免選擇性偏倚。

取密點麻蜥5.2 g，加入純水定容至600 mL，浸泡30 min，放入數顯恒溫加熱電熱套中100 ℃煮沸后，將溫度調至80 ℃，煎煮至300 mL 時濾過，繼續80 ℃加熱至200 mL，制備成終質量濃度為0.026 g/mL 的水煎劑。密點麻蜥組ig 水煎劑，2 次/d；5-FU組ip 5-FU 原液稀釋10 倍后的溶液，1 次/d，對照組和模型組ig 生理鹽水，連續4 周。

2.2 樣本采集

用無菌EP 管收集各組裸鼠末次給藥2 h 后的新鮮糞便，迅速轉移至-80 ℃保存。各組小鼠ip 2%戊巴比妥鈉麻醉，取一小塊肝組織以生理鹽水沖洗后，于4%多聚甲醛中固定24 h，剩余肝組織于-80 ℃保存備用。

2.3 肝組織病理觀察

取固定好的肝組織，沖水后脫水、透明，石蠟包埋，切成4 μm 厚的石蠟切片，脫蠟水化后蒸餾水沖洗5 min，蘇木素染色4 min，水洗多余染液，鹽酸酒精分化，水洗15 min，伊紅染色3 min 后蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，滴加中性樹膠封片。晾干后用切片掃描儀觀察。

2.4 肝組織SNAIL、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達檢測

取各組裸鼠肝組織100 mg，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液1 mL，用冷凍研磨儀低溫研磨至充分裂解，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清。BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，加入無蛋白快速封閉液封閉15 min，TBST 洗滌5 次，每次5 min，加入一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌5 次，每次5 min，加入二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌5 次，加入ECL 發光試劑顯影，采用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.5 裸鼠糞便DNA 提取及IIluminaNovaSeq 測序

將每組裸鼠的糞便混合后，用E.Z.N.A.?DNA提取試劑盒抽提腸道微生物總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 質量，用引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對V3～V4 可變區基因進行PCR 擴增，95 ℃預變性3 min，27個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s），72 ℃穩定延伸10 min，4 ℃進行保存。PCR 反應體系：5×TransStart Fastpfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，TransStart Fastpfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，雙蒸水補足至20 μL。每個樣本6 個重復。

使用2%瓊脂糖凝膠回收同一樣本PCR 產物，利用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用 Quantus?Fluorometer 檢測試劑盒對回收產物進行檢測定量。送由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。分別用Ace、Sobs、Shannon 和Simpson 指數測定α-多樣性。用Bray-Curtis 計算β-多樣性，主坐標分析可視化，R 軟件繪制結果來比較不同樣本菌群豐富度和多樣性。

2.6 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統計分析，對定量資料進行正態性檢驗，符合正態分布的用表示；非正態分布的采用中位數（四分位數）［M（Q1，Q3）］表示。兩組間比較方差齊且符合正態分布采用StudentT檢驗，方差不齊且不符合正態分布用Wilcoxon 秩和檢驗。多組間比較采用單因素方差分析單因素方差分析（One-way ANOVA）或Kruskal-Wallis 秩和檢驗。

3 結果

3.1 密點麻蜥對胃癌肝轉移裸鼠肝組織病理變化的影響

如圖1 所示，對照組肝組織細胞排列整齊，肝小葉結構完整；模型組癌細胞在肝組織內聚集成灶性，肝小葉破壞，癌細胞核大、固縮、深染，異性明顯，肝細胞水腫可見炎細胞浸潤，部分可見肝組織壞死；5-FU 組和密點麻蜥組肝組織病灶變小，肝細胞較模型組排列整齊，炎性細胞減少，肝細胞表現出新生性，病變均有改善。

3.2 密點麻蜥對胃癌肝轉移裸鼠肝組織SNAIL、Ecadherin 和N-cadherin 蛋白表達的影響

如圖2 和表1 所示，與對照組比較，模型組裸鼠肝組織SNAIL 和N-cadherin 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.001），E-cadherin 蛋白水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，密點麻蜥組SNAIL 和N-cadherin 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.001），E-cadherin 表達水平顯著升高（P＜0.001）。

