左金丸治療寒熱錯雜型潰瘍性結腸炎的臨床觀察及機制研究

★ 吳麗紅 李冰瑩 徐志強 胡家麗 崔曼曼 肖宵 占傳宇 肖曾華 張磊昌（.江西中醫藥大學 南昌 330004；.江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以黏膜炎癥和潰瘍為特征的慢性復發性疾病，病位多在結腸與直腸［1］。常見表現為腹瀉、腹痛、血液黏性樣便，伴全身乏力、食欲不振、發熱等［2］。該病反復發作，遷延難愈，近20 年來UC 發病率顯著增加，是世界衛生組織認可的難治病之一［3］。目前UC 的病因尚不明確，部分學者認為免疫失衡作為重要原因，與基因突變、遺傳易感、腦腸軸紊亂相結合貫穿UC 發病的始終［4］。研究證明PI3K/AKT/mTOR 信號通路參與了UC 發展的關鍵節點［5-7］，通過抑制PI3K/AKT 通路中相關蛋白的磷酸化水平，可以減少UC 中炎癥介質的釋放，改善腸黏膜損傷［8］；而mTOR 作為AKT 下游重要的效應學分子，對調控細胞增殖、炎癥反應具有重要影響［9］。

潰瘍性結腸炎的臨床主要用藥為5-氨基水楊酸類藥物、糖皮質激素與免疫抑制劑。這些藥物能夠暫時緩解疾病癥狀，但是長期使用會導致不良反應，如藥物依賴性，腎毒性，感染風險增加等［10］。中醫藥治療UC 具有很大的優勢，既能長期維持緩解期并降低復發率，又能減少胃腸道反應，不易造成并發癥。有較多動物實驗及臨床研究證實了左金丸對UC 具有治療作用［11-16］，我們運用左金丸治療UC，是取其“寒溫并用、辛開苦降”的組方配伍特點［17］。左金丸藥理作用廣泛，有較顯著的抑菌與抗炎作用，可以增加CD8+T 細胞［18］。吳甜甜等［16］通過動物實驗發現左金丸可以通過抑制JAK1/STAT3信號通路從而調節中樞免疫記憶性T 細胞與效應免疫記憶性T 細胞之間的平衡，進而治療UC。本研究是為了討論左金丸治療寒熱錯雜型潰瘍性結腸炎的效果，并運用RT-PCR 檢測血清中PI3K、AKT 和mTOR mRNA 表達，初步探討左金丸通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路調節炎癥因子水平，進而治療UC?，F將此次研究所得作以下結果可供參考。

1 研究資料與方法

1.1 研究對象

以尊重受試者隱私及受試者自愿為原則，招募2020 年10 月－2021 年10 月在江西中醫藥大學附屬醫院肛腸科住院的潰瘍性結腸炎患者48 例。2 組患者性別、年齡、病程、病情輕重程度見表1。所有患者均依照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018 年北京）》［19］活動期輕中度UC 的診斷標準：（1）臨床表現主要為膿血便、里急后重、肛門灼熱等，癥狀持續或反復發作；（2）結合腸鏡檢查和黏膜組織學檢查，排除感染性和其他非感染性結腸炎后確診；（3）改良Mayo 評分為3～10 分。排除標準：（1）病情屬于重度者或者處于緩解期；（2）近3 個月或正在使用激素治療或者生物制劑者；（3）合并嚴重并發癥者，如腸梗阻、中毒性巨結腸、腸上皮癌變、腸穿孔等；（4）處于妊娠期或者哺乳期的婦女；（5）合并嚴重肝功能、腎功能不全及嚴重心腦血管疾病者；（6）目前正在參加其他臨床試驗者。寒熱錯雜證型診斷標準參照《潰瘍性結腸炎中西醫結合診療共識意見》［20］制定，主癥：（1）腹瀉，便下黏液膿血；（2）腹痛；（3）肛門灼熱；（4）黏液膿血便。次癥：（1）畏寒怕冷；（2）口渴不欲飲；（3）饑不欲食；（4）里急后重。符合主癥其中的2 項，次癥其中的2 項，即可診斷。

