基于“LncRNA MALAT1-巨噬細胞焦亡”新視角探討加味四妙勇安湯促進大鼠糖尿病足潰瘍愈合機制

王慶美， 徐鵬， 付媛媛， 潘銀燕

（1.山東省立第三醫院，山東濟南 250031；2.解放軍第九六〇醫院，山東濟南 250031）

最新系統回顧性分析表明，糖尿病病程超過10年的患者易并發糖尿病足，而糖尿病足患者常常同時合并局部組織感染、皮膚病變、神經病變以及內皮血管病變，因此臨床治療難度較大；如果不及時進行妥善處理，則會加重患者病情，甚至導致截肢或者死亡[1-2]。但糖尿病及糖尿病足的病理機制至今尚未完全闡明。

隨著人類基因學研究技術的發展，長鏈非編碼RNAs（Long non-coding RNAs，LncRNAs）逐漸進入人們視野并且引起廣泛關注，被認為是糖尿病發病各個環節的關鍵調控因子[3]。LncRNA肺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1）在機體多種組織內廣泛表達，最初研究發現，MALAT1與腫瘤發展關系密切，近年研究表明，LncRNA MALAT1與糖尿病及糖尿病并發癥之間亦存在密切聯系。LncRNA MALAT1的沉默表達可以明顯緩解糖尿病誘導的視網膜血管化、血管的滲漏與視網膜炎癥等[4]。由此推斷其在糖尿病潰瘍愈合中可能亦發揮重要作用。

細胞焦亡（pyroptosis）是一種由病原體感染或者內源性損傷等引起的溶解性細胞死亡，可分泌多種炎癥細胞因子進而引發炎癥級聯反應[5]。對于感染性疾病，發生細胞焦亡是細胞自身的保護性反應，但是過度的細胞焦亡往往會引發組織進一步損傷及其他炎癥反應，甚至導致機體死亡。最新的研究[6-7]表明，巨噬細胞焦亡可以引發糖尿病足白細胞介素（IL）-18、IL-1β的釋放，導致不可控炎癥反應，促進糖尿病足的病理發展。

糖尿病足歸屬于中醫學“消渴”“脫疽”的范疇，致病機理不外乎氣虛、陰虛、氣血凝滯、火毒、濕熱等因素，常遵循去腐生肌、標本兼治的原則[8-9]。加味四妙勇安湯具有活血止痛、清熱解毒的功效，已經被證實在糖尿病足潰瘍愈合中起到積極作用。有學者指出，四妙勇安湯可以促進糖尿病足潰瘍患者創面血管的新生，促進創面愈合[10]；另外在常規內科治療的基礎上，服用加味四妙勇安湯對于小面積的糖尿病足部潰瘍有較好的促愈合效果[11]。但目前關于加味四妙勇安湯促創面愈合僅僅體現在臨床效果評比，而對于其治療的內在分子調控機制尚不明確。因此，本研究擬通過構建糖尿病足潰瘍大鼠模型，探討加味四妙勇安湯對LncRNA MALAT1-巨噬細胞焦亡軸的影響，以期闡明其在糖尿病足潰瘍愈合中的分子作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 40只SPF級6周齡雄性SD大鼠，體質量170～220 g，由山東省立第三醫院動物飼養中心提供，動物質量合格證號：110322211100491267。飼養環境：普通飼料單籠飼養，室溫控制在18～23℃，大鼠自由攝食、飲水。本動物實驗方案已獲得山東省立第三醫院動物倫理委員會審批通過。

1.2 藥物 加味四妙勇安湯組成：肉桂4.5 g，黃連8 g，薏苡仁27 g，土茯苓30 g，川牛膝13 g，丹參10 g，生甘草6 g，金銀花30 g，玄參10 g，當歸10 g，蒲黃8 g，垂盆草30 g。所有中藥材均購自山東省立第三醫院中醫藥藥房。將上述中藥材加水常規煮煎，取藥汁，備用。