表1 密點麻蜥對胃癌肝轉移裸鼠肝組織中SNAIL、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達的影響 (,n=8)Table 1 Effect of E.multiocellata on SNAIL,E-cadherin and N-cadherin protein expressions in liver tissue of nude mice with gastric cancer of liver metastasis (,n=8)

表1 密點麻蜥對胃癌肝轉移裸鼠肝組織中SNAIL、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達的影響 (,n=8)Table 1 Effect of E.multiocellata on SNAIL,E-cadherin and N-cadherin protein expressions in liver tissue of nude mice with gastric cancer of liver metastasis (,n=8)

與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001***P ＜ 0.001 vs control group;#P ＜ 0.05 ###P ＜ 0.001 vs model group

圖2 密點麻蜥對胃癌肝轉移裸鼠肝組織中SNAIL、Ecadherin 和N-cadherin 蛋白表達的影響Fig.2 Effect of E.multiocellata on SNAIL,E-cadherin and N-cadherin protein expressions in liver tissue of nude mice with gastric cancer of liver metastasis

3.3 密點麻蜥對胃癌肝轉移裸鼠腸道菌群的影響

3.3.1 稀釋曲線 Rank-Abundance 曲線用來反映物種的均勻度和豐富度，橫坐標寬度代表物種豐度，縱坐標平滑度表示物種均勻度，曲線平滑下降且水平延伸表示物種豐度高且均勻，陡然下降則表示優勢菌群所占比例較高均勻度較低。如圖3-A 所示，對照組和密點麻蜥組優勢菌群所占比較高，密點麻蜥組和5-FU 組物種豐富度較高。

稀釋曲線用于評價測序深度能否反映總體所包含的每個樣本微生物多樣性，也可以比較相同的測序深度下不同樣本操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數。如圖3-B 所示，橫坐標代表測序量，縱坐標表示多樣性指數。使用Shannon算法的稀釋曲線測序量在400 時，Shannon 曲線走向平緩，曲線較長且集中在平緩，說明在本實驗中繼續增加測序量產生新的物種較少，測序數據量能夠反映樣本生物信息。

圖3 物種等級豐度圖 (A) 和Shannon 稀釋曲線圖 (B)Fig.3 Species Rank-abundance curve (A) and Shannon dilution curve (B)

3.3.2 α 多樣性指數組間差異 sob 指數代表物種實際觀測豐度，Shannon 指數反映菌落的多樣性，Chao 指數反映物種的豐富度，pd 指數反映菌群進化譜系多樣性。如圖4 所示，與對照組比較，模型組sob 指數和pd 指數均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，5-FU 組和密點麻蜥組sob 指數和pd 指數均顯著降低（P＜0.05、0.01），密點麻蜥組Shannon指數顯著降低（P＜0.05）。結合多樣性指數和均勻豐富度，胃癌肝轉移裸鼠腸道菌群與對照組比較表現菌群失調趨向，經密點麻蜥治療后更接近對照組。

圖4 各組腸道菌群的α 多樣性分析 (,n=6)Fig.4 α Diversity analysis of gut microbiota in each group (,n=6)

3.3.3 β 多樣性分析 偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）將多組數據間差異反映在坐標中，坐標中樣品的距離越接近，表明其樣品結構相似性越高，反之差異性越顯著。如圖5 所示，模型組與對照組腸道菌群構成表現出差異；5-FU 組與密點麻蜥組結構接近，與模型組有一定的距離，更接近對照組，表明密點麻蜥可以調節胃癌肝轉移裸鼠腸道菌群的結構。

圖5 各組腸道菌群β 多樣性的PLS-DAFig.5 PLS-DA of β diversity of gut microbiota in each group

3.3.4 腸道菌落物種組成分析 如圖6-A 和表2 所示，在門水平上各組胃癌肝轉移裸鼠腸道菌群相對豐度＞1%的菌群有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌 門（Verrucomicrobiota）、放線菌門（Actinobacteriota）。與對照組比較，模型組厚壁菌門豐度降低，擬桿菌門豐度升高；與模型組比較，密點麻蜥組厚壁菌門豐度升高。厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）可反映胃腸整體健康狀況，與對照組比較，模型組F/B 值下降；經5-FU 和密點麻蜥干預后F/B值均升高。如圖6-B 所示，在屬水平各組占比差異較大的菌屬為擬桿菌屬Bacteroides，各組在擬桿菌屬的豐度比例為對照組20.57%、模型組28.39%、5-FU 組5.71%、密點麻蜥組9.49%。