表1 2組患者基線資料比較（s，n=24）

表1 2組患者基線資料比較（s，n=24）

研究對象按照隨機數字表法分為對照組及觀察組，各24 例，2 組患者性別、年齡、病程、病情輕重程度均無統計學差異（P>0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

實驗藥物對照組予美沙拉嗪腸溶片（葵花藥業集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，國藥準字H19980148，規格：0.25 g），每次1 g，每天3 次；觀察組予左金丸（江西省中醫院制劑室）治療，黃連30 g，吳茱萸5 g，若見患者腹瀉嚴重，則酌情將黃連用量減至15 g；胸悶少食、便溏者，則在原方基礎上加黨參10 g、陳皮9 g、白術9 g；噫氣不暢，口苦口干伴胃中灼熱者，加柴胡9 g、香附9 g、川楝子6 g；心中煩熱伴里急后重者，加白頭翁9 g、敗醬草9 g。服用方法：水煎服，水煮300 mL，每日2劑，每劑150 mL，分早晚溫服。2 組療程均為8 周，隨訪3 個月。

實驗儀器與試劑：RT-PCR 儀（Eppenndorf Centrifuge公司，德國）；RT-PCR 引物（上海生工生物工程）；低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；96 孔板（耐思，中國）。

2 觀察指標

2.1 主要療效指標

臨床總有效率參照《潰瘍性結腸炎中醫診療專家共識（2017 年）》，總有效率＝（臨床緩解+臨床有效）/該組總人數×100%。其中臨床有效的評價標準為總Mayo 評分相對于基線值的降幅≥30%及≥3 分，且便血的分項評分降幅≥1 分或該分項評分為0 分或1 分；臨床緩解的評價標準為總Mayo評分≤2 分且無單個分項評分＞1 分；臨床無效的評價標準為總Mayo 評分較基線值無下降。

2.2 次要療效指標

（1）中醫證候療效評價：依照《潰瘍性結腸炎中西醫結合診療共識意見》，觀察腹瀉、黏液膿血便、腹痛、四肢倦怠、里急后重5 個單項癥狀，按照病情輕重程度分別賦值0，2，4，6 分，于治療前后分別評估4 個單項癥狀并進行對比。（2）改良Mayo 評分：主要由排便次數、便血程度、內鏡下情況及醫師總體評價四部分內容構成，總分為0～12 分。見表2。

表2 改良Mayo評分表

（3）Baron 內鏡評分標準按照黏膜圖像的病變程度分別賦值0，1，2，3 分。（4）理化指標檢測患者血清中C 反應蛋白測定（CRP)、血沉（ESR)、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6），并分別進行前后及橫向對比。（5）RT-PCR 法檢測PI3K mRNA、AKT mRNA 和mTOR mRNA 的表達采用Trizol 法提取外周血單個核細胞（PBMCs）中的總RNA，紫外分光度法測定其濃度，再將其逆轉錄為cDNA，按PCR 試劑盒進行擴增，反應條件為95 ℃變性10 s，退火60 ℃30 s，循環40 個，用β-actin 作為內參，基因引物序列。見表3。

表3 基因引物序列

（6）復發率依照2018 年《炎癥性腸病診斷與治療共識意見》，調查患者治療結束3 個月后疾病復發情況。判定標準如下：緩解期后再度出現腹瀉、腹痛、黏液膿血便等情況且在腸鏡下發現活動性炎癥。復發率＝復發例數/總例數×100%。

3 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組內比較采用配對資料t檢驗，組間比較采用χ2檢驗，計數資料以頻數（百分比）率表示，P<0.05 代表差異有統計學意義。