1.3 試劑與儀器 LncRNA MALAT1敲除質粒siLncRNA MALAT1（上海生工生物工程股份有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司）；白細胞介素（IL）-18、IL-1β的酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（國藥化學試劑有限公司）；Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白3（NLRP3）抗體、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）抗體、CD206抗體、消皮素D（GSDMD）抗體、pro-Caspase-1抗體、核轉錄因子kappaB（NF-κB）p65抗體、磷酸甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Sigma公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定盒、十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠、電泳緩沖液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、增強化學發光（ECL）顯影試劑盒（美國ABC公司）。血糖測試儀（美國強生公司）；RT-PCR測試儀、RT-100酶標儀、Mini PRO型電泳儀及轉膜儀、電泳槽、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；臺式高速離心機、微量可調節儀器（美國Beckman公司）。

1.4 分組與造模[12-13]將40只SD大鼠隨機分為2組，正常組10只，2型糖尿病造模組30只。2組大鼠實驗前均禁食24 h，2型糖尿病造模組大鼠于左下腹部一次性腹腔注射65.0 mg/kg STZ（由pH4.2檸檬酸鈉緩沖溶液配制成10 mg/mL溶液），正常組左下腹部一次性腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖溶液。1周后，2型糖尿病造模組大鼠均出現多飲、多尿的現象，尾靜脈抽血檢測空腹血糖，若空腹血糖為12.0 mmol/L及以上則判斷2型糖尿病模型構建成功。然后于上述符合要求的大鼠足背部切除一塊矩形區域的皮膚組織，建立糖尿病足潰瘍模型。最后將糖尿病足潰瘍模型大鼠分為模型組、siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組，每組10只。

1.5 給藥 造模結束后開始給藥。加味四妙勇安湯組大鼠給予加味四妙勇安湯20.0 g·kg-1·d-1[14]灌胃，每日1次，共8周；siLncRNA MALAT1組大鼠于足部潰瘍組織注射siLncRNA MALAT1慢病毒質粒（2×1010pfu，0.5 mL/只），每日1次，連續注射1周；模型組與正常組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，共8周。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 觀察大鼠足潰瘍創面組織愈合情況 給藥前，給藥4、8周后，觀察大鼠足潰瘍創面組織血管、炎癥、面積等變化情況。

1.6.2 計算大鼠足潰瘍創面愈合面積百分比 給藥前、給藥8周后，采用計算機處理的透明膜適蹤法紀錄大鼠足潰瘍部位，測量創面面積，計算創面愈合面積百分比，創面愈合面積百分比=（創面初始面積-創面殘余面積）/創面初始面積×100%。

1.6.3 ELISA法檢測大鼠血清IL-18、IL-1β水平 給藥8周后12 h禁食，摘眼球取血，室溫下靜置2.5 h，4℃離心分離上清液。設定ELISA各孔位，按照試劑盒說明書步驟進行操作，應用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔內光密度（OD）值，繪制標準曲線，計算血清中IL-18、IL-1β含量。

1.6.4 免疫熒光化學染色法檢測足部組織M2巨噬細胞標志蛋白（CD206）、ASC、NLRP3表達 取正常組大鼠足背部正常皮膚組織和其他各組大鼠足潰瘍創面組織，制備石蠟切片，脫蠟脫水，抗原修復，血清封閉。加入稀釋的CD206抗體（體積比1∶100）、ASC抗體（體積比1∶100）、NLRP3（體積比1∶100），4℃孵育過夜。用磷酸鹽-Tween-20緩沖液（PBST）沖洗后，滴加DAPI避光顯色5 min，沖洗后復染細胞核，用含抗熒光淬滅劑的封液進行封片。在熒光顯微鏡下觀察采集的圖像，測量積分光密度（IOD）和面積（Area）并計算出平均光密度（AOD）值，AOD=IOD/Area。

1.6.5 實時聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測足部組織LncRNA MALAT1表達 取正常組大鼠足背部正常皮膚組織和其他各組大鼠足潰瘍創面組織，采用TRIzol試劑盒抽提總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA合成cDNA，按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書配制反應體系，采用2-ΔΔCt值表示LncRNAMALAT1的表達水平。LncRNA MALAT1上游引物序列為5’-ATTGGGTCCTGGACCTGGAATG C-3’，下游引物序列為5’-ACTGGCTGGACCCTG GAAATCTG-3’；GAPDH上游引物序列為5’-TCG TGGACCTGACCTGGACCTGAAACTG-3’，下游引物序列為5’-ATCTCCTTCCTGGAACTGGACCTGG C-3’。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應條件：95℃預變性5 min，循環1次；95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環40次。

