金蓉顆粒通過雌二醇/活性氧簇/核轉錄因子E2相關因子2通路抑制乳腺癌進程的機制研究

李東梅， 陳青青， 陳丹丹， 韋任雄， 周若鵬， 林毅， 陳前軍

（1.廣東省中醫院珠海醫院，廣東珠海 519000；2.廣東省中醫院，廣東廣州 510120；3.普寧市中醫院，廣東揭陽 515343；4.廣州奇績醫藥科技有限公司，廣東廣州 510663）

女性乳腺癌已超過肺癌，成為全球癌癥發病率第一的癌癥，同時為全球第五大癌癥死亡原因[1]。預防乳腺癌轉移，降低其死亡率，是一項世界范圍的重要研究課題。研究表明，長期暴露于雌激素會增加乳腺癌變的幾率[2]，活性氧簇（ROS）在腫瘤進展中發揮著重要作用，調控細胞生長、凋亡與癌變[3-4]。轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）是細胞防御氧化應激的核心調節因子，可激活抗氧化劑反應元件，上調抗氧化酶和肽的表達，促進內源性抗氧化劑的生成，提高細胞抗氧化應激能力[5]，在腫瘤活性代謝物異?；蜓趸瘧p傷時發揮保護作用，預防腫瘤細胞的發生、轉移[6-11]。因此，激活ROS/Nrf2通路是抑制腫瘤生長與轉移的重要思路和潛在靶點[12-15]。

乳腺癌歸屬于中醫學“乳巖”“乳石癰”等范疇，肝氣郁結、沖任失調是乳腺癌發生發展的重要病機[16-18]。研究[19-20]表明，沖任失調與雌激素分泌及代謝紊亂密切相關。金蓉顆粒為中藥復方制劑，是國醫大師林毅教授在消癖口服液系列的基礎上研制而成，由淫羊藿、肉蓯蓉、郁金、丹參、莪術、益母草、制何首烏、女貞子、鱉甲、牡蠣等組成，具有調攝沖任、疏肝解郁之功效。既往研究發現，消癖口服液系列可逆轉乳腺的不典型增生，同時對雌激素亦有良好的調節作用[21-24]。因此，本研究從雌二醇（E2）/ROS/Nrf2通路角度出發，觀察金蓉顆粒對乳腺癌發展的抑制作用及機制，以期為其臨床應用治療乳腺癌提供科學依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 12只SPF級雌性MMTV-PyMT小鼠，3～4周齡，體質量20～25 g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動物質量合格證號：SCXK（粵）2013-0085。本實驗在廣東省中醫藥工程技術研究院動物實驗室完成，SPF飼養環境及飼料均符合國家標準。本實驗方案已獲得廣東省中醫院實驗動物倫理委員會審查通過（批準號：2018031）。

1.2 試劑與儀器 過氧化氫酶（CAT）活性、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）以及雌二醇（E2）等檢測試劑盒，均購自南京建成生物公司；活性氧簇（ROS）檢測試劑盒（泉州九邦生物公司）；兔抗Nrf2抗體、兔抗血紅素加氧酶1（HO-1）抗體、兔抗NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）抗體以及層黏連蛋白（Laminin）抗體，均購自于美國Cell Signaling Technology（CST）公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（美國Beyotime公司）；Nrf2、HO-1、NQO1及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的上下游引物均由廣州市銳博生物科技有限公司合成。倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；酶標儀（美國BioTek公司）；1-15K冷凍臺式離心機（德國Sigma公司）；高速勻漿儀（德國Eppendorf公司）。

1.3 藥物及制備 金蓉顆粒（原名“消癖顆?！保?，購自廣州奇績醫藥科技有限公司，批號：18090103，國藥準字Z20180002。60℃水浴，用生理鹽水充分溶解金蓉顆粒，制備成濃度12.5μg/μL，置于4℃冰箱中存儲。