4 研究結果

4.1 2 組患者臨床療效比較

經過8 周治療后2 組患者臨床療效比較，差異具有統計學意義（P=0.033）。見表4。

表4 2組治療前后臨床療效比較（n=24） 例

4.2 2 組患者治療前后中醫證候各項評分比較

經過8 周治療，同組治療后患者腹瀉、黏液膿血便、腹痛、四肢倦怠和里急后重積分均顯著下降（P<0.05）。觀察組患者腹瀉、黏液膿血便、四肢倦怠和里急后重積分下降情況低于對照組（P<0.05），可以證明左金丸治療腹瀉、黏液膿血便、四肢倦怠和里急后重有明顯效果。觀察組患者腹痛積分與對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05），說明在腹痛改善方面，單純西醫治療和中醫治療效果相似。見表5。

表5 2組治療前后中醫證候各項評分比較（=24） 分

表5 2組治療前后中醫證候各項評分比較（=24） 分

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，*#P<0.05。

4.3 2 組患者治療前后腸鏡評分及改良Mayo 評分比較

經過8 周治療，2 組治療后患者腸鏡評分與改良Mayo 評分均顯著下降（P<0.05），腸鏡下黏膜出血情況均有明顯好轉，且觀察組患者與對照組相比腸鏡評分及改良Mayo 評分均降低（P<0.05）。見圖1、表6。

圖1 2組治療前后腸鏡下圖片比較

表6 2組治療前后腸鏡結果及改良Mayo評分比較s，n=24） 分

表6 2組治療前后腸鏡結果及改良Mayo評分比較s，n=24） 分

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

4.4 2 組患者治療前后CRP 及ESR 水平變化比較

2 組治療后CRP 及ESR 水平均下降（P<0.05），且觀察組患者的CRP 及ESR 水平與對照組相比較均降低（P<0.05）。見表7。

表7 2組治療前后CRP及ESR水平比較s，n=24）

表7 2組治療前后CRP及ESR水平比較s，n=24）

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

4.5 2 組患者治療前后TNF-α 及IL-6 水平變化比較

經過8 周治療，同組TNF-α 及IL-6 水平均下降（P<0.05），觀察組患者的TNF-α 及IL-6 水平與對照組相比均降低（P<0.05），表明左金丸在降低炎癥水平、修復受損的腸黏膜方面有顯著療效且優于單純西醫治療。見表8。

表8 2組治療前后TNF-α及IL-6水平比較s，n=24） nmol/L

表8 2組治療前后TNF-α及IL-6水平比較s，n=24） nmol/L

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

4.6 2 組患者治療前后PI3K mRNA、AKT mRNA和mTOR mRNA 表達水平比較

同組治療后PI3K mRNA、AKT mRNA 和mTOR mRNA 的表達水平均下降（P<0.05），且觀察組患者的PI3K mRNA、AKT mRNA 和mTOR mRNA 的表達水平與對照組比較均降低（P<0.05）。見圖2、圖3、圖4。