1.6.6 Western Blot法檢測足部組織細胞焦亡關鍵蛋白表達 取正常組大鼠足背部正常皮膚組織和其他各組大鼠足潰瘍創面組織，加入RIPA裂解液后進行組織勻漿裂解，提取蛋白質，定量、上樣，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，將檢測蛋白轉移到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉2.5 h，TBST清洗3次；將PVDF膜與一抗在4℃孵育過夜，用TBST清洗3次；PVDF膜與熒光二抗孵育1.5 h，經TBST清洗3次。采用紅外成像系統進行掃描，采用ImageJ軟件進行灰度分析。其中，一抗GSDMD稀釋體積比例為1∶1 000、NLRP3為1∶500、pro-Caspase-1為1∶500、NF-κBp65為1∶1 000、GAPDH為1∶1 000。

1.7 統計方法 采用GraphPad Prism8.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠足潰瘍創面愈合情況比較 圖1結果顯示：治療前，各組大鼠足潰瘍創面布滿充血血管，炎癥膿性反應明顯；隨著治療時間的延長，各組大鼠創面面積減小，其中，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組大鼠創面面積較模型組減小。

圖1 各組大鼠治療前后足潰瘍創面愈合情況比較（×50）Figure 1 Comparison of wound healing of foot ulcers among various groups of rats before and after treatment（×50）

2.2 各組大鼠足潰瘍創面愈合面積百分比比較表1結果顯示：各組大鼠治療8周后，足潰瘍創面愈合面積百分比較治療4周后明顯升高（P＜0.05）；與模型組同期比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組大鼠足潰瘍創面愈合面積百分比升高（P＜0.05）；2個治療組間該指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠足潰瘍創面愈合面積百分比比較Table 1 Comparison of the percentage of wound healing area of foot ulcers among various groups of rats （±s，%）

表1 各組大鼠足潰瘍創面愈合面積百分比比較Table 1 Comparison of the percentage of wound healing area of foot ulcers among various groups of rats （±s，%）

注：①P＜0.05，與同組治療4周后比較；②P＜0.05，與模型組同期比較

組別模型組siLncRNAMALAT1組加味四妙勇安湯組鼠數/只10 10 10創面愈合面積百分比治療4周后24.78±2.34 43.68±3.24②47.08±3.78②治療8周后38.90±4.23①68.90±4.55①②75.46±8.63①②P值0.045 0.020 0.008

2.3 各組大鼠足部組織LncRNA MALAT1表達比較 表2結果顯示：與正常組足背部正常皮膚組織比較，模型組大鼠足潰瘍創面組織LncRNA MALAT1表達水平明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組LncRNA MALAT1表達水平均下降（P＜0.05）；2個治療組間該指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠足部組織LncRNA MALAT1表達比較Table 2 Comparison of tissue LncRNA MALAT1 expression in the feet among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠足部組織LncRNA MALAT1表達比較Table 2 Comparison of tissue LncRNA MALAT1 expression in the feet among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組siLncRNA MALAT1組加味四妙勇安湯組鼠數/只10 10 10 10 LncRNA MALAT1（2-ΔΔCt）0.428±0.017 1.344±0.233①0.785±0.150②0.640±0.102②

2.4 各組大鼠血清中IL-18、IL-1β水平比較 表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清IL-18、IL-1β水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組血清IL-18、IL-1β水平均下降（P＜0.05）；2個治療組間各指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清中白細胞介素（IL）-18、IL-1β水平比較Table 3 Comparison of IL-18 and IL-1βlevels in serum among various groups of rats （±s，ng·L-1）

表3 各組大鼠血清中白細胞介素（IL）-18、IL-1β水平比較Table 3 Comparison of IL-18 and IL-1βlevels in serum among various groups of rats （±s，ng·L-1）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組siLncRNAMALAT1組加味四妙勇安湯組鼠數/只10 10 10 10 IL-18 3.26±1.52 25.08±4.59①19.44±3.21②14.55±3.40②IL-1β 13.82±4.55 63.45±11.78①50.67±6.78②44.35±5.22②