1.4 實驗分組與干預 12只MMTV-PyMT小鼠被隨機分成2組，即模型組和金蓉顆粒組，每組6只。第4周開始藥物干預。金蓉顆粒組：給予0.5 mg·kg-1·d-1金蓉顆粒混懸液灌胃，小鼠給藥量基于前期研究[25]基礎，由成人臨床等效劑量計算所得；模型組：給予等體積生理鹽水灌胃。共給藥12周。實驗第9周和第15周（即給藥后第5、12周）后，每組隨機取3只小鼠取材。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 小鼠狀態監測 每天記錄2組MMTV-PyMT小鼠的飲食及毛發光澤等狀態。從第29天至第84天，每2 d稱量小鼠體質量。

1.5.2 標本的處理與觀察 治療結束后取材。麻醉后眼眶取血，收集血清存儲于-80℃冰箱。取出2組小鼠乳腺腫瘤組織和雙肺，記錄每組乳腺腫瘤數，稱量瘤體，將瘤體置于A4紙上拍照，記錄肺內轉移灶。最后將乳腺腫瘤組織、肺組織均分后分別置于液氮和10%多聚甲醛中儲存。

1.5.3 血清生化指標檢測 取出2組血清樣品，冰上或4℃融化，采用ELISA法檢測小鼠血清中E2、8-OHdG、SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC、ROS水平，具體步驟按說明書進行操作。

1.5.4 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察乳腺腫瘤組織、肺組織形態學變化 固定過的乳腺腫瘤組織、肺組織經脫水、透明、浸蠟和包埋后，將樣本制成4μm厚切片。常規HE染色后，比較2組乳腺腫瘤組織細胞形態、核大小，肺內轉移灶等情況，評估金蓉顆粒的療效。

1.5.5 免疫組織化學法檢測乳腺腫瘤組織中HO-1、Nrf2、NQO1和Laminin的表達水平 將各組乳腺腫瘤組織蠟塊進行石蠟切片，切取5μm厚的薄片，經過常規的脫蠟、脫水和抗原熱修復，山羊血清37℃封閉30 min，然后滴加Nrf2（1∶50）、HO-1（1∶200）、NQO1（1∶200）及Laminin（1∶500）一抗，4℃冰箱孵育過夜。PBS清洗3次后滴加辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶1 000），37℃孵育30 min，PBS沖洗3次。先滴加100μLDAB進行顯色5 min，后用蘇木素復染3 min，水沖洗至返藍。將切片置于70%～100%乙醇梯度脫水后二甲苯透片晾干，中性樹膠封片同時避免氣泡，自然晾干后拍照。以棕褐色染色為陽性表達。Nrf2陽性染色定位于細胞質和細胞核，HO-1陽性染色定位于內質網，NQO1陽性染色定位于細胞質及Laminin陽性染色定位于細胞外基質中。使用ImageJ軟件對每張切片3個不同的視野進行分析。以平均光密度（AOD=IODSUM/Area SUM）值用于量化HO-1、Nrf2、NQO1和Laminin的表達。

1.5.6 qRT-PCR法檢測Nrf2、HO-1及NQO1mRNA表達水平 TRIzol法提取乳腺腫瘤組織總RNA。應用一步法反轉錄試劑盒轉錄成cDNA并進行PCR擴增，反應體系25μL。引物序列如表1所示，采用SYBR Green I熒光染料法進行PCR實驗。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸34 s，變性到延伸進行40個循環，以GAPDH為內參，檢測各組Ct值。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.6 統計方法 采用SPSS 19.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示。當2組數據滿足正態性及方差齊時，采用t檢驗；當不滿足正態性或方差不齊時，選用非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金蓉顆粒對MMTV-PyMT小鼠體質量、腫瘤生長的影響 實驗第29～84天監測2組小鼠體質量變化，結果顯示，2組小鼠體質量均穩定增長，2組增長趨勢幾乎一致，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 2組MMTV-PyMT小鼠體質量比較Figure 1 Comparison of body mass between the two groups of MMTV-PyMT mice

第9周后取材時，模型組有3只小鼠可見乳腺自發腫瘤，金蓉顆粒組有3只小鼠未見瘤變；第15周后取材時，模型組和金蓉顆粒組小鼠均可見乳腺腫瘤。表2結果顯示，金蓉顆粒組乳腺的腫瘤數目低于模型組，表明金蓉顆?？裳泳廙MTVPyMT小鼠瘤變的形成。圖2結果顯示：金蓉顆粒組瘤體體積為（5.90±0.77）mm3，低于模型組（12.05±1.83）mm3，差異有統計學意義（P=0.001）；金蓉顆粒組瘤體質量為（0.04±0.03）g，低于模型組（0.18±0.05）g，差異有統計學意義（P=0.003）。提示金蓉顆粒可抑制乳腺腫瘤進展。