圖3 2組治療前后AKT mRNA表達水平

圖4 2組治療前后mTOR mRNA表達水平

4.7 2 組復發率比較

通過3 個月后對患者進行復查，發現對照組復發8 例，觀察組復發3 例，2 組之間具有差異性（P<0.05），說明觀察組復發率優于對照組。見表9。

表9 2組復發率比較（n=24） 例

5 討論

UC 是炎癥性腸病的主要亞型之一［21］，其致病因素主要包括環境、感染、免疫、心理因素幾個方面。研究表明，免疫應答失調導致的腸黏膜炎癥和腸上皮細胞損傷是UC 發病的關鍵環節［22］。中醫將UC 歸屬為“久痢”“痢疾”“泄瀉”“休息痢”“腸澼”“腸風”等范疇，常見病理因素為濕熱、熱毒、寒濕、氣滯、血瘀、瘀熱、痰濁、食積，各種因素相互錯雜［23］?！稘冃越Y腸炎中醫診療專家共識意見（2017）》將本病分大腸濕熱、熱毒熾盛、脾虛濕阻、脾腎陽虛、寒熱錯雜、陰血虧虛、肝郁脾虛7 個證型，且由于本病虛寒熱并見，所以以寒熱錯雜型病證最為常見和棘手。左金丸作為一個中藥復方，出自《丹溪心法·火六》，由黃連與吳茱萸按6∶1 的比例組成，主治肝經火旺之證，黃連清熱燥濕解毒，在寒熱錯雜型UC 治療中起清熱燥濕的功效，吳茱萸散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉，可以治療UC 患者的泄瀉癥狀。兩藥相伍，起寒熱并用，切中中焦病機，使得氣機通暢的作用。文獻研究及大量臨床試驗［17,24-26］表明，在治療輕中度UC 時，不必拘泥于黃連、吳茱萸6∶1 的藥量比例，所以本次臨床觀察中，我們在治療以腹瀉、脾胃受損為主的病人時，酌情將黃連的藥量減至15 g，以達顧護病人脾胃之功。在具體的治療中，也注重該藥方的臨證加減。同時，藥理研究表明，左金丸中的藥物黃連的主要生物堿小檗堿，在對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎模型中有較高的預防活性［27］，它還可以顯著減少急性胃腸炎患者的大便頻次，使機型放射性腸綜合征的發生率降低。Cui 等［28］發現小檗堿具有調節腸道菌群的物質基礎，它可以增加結腸炎大鼠腸道真桿菌和擬桿菌的比例，抑制脫硫弧菌的豐度，緩解腸道菌群的失衡，從而調節T17 和Treg 細胞的失衡。而吳茱萸中的主要生物堿吳茱萸次堿和喹諾酮類生物堿在抗炎、抗腫瘤、促進細胞凋亡和調節腸道菌群等方面起效從而達到治療腸炎的目的［29-30］。在寒熱錯雜型潰瘍性結腸炎中運用此方，體現了兩個藥物之間“辛開”“苦降”相協同的治療機制。

本次研究結果顯示，經過8 周治療，與美沙拉嗪組相比，觀察組使用左金丸后，患者腹瀉、黏液膿血便、四肢倦怠、里急后重四項中醫證候緩解更為有效，腸道癥狀和血清理化指標改善更為明顯，且對臨床緩解期患者3 個月隨訪發現，觀察組的復發率更低，患者的生活質量得到顯著提高。以上結果證明UC 治療中左金丸的運用有效緩解了患者臨床癥狀，促進患者腸黏膜的愈合，降低疾病活動性。

基于本課題組的前期網絡藥理學研究，左金丸通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路在炎癥反應、分解代謝過程、血管生成及細胞凋亡等多種過程調節UC。PI3K 作為一種胞內磷脂酰肌醇激酶，參與細胞的增殖、分化、凋亡，與多中國癌癥聯系密切。AKT，是PI3K 下游的主要效應物， AKT 的活化會磷酸化多種下游因子，進而調節細胞的功能，且其可通過磷酸化下游靶蛋白進而發揮抗凋亡的作用。mTOR 是PI3K/AKT 下游的關鍵激酶，與腫瘤細胞的增殖、生長、存活和血管生成密切相關。PI3K/AKT/mTOR 信號通路是機體調節細胞增殖分化、凋亡、自噬的重要途徑，該通路的過度活化會促使腸上皮細胞大量增殖，引起腸道內炎癥因子失衡，導致UC 的發病。同時，炎癥的持續刺激也會使該通路過度活化［31］。激活該信號通路會影響重要促炎因子TNF-α 的基因轉錄，并進一步誘導其他炎癥介質如IL-6 的分泌，兩種炎癥介質的過度產生會導致細胞沉浸在慢性炎癥因子環境中，從而導致UC 遷延難愈［32］，所以抑制信號通路的活化與抑制炎癥因子和炎癥介質的產生和增長對治療UC 具有重要意義［33-34］。RT-PCR 結果可見，觀察組PI3KmRNA、AKTmRNA 和mTORmRNA 的表達顯著下調，表明左金丸可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路過度活化，來治療UC。同時，經過治療后TNF-α 和IL-6 水平降低，臨床癥狀好轉，也體現了促炎因子與該通路之間密切相關。

綜上，左金丸能夠顯著改善UC 患者的腸黏膜損傷，緩解患者臨床癥狀，降低疾病活動度，其作用機制可能與PI3K/AKT/mTOR 信號通路活化水平被抑制，從而炎癥介質分泌減少密切相關。