2.5 各組大鼠足部組織M2巨噬細胞標志蛋白（CD206）、ASC、NLRP3表達水平比較 表4結果顯示：與正常組足背部正常皮膚組織比較，模型組大鼠足潰瘍創面組織ASC、NLRP3蛋白表達水平均明顯上升，CD206蛋白表達水平下降（均P＜0.05）；與模型組比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組ASC、NLRP3蛋白表達水平下降，CD206表達水平上升（P＜0.05）；2個治療組間各指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。提示LncRNA MALAT1敲除及加味四妙勇安湯灌胃均可以上調糖尿病大鼠足潰瘍創面組織M2型巨噬細胞比例，同時下調巨噬細胞內細胞焦亡關鍵因子的表達，抑制巨噬細胞焦亡能力。

表4 各組大鼠足部組織M2巨噬細胞標志蛋白（CD206）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白3（NLRP3）平均光密度比較Table 4 Comparison of the average optical density of tissue M2 macrophage marker protein（CD206），ASC and NLRP3 in the feet among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠足部組織M2巨噬細胞標志蛋白（CD206）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白3（NLRP3）平均光密度比較Table 4 Comparison of the average optical density of tissue M2 macrophage marker protein（CD206），ASC and NLRP3 in the feet among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組siLncRNA MALAT1組加味四妙勇安湯組鼠數/只10 10 10 10 CD206平均光密度0.254±0.012 0.012±0.002①0.155±0.014②0.187±0.019②ASC平均光密度0.023±0.003 0.438±0.017①0.245±0.010②0.203±0.016②NLRP3平均光密度0.014±0.003 0.489±0.021①0.288±0.012②0.187±0.018②

2.6 各組大鼠足部組織GSDMD、NLRP3、pro-Caspase-1、NF-κBp65蛋白表達比較 圖2結果顯示：與正常組足背部正常皮膚組織比較，模型組大鼠足潰瘍創面組織GSDMD、NLRP3、pro-Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達水平均明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組GSDMD、NLRP3、pro-Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達水平均下降（P＜0.05）；2個治療組間各指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。提示LncRNA MALAT1敲除及加味四妙勇安湯灌胃均可以下調大鼠足潰瘍創面組織內細胞焦亡蛋白表達，抑制細胞焦亡的發生。

圖2 各組大鼠足部組織消皮素D（GSDMD）、Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白3（NLRP3）、pro-Caspase-1、核轉錄因子kappaB（NF-κB）p65蛋白表達比較Figure 2 Comparison of protein expressions of tissue GSDMD，NLRP3，pro-Caspase-1 and NF-κB p65 in the feet among various groups of rats

3 討論

中醫學認為，糖尿病足主要是由于消渴日久，氣陰兩虛，熱毒、瘀血積聚而導致脈絡氣血運行不暢、肢端失養所致，祛腐生肌、化瘀通脈、清熱解毒以及標本兼治為主要治療方法[15-17]。加味四妙勇安湯具有活血化瘀、清熱解毒的功效，方中：黃連、肉桂解毒止痛、助陽，川牛膝可以直達病灶部位，消腫散結，丹參、蒲黃化瘀止痛，甘草、當歸、金銀花、玄參活血止痛、清熱解毒，薏苡仁、土茯苓、垂盆草清熱除濕解毒。本研究結果表明，加味四妙勇安湯可有效促進糖尿病大鼠足潰瘍創面愈合。