圖6 門 (A) 和屬 (B) 水平腸道菌群物種組成分析Fig.6 Species composition analysis of intestinal flora at phyla (A) and genus (B) levels

表2 密點麻蜥對胃癌肝轉移裸鼠腸道菌群擬桿菌門和厚壁菌門的影響 (,n=6)Table 2 Effect of E.multiocellata on Firmicutes and Bacteroidota in gut microbiota of nude mice with liver metastasis of gastric cancer (,n=6)

表2 密點麻蜥對胃癌肝轉移裸鼠腸道菌群擬桿菌門和厚壁菌門的影響 (,n=6)Table 2 Effect of E.multiocellata on Firmicutes and Bacteroidota in gut microbiota of nude mice with liver metastasis of gastric cancer (,n=6)

3.3.5 屬水平物種差異分析 如圖7 所示，屬水平各組間差異顯著的菌群主要有norank_f__Muribaculaceae、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬Lactobacillus、梭狀芽孢桿菌屬Clostridia_UCG-014、副擬桿菌屬Parabacteroides、幽門螺旋桿菌Helicobacter。其中norank_f__Muribaculaceae 在模型組較對照組豐度增加，經5-FU 和密點麻蜥治療后為表現出下降趨勢；擬桿菌屬在各組間豐度差異顯著，與對照組相比模型組中顯著富集（P＜0.05），經密點麻蜥治療后豐度顯著下降（P＜0.01）；與對照組相比模型組中乳酸桿菌屬豐度降低，經藥物治療后未見顯著調節作用；與對照組相比，Clostridia_UCG-014 在模型組中占比下降，經密點麻蜥干預后顯著提高，各組間差異顯著（P＜0.001）。副擬桿菌屬在模型組中較對照組顯著提高（P＜0.05），經藥物治療后豐度下降接近對照組（P＜0.001）。幽門螺旋桿菌在模型組中的豐度明顯增加（P＜0.01），經藥物干預后恢復生理水平（P＜0.01）。密點麻蜥主要對胃癌肝轉移裸鼠腸道中擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、副擬桿菌屬、幽門螺旋桿菌進行調節。

圖7 屬水平物種差異分析Fig.7 Analysis of species differences at genus level

4 討論

目前胃癌的治療手段主要是手術切除、圍術期放化療及分子靶向治療。但腫瘤的遠處轉移常常影響手術的可行性，且一部分病人對于化療藥物表現為不耐受以及耐藥等一系列問題仍亟待解決。研究發現中醫藥通過多途徑多靶點對腫瘤具有較好的治療作用[14]。因此探究中藥抗癌機制為臨床提供科學依據、促進藥物研發具有重要意義。

在腫瘤形成中SNAIL 可抑制E-cadherin 的轉錄從而誘導EMT 發生，促進癌細胞增殖、抗調亡及轉移[15]。另外SNAIL 誘導的EMT 可以通過抑制宿主的免疫監視能力促進腫瘤的轉移及復發[16]。本研究發現，與對照組比較，模型組SNAIL 和N-cadherin蛋白表達上調，E-cadherin 表達下調，蛋白表達上調；與模型組比較，密點麻蜥上調E-cadherin 表達，下調SNAIL、N-cadherin 的表達，表明密點麻蜥可能通過抑制轉錄因子SNAIL 的表達，增加Ecadherin 表達調控EMT 的進程，對胃癌肝轉移裸鼠模型具有較好的抑制作用。

近年研究表明，腸道菌群成分與癌癥發生有關。其中腸道菌群產生的短鏈脂肪酸（short-chain fattyacids，SCFAs）在細胞穩態中至關重要，它們有助于調節組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），從而影響細胞附著、免疫細胞遷移、細胞因子產生、趨化性和程序性細胞死亡[17]。SCFAs 能夠作用于乳腺癌細胞表面的G 蛋白偶聯受體，調節腫瘤抑制基因，使癌細胞E-cadherin 表達升高、應力纖維含量降低，阻斷EMT 進展[18]。因此，通過改變腸道菌群結構來控制SCFAs 水平亦可抑制腫瘤。