圖2 2組MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤體積、質量比較Figure 2 Comparison of breast tumor volume and mass between the two groups of MMTV-PyMT mice

表2 2組MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤數目比較Table 2 Comparison of the number of breast tumor between the two groups of MMTV-PyMT mice

2.2 金蓉顆粒對MMTV-PyMT小鼠體內血清生化指標的影響 圖3結果顯示：實驗第9周后，金蓉顆粒組小鼠體內E2和DNA氧化損傷生物標記物8-OHdG水平均有所降低，但與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；第15周后，金蓉顆粒組小鼠體內E2和8-OHdG水平均明顯降低，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 2組MMTV-PyMT小鼠血清雌二醇（E2）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）水平比較Figure 3 Comparison of serum levels of estradiol（E2）and 8-hydroxy-2 deoxyguanosine（8-OHdG）between the two groups of MMTV-PyMT mice

圖4結果顯示：第9周后，與模型組比較，金蓉顆粒組小鼠體內ROS水平顯著下降（P＜0.05），而SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC等抗氧化酶水平變化不顯著（P＞0.05）；第15周后，金蓉顆粒組小鼠體內ROS水平下降，抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC）水平上升，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 2組MMTV-PyMT小鼠氧化指標水平比較Figure 4 Comparison of oxidation index levels between two groups of MMTV-PyMT mice

以上結果表明，金蓉顆?？蓽p輕雌激素誘導癌變過程的氧化應激反應。

2.3 金蓉顆粒對MMTV-PyVT小鼠乳腺腫瘤組織形態學的影響 圖5結果顯示：第9周后，模型組表現為乳腺腺瘤（見圖5-A、圖5-B），金蓉顆粒組表現為乳腺輕度增生（見圖5-E、圖5-F）。放大倍數后可發現：模型組細胞核質比增大，細胞增殖填充并擴張緊密的腺泡和導管，原發腫瘤體積顯著增加（見圖5-B）；金蓉顆粒組細胞核質比稍增大，導管肌上皮細胞呈扁平狀（見圖5-F）。第15周后，金蓉顆粒組可見乳腺腺瘤病理表現（見圖5-G、圖5-H），模型組可見乳腺癌早期表現（見圖5-C、圖5-D）。放大圖中可觀察到，模型組腫瘤細胞呈多形性，而腫瘤腺泡則表現為輪廓模糊，另見腺泡周圍較多白細胞浸潤，血管生成顯著增加（圖5-D）。

圖5 2組MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤組織形態學變化比較（HE染色）Figure 5 Comparison of morphological changes of breast tumor tissue between the two groups of MMTV-PyMT mice（HE staining）

2.4 金蓉顆粒對MMTV-PyVT小鼠肺部轉移的影響 圖6結果顯示：第9周后，2組肺內均未見轉移灶。第15周后，金蓉顆粒組未發現轉移灶，模型組肺部發現數個轉移灶，腫瘤細胞核質比明顯增大，肺泡和肺導管正常結構消失。

圖6 2組MMTV-PyMT小鼠肺組織形態學變化比較（HE染色，×10）Figure 6 Comparison of histomorphological changes of lung tissues between the two groups of MMTV-PyMT mice（HE staining，×10）

2.5 金蓉顆粒對MMTV-PyVT小鼠乳腺腫瘤組織Laminin表達的影響 第15周后，模型組乳腺腫瘤組織中Laminin呈強陽性表達，而金蓉顆粒組中的Laminin呈陰性表達，見圖7。金蓉顆粒組Laminin的平均光密度值為（0.089±0.005），低于模型組（0.287±0.031），差異有統計學意義（t=10.709，P=0.000）。

