血清軟骨寡聚基質蛋白水平與膝骨關節炎發生發展的關系研究

劉昌海，王占朝，張豪杰，李蓉

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院骨科，上海 202150)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性退行性關節疾病，主要表現為關節軟骨的局灶性病變，并伴有軟骨下骨硬化和關節邊緣的新骨形成(骨贅)以及輕度、慢性非特異性炎癥性滑膜炎[1-2]。中國癥狀性膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)患病率約為8.1%，KOA的嚴重程度通常從放射學檢查的無癥狀、偶然發現到晚期失能障礙不等。嚴重的軟骨缺失導致KOA患者關節疼痛，僵直畸形和功能障礙，生活質量惡化，甚至死亡[3]。能夠反映疾病進展動態和定量變化的生物標志物對于減少KOA的不利影響具有相當重要的意義。軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)屬于血栓反應蛋白家族，是構成細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的一種重要蛋白[4]。既往研究發現COMP的表達與骨髓間充質干細胞的軟骨分化、軟骨外基質形成及維持軟骨細胞表型均有相關性，因此可能與KOA的疾病進展有關[5]，然而目前尚缺乏足夠的臨床證據。因此，本研究旨在通過觀察性研究分析血清COMP與膝關節癥狀、關節結構改變以及KOA患者軟骨或骨生物標志物之間的關系，從而為血清COMP的臨床應用提供有力的支持。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年4月至2019年3月期間在上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院骨科收治的雙側KOA患者255例(KOA組)作為研究對象，其中男168例，女87例；年齡28～85歲，平均年齡(59.77±11.01)歲。KOA患者根據《骨關節炎診治指南(2007年版)》[6]的癥狀標準和Kellgren-Lawrence(K/L)分級標準進行診斷。此外，研究對象還應符合以下納入標準：(1)K/L分級≥2級；(2)臨床和生化資料完整，且依從性良好，均知情同意本研究。排除標準：(1)合并膝關節手術史、創傷史、關節周圍骨折；(2)合并椎管狹窄病史、神經系統疾病或繼發性(炎癥或代謝)關節炎病史者；(3)合并惡性腫瘤，嚴重心、肝、腎功能障礙，痛風病史，感染或自身免疫性疾病者。對照組100例非KOA受試者從正在接受體檢的健康志愿者中選擇，其中男67例，女33例；年齡20～86歲，平均年齡(58.96±12.42)歲。根據經驗豐富的骨科醫生對膝關節進行臨床檢查，排除任何癥狀性或影像學OA證據。與KOA組比較，對照組年齡、性別構成具有可比性(P>0.05)。本研究為觀察性橫斷面研究，在獲得本院倫理委員會批準并遵循《赫爾辛基宣言》的前提下進行。

1.2 血清COMP水平檢測 受試者休息30 min后抽取5 mL外周靜脈血置于普通樣品瓶，然后于室溫下以3 000 rpm的速度離心15 min，取上層清液血清于普通樣品瓶中，儲存于-20 ℃條件下直至檢測。使用COMP酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒(BioVendor Laboratory Medicine，德國)，檢出限為0.4 ng/mL，批內及批間變異系數分別為4%、3.1%。將儲存的血清分成每孔0.1 mL等分，每孔預先包被生物素化的單克隆抗體。依次加入稀釋緩沖液、工作液、顯色劑，分別孵育90 min、60 min、20 min，共用洗滌液洗滌4次以去除未結合的抗體。使用設置為450 nm(Bio-Rad Laboratories，加拿大)的微孔板讀數器測定每個孔的吸光度。采用四參數算法，將標準品的平均吸光度(Y)與已知標準品濃度(X)以對數標尺繪制標準品的標準曲線的回歸方程式，將樣品的吸光度值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以各自的稀釋倍數，得到樣品中血清COMP的實際濃度(ng/mL)。