研究[18]表明，LncRNA MALAT1參與糖尿病及其并發癥的發生及發展過程。糖尿病患者血清LncRNA MALAT1表達明顯升高[19]；內皮細胞沉默LncRNA MALAT1后，其炎性因子IL-6、TNF-α及細胞黏附因子等水平均下降[20]；高血糖引起的視網膜病變內皮細胞中LncRNA MALAT1表達亦明顯上升[21]。IL-18是活化的單核巨噬細胞分泌的一種前炎癥因子，在2型糖尿病的發生發展過程中起中心介質作用，在2型糖尿病前期即出現升高，可作為2型糖尿病發生、病情變化及預后的預測因子[22]。IL-1β是NLRP3炎性小體活化后產生的主要炎性分子。IL-1β在2型糖尿病的發生發展中發揮重要作用，被認為是2型糖尿病的重要驅動者。在慢性高血糖狀態下，機體內IL-1β持續升高，其受體表達上調，既可引起β細胞凋亡及胰島素抵抗，又可和其他炎性因子如腫瘤壞死因子（TNF）等協同干擾體內葡萄糖代謝平衡[23]。而糖代謝紊亂作為危險信號，進一步激活IL-1β的平臺NLRP3炎性小體[22]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠足潰瘍創面組織LncRNA MALAT1表達升高，血清炎癥因子IL-18、IL-1β、NLRP3水平升高，而加味四妙勇安湯的干預可以明顯下調足潰瘍創面組織LncRNA MALAT1的表達，降低血清IL-18、IL-1β、NLRP3水平，表明足潰瘍創面組織存在明顯的炎癥反應，加味四妙勇安湯抑制糖尿病足潰瘍大鼠創面炎癥反應主要是通過抑制LncRNA MALAT1的表達來實現。

適度的炎癥反應對機體產生保護作用，若炎癥反應發生級聯放大出現失控，則會導致機體自身免疫系統的破壞，促進疾病的發展。炎癥小體本質上屬于多聚蛋白復合物，是控制炎癥反應進程和協調機體免疫功能的信號平臺，最新證據[24-25]表明，炎癥小體NLRP3所介導的細胞焦亡在糖尿病足發生及發展中扮演了重要的角色。在巨噬細胞焦亡過程中，炎癥小體活化是必要因素，諸多危險性信號如內毒素（LPS）、活性氧（ROS）產生、溶酶體破裂等均可以被巨噬細胞胞漿內的感受器（NOD-like receptors，NLR）感知并且識別，進而引起IκB發生磷酸化，調控下游的NF-κB入核，而NF-κB是誘導IL-1β和NLRP3蛋白合成的關鍵性因子，為進一步炎癥小體的組裝提供原材料。ASC是一種由2個“死亡折疊”結構域組成的蛋白，擁有上述結構域的ASC可以作為接頭蛋白將通路上游的炎癥傳感器分子進行組裝成完整的炎癥小體，參與細胞焦亡[25-26]。GSDMD蛋白是Caspase-1和細胞焦亡主要的底物成分之一，與細胞焦亡亦密切相關[27]。本研究結果顯示，糖尿病足潰瘍模型建立后，足潰瘍創面組織NF-κB p65、IL-1β、pro-Caspase-1、NLRP3、ASC、GSDMD等細胞焦亡關鍵因子表達均明顯上調，提示糖尿病足潰瘍的發病與巨噬細胞焦亡密切相關。而LncRNA MALAT1敲除及加味四妙勇安湯干預均可以抑制足潰瘍創面組織NF-κBp65、IL-1β、pro-Caspase-1、NLRP3、ASC、GSDMD等細胞焦亡關鍵因子上調的趨勢，下調其表達，提示LncRNA MALAT1參與糖尿病足潰瘍大鼠創面巨噬細胞焦亡過程，且受加味四妙勇安湯調控。

CD206是M2型巨噬細胞的特異性標志物，其表達量可以反映M2型巨噬細胞的組分及比例[28]。本研究結果顯示，糖尿病足潰瘍模型大鼠CD206表達較正常組明顯下降，表明模型建立后所蓄積的炎癥反應可能是M2型巨噬細胞向M1型轉化所致。M2型巨噬細胞數量減少導致促炎性的NLRP3、NF-κB表達上調，進一步招募ASC參與NLRP3的合成，這亦說明，糖尿病足潰瘍模型大鼠創面組織巨噬細胞發生了焦亡反應。給予加味四妙勇安湯干預后，創面組織LncMALAT1表達受到抑制，使得CD206表達比例提升，巨噬細胞向M2抗炎型轉化，NLRP3、NF-κB表達減弱，巨噬細胞焦亡比例降低，進而減少炎性因子IL-18、IL-1β的釋放，最終促進大鼠糖尿病足潰瘍創面的愈合。

綜上所述，加味四妙勇安湯可通過下調創面組織LncRNA MALAT1表達抑制巨噬細胞焦亡，從而促進糖尿病足潰瘍的愈合，效果顯著，值得進一步推廣應用。