機體SCFAs 中的丁酸主要由厚壁菌門產生[19]。本研究中胃癌肝轉移裸鼠腸道菌群中厚壁菌門在對照組豐度占比40.9%，模型組中厚壁菌門的豐度為26.4%。經密點麻蜥干預后厚壁菌門的豐度提高到30.2%。與對照組比較，擬桿菌門在模型組中豐度顯著提高，經5-FU 治療后豐度下降，密點麻蜥干預后未見改變。F/B 值可反映胃腸整體健康狀況，是診斷菌群紊亂的標志，與對照組比較，模型組F/B 值下降，表明胃癌肝轉移發生后裸鼠腸道菌群發生紊亂，經5-FU 和密點麻蜥干預后F/B 值均提高，因此證實密點麻蜥可調節菌群失調。本課題組前期研究發現胃癌肝轉移裸鼠腸道中厚壁菌門豐度下降，且以密點麻蜥為主藥的復方表現出提高胃癌肝轉移裸鼠腸道厚壁菌門豐度的作用，因此表明密點麻蜥可通過增加厚壁菌門的豐度，補充機體SCFAs 的缺失來抑制胃癌[20]。

屬水平上，密點麻蜥主要對胃癌肝轉移裸鼠腸道中擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、副細菌屬、幽門螺旋桿菌屬進行調節。其中擬桿菌屬和副細菌屬的生理功能相似，均可代謝碳水化合物和產生SCFAs，對宿主健康和免疫調節有益[21]。副細菌屬還表現鎖定腫瘤壞死因子的釋放發揮對腫瘤的抑制作用[22]。梭狀芽孢桿菌能夠誘導宿主腸道T 細胞反應表型從而發揮對人體免疫調節的作用[23]。幽門螺旋桿菌屬是胃癌發生的主要原因，根除幽門螺旋桿菌可降低SNAIL 的表達，增加E-cadherin 從而抑制EMT 的發生[24]。同時幽門螺桿菌影響成纖維細胞向具有腫瘤相關成纖維細胞特征的細胞方向分化，可能在上皮RGM-1 細胞中啟動EMT 過程，表明幽門螺旋桿菌屬具有誘導胃癌發生且影響轉移[25]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組中幽門螺旋桿菌屬豐度增加，經密點麻蜥干預后幽門螺旋桿菌屬豐度降低，表明密點麻蜥可降低幽門螺旋桿菌屬而抑制胃癌。

以上研究表明，密點麻蜥能夠通過降低轉錄因子SNAIL 蛋白表達，增加E-cadherin 蛋白表達，降低N-cadherin 蛋白表達而改變EMT 進程，發揮對胃癌肝轉移的抑制作用。同時可能通過調節腸道菌群穩態平衡，增加產生SCFAs 菌群厚壁菌門豐度，降低致癌菌屬幽門螺桿菌豐度，調節機體免疫和SCFAs 相關菌屬（擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、副細菌屬）的豐度，發揮對胃癌的抑制作用。

本研究基于SNAIL 信號通路影響EMT 及調節腸道菌群，闡釋了密點麻蜥從多途徑多靶點對胃癌肝轉移的抑制作用及機制，為密點麻蜥治療胃癌肝轉移提供一定的實驗證據，下一步將從通路-SCFAs-SCFAs 相關菌群，宏基因層面進一步揭示密點麻蜥多途徑、多靶點治療胃癌的作用機制。此外，密點麻蜥作為蜥蜴科的動物藥，目前藥物提取和成分鑒定一直是一個難題。本課題組前期與南京中醫藥大學段金廒教授合作對復方蜥蜴散在動物體內的代謝產物進行初步鑒定，由于相關藥物研究較少尚未查詢到可以做質譜的對照品，具體蜥蜴成分仍未明確。目前課題組仍在進行密點麻蜥單味提取及成分鑒定工作。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突