1.3 影像學評估 采用1957年K/L分級[7]量表對所有患者進行放射學評估，K/L分級為0級(正常表現)：無骨贅及正常關節間隙；K/L分級為1級(可疑)：微小骨贅，病理意義可疑；K/L分級為2級(輕度)：無關節間隙狹窄的骨贅；K/L分級為3級(中度)：關節間隙中度狹窄；K/L分級為4級(嚴重)：嚴重關節間隙狹窄伴軟骨下骨硬化。K/L分級1級、2級分為輕度組，3級、4級分為中重度組。

1.4 關節癥狀評估 所有受試者均完成了西安大略和麥克馬斯特大學(the Western Ontario and McMaster Universities，WOMAC)骨關節炎指數[8]問卷調查(包括疼痛、關節僵硬及日常活動，共有24個題目，每個題目均采用5級評分法進行評分)及Lequesne指數[9]問卷調查(包括疼痛或不適、最大步行距離和日常活動)，WOMAC疼痛評估分為負重性疼痛(平地行走、上下樓梯及直立行走時)、非負重性疼痛(夜間臥床或坐臥時)。

2 結 果

2.1 兩組受試者血清COMP水平比較 KOA組血清COMP水平為(2 492.40±1 071.80) ng/mL，對照組血清COMP水平為(1 426.05±932.93) ng/mL，KOA組顯著高于對照組(P<0.001)。經ROC曲線分析，血清COMP水平診斷KOA的AUC為0.789(0.733～0.845)，在最佳截斷閾值(1 785.65 ng/mL)下，靈敏度和特異性分別為68.91%和78.50%(見圖1)。

圖1 血清COMP水平診斷KOA的ROC曲線分析

2.2 KOA患者血清COMP水平與其他臨床特征的關系 根據KOA患者的血清COMP水平中位值，將KOA患者分為低水平組(<2 210.59 ng/mL)及高水平組(≥2 210.59 ng/mL)。經分析，高水平組患者合并吸煙史概率、疼痛持續時間、Ⅲ型前膠原氨基末端肽(PⅢNP)均高于低水平組，同時站起-走計時測試(TUG)時間低于低水平組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3 KOA患者血清COMP水平與WOMAC、Lequesne指數的關系 經Spearman秩相關分析，KOA患者血清COMP水平與WOMAC及Lequesne指數均呈正相關(r=0.195，0.393，P<0.05，見圖2)。校正年齡、性別、病程等混雜因素后，經多元線性回歸分析，KOA患者血清COMP水平與WOMAC-疼痛評分(β=2.85，95%CI=1.31～5.39，P=0.028)、WOMAC-關節功能評分(β=9.85，95%CI=4.33～17.29，P=0.034)及Lequesne指數(β=1.65，95%CI=1.24～2.99，P=0.015)仍存在正相關性。

圖2 KOA患者血清COMP水平與WOMAC、 Lequesne指數的Spearman相關性

2.4 KOA患者血清COMP水平與K/L分級的相關性 經Spearman秩相關系數分析，KOA患者血清COMP水平與K/L分級呈正相關(r=0.481，P<0.05)。輕度組共有151例患者，中重度組共有104例患者。根據KOA患者的血清COMP水平四分位數，分為Q1(<1 635.41 ng/mL)、Q2(1 635.41～2 210.59 ng/mL)、Q3(2 210.59～3 143.87 ng/mL)、Q4(>3 143.87 ng/mL)。經單變量回歸分析表明，所有研究對象中血清COMP水平分別在Q3和Q4區間時，K/L分級≥3級的風險分別增加4.333倍和11.980倍。在進一步校正年齡、性別等客觀干擾因素后，血清COMP水平分別在Q3和Q4區間時，KOA患者進展至K/L分級≥3級的風險分別增加2.091倍和5.682倍(P<0.001，見表2)。

3 討 論

本研究團隊人員前期調研查閱國內相關文獻后，發現本研究是目前國內最大樣本量的一項關于血清COMP作為KOA生物標志物的適用性研究。本研究結果表明，KOA患者血清COMP水平顯著高于對照組，并且血清COMP水平也隨著KOA的嚴重程度而增加。研究結果表明，血清COMP水平有可能成為KOA診斷、監測嚴重程度和評估疾病進展的候選分子。此外KOA患者血清COMP水平與WOMAC及Lequesne指數均呈正相關，說明血清COMP水平可以積極預測KOA的臨床和影像學水平，也進一步證實血清COMP可作為輔助影像學評估KOA患者病情進展程度的一種有效方法。

目前OA的發病率不斷上升，但其早期變化在影像學上表現不明顯，通常是在關節受損后才被確診。因此，靈敏的診斷方法用于早期診斷，可以延遲患者不可逆的關節損傷。各種潛在的OA疾病修正治療，如生物再生治療、軟骨成形

表1 不同血清COMP水平KOA患者一般臨床資料分析

表2 單變量和多變量模型分析KOA患者血清COMP水平與K/L分級進展的關系

術和自體軟骨細胞移植，有助于在患者出現不可逆骨和軟組織并發癥前，提高OA早期診斷和進展評估的準確率[10-11]。COMP是軟骨降解的非膠原生物標志物，也稱血栓反應蛋白5，最初從軟骨中分離，后續研究發現在軟骨和許多其他組織/細胞中也有表達[12]。已知COMP可參與膠原分泌和纖維生成，并與ECM的各種其他成分相互作用，如I、II、IX型膠原、基質蛋白3。雖然COMP基因突變與骨骼發育不良、假性軟骨發育不全和多發性骨骺發育不良有關，但野生型COMP表達改變和/或全身性釋放已在一些主要的年齡依賴性和退行性疾病中得到描述[13-15]。如Sandstedt等[13]發現COMP的降解與動脈粥樣硬化疾病進展中的炎癥反應有關，會產生特定的COMP片段；在肝纖維化相關研究中[14]，也發現循環COMP水平與膽道閉鎖患者的肝纖維化程度及生存率相關；在Saghafi等[15]的研究中，COMP與類風濕性關節炎早期及晚期的疾病嚴重程度均呈正相關。總體來講，COMP被認為是軟骨ECM周轉的一個非常具體的指標，在骨關節炎或類風濕性關節炎的關節退行性變期間，以及在過度體力活動或關節創傷導致的高負荷后COMP周轉率會升高[16-17]。

既往研究表明[18]，受損關節軟骨中的細胞有可能遷移到受損部位，導致這些區域的重新增殖。而COMP主要表達于軟骨結構損傷最嚴重的上軟骨區，COMP過表達可能是一種試圖吸引周圍軟骨細胞來重建缺損部位的信號，并且通過COMP和血小板反應蛋白-4的相互作用進一步誘導ECM維持、保護和軟骨修復機制。事實上，COMP被證明能夠吸引軟骨細胞并有助于其錨定[19]。這些研究都從分子機制方面解釋了血清COMP在OA病變中的作用。在本研究中，與對照組相比，KOA患者(KL分級≥2級)血清COMP水平顯著升高，表明血清COMP可作為KOA的診斷標志物；此外與輕度KOA組相比，中重度KOA組血清COMP水平進一步升高。與既往一些研究[16-17]不同的是KOA患者血清COMP升高與臨床疼痛癥狀及放射學改變均有關，這也突出了其作為預后生物標志物以及監測疾病進展的生物標志物的潛力。

綜上所述，本研究表明KOA患者血清COMP水平顯著高于健康受試者，且隨著KOA疾病嚴重程度的增加，血清COMP水平逐漸升高。血清COMP可能在KOA的發生發展中發揮重要作用，有望成為臨床診斷或疾病進展評估的潛在生物標志物。本研究的局限性在于缺少早期KOA患者數據，所有確診的KOA患者KL分級均≥2級，無法確定血清COMP水平是否在放射學軟骨損傷證據出現前已經表達上調。還應注意的是，大多數確診(晚期)KOA患者都患有雙側KOA，因此本研究納入的患者都為雙側KOA患者，進一步擴充單側KOA患者數據進行對比分析也是下一步工作的重點。