2.6 金蓉顆粒對MMTV-PyVT小鼠乳腺腫瘤組織中Nrf2及下游分子表達的影響 第15周后，2組小鼠乳腺腫瘤組織中Nrf2、HO-1、NQO1的免疫組織化學染色結果見圖8。金蓉顆粒組Nrf2的平均光密度值為（0.126±0.016），高于模型組（0.091±0.007），差異有統計學意義（t=-3.374，P=0.028）；金蓉顆粒組HO-1的平均光密度值為（0.090±0.008），高于模型組（0.035±0.008），差異有統計學意義（t=-8.432，P=0.001）；金蓉顆粒組NQO1的平均光密度值為（0.141±0.018），高于模型組（0.081±0.005），差異有統計學意義（t=-5.097，P=0.007）。

圖8 2組MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤組織中Nrf2（A）、HO-1（B）及NQO1（C）免疫組化染色結果（第15周后）Figure 8 Immunohistochemical staining results of Nrf2（A），HO-1（B）and NQO1（C）in breast tumor tissue in the two groups of MMTV-PyMT mice（after week 15）

2.7 金蓉顆粒對MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤組織Nrf2及下游分子基因表達的影響 圖9結果顯示，第15周后，與模型組比較，金蓉顆粒組乳腺腫瘤組織中Nrf2及下游HO-1、NQO1 mRNA表達水平顯著上升（P＜0.05），提示金蓉顆?？杉せ頜MTVPyMT小鼠Nrf2通路，促進其下游HO-1、NQO1的表達。

圖9 2組MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤組織Nrf2、HO-1及NQO1 mRNA表達水平比較Figure 9 Comparison of mRNA expression levels of Nrf2，HO-1，NQO1 in breast tumor tissue between the two groups of MMTV-PyMT mice

3 討論

本研究結果證實了金蓉顆粒有抑制MMTVPyMT小鼠模型中乳腺自發腫瘤生長的作用。金蓉顆?？捎行б种颇[瘤生長，但對體質量無影響，說明金蓉顆粒在小鼠體內使用是相對安全的。

中醫學認為，乳腺癌主要是因肝氣郁滯、肝腎不足、沖任失調導致氣滯血瘀、痰凝毒聚于經絡而形成，其中，肝氣郁滯、沖任失調是其關鍵病機，沖任失調是其核心環節[16-18，26]。金蓉顆粒是國醫大師林毅教授根據中醫調理沖任理論研制的中藥創新藥，方中：肉蓯蓉、淫羊藿補腎助陽，郁金疏肝散結、活血止痛，三藥共為君藥，以達補腎助陽、疏肝活血、調攝沖任之功；莪術、丹參、益母草共奏疏肝活血之功，輔助君藥調攝沖任，共為臣藥；何首烏、女貞子、鱉甲補腎養血、滋陰潤燥，佐以調攝沖任；且鱉甲輔以牡蠣軟堅散結以治其標。全方共奏補腎助陽、疏肝活血、調攝沖任之效。藥理學研究表明，金蓉顆粒（淫羊藿、肉蓯蓉、郁金、丹參、莪術、益母草、制何首烏、鱉甲、牡蠣）中部分中藥淫羊藿、肉蓯蓉、郁金、莪術、女貞子、丹參的有效成分包括醌類、苷類、酚類、皂甙和生物堿等可以抑制乳腺癌或腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的周期阻滯或凋亡，抑制腫瘤的生長[27-33]，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移的作用[30，34-36]。郁金、丹參還可以通過調節Nrf2上游介質、Nrf2及其靶基因表達及Nrf2核易位等途徑激活Nrf2信號通路，保護細胞免受氧化損傷，發揮預防癌癥的作用[37-49]。

本研究結果表明，金蓉顆粒不僅能抑制MMTV-PyMT小鼠中乳腺自發腫瘤的生長，減少小鼠腫瘤發病數，還能延緩乳腺腫瘤進展，抑制乳腺腫瘤肺轉移的發生。乳腺腫瘤發生轉移的第一步是腫瘤細胞向周圍組織和血管侵襲。研究表明，中藥可通過下調轉移相關酶、抑制血管生成等途徑，抑制乳腺腫瘤細胞發生轉移[40]。乳腺癌肺轉移，涉及一個復雜的機制，其中，癌細胞來源的細胞外基質成分的功能起了積極作用，層黏連蛋白（Laminin）是細胞外基質成分的重要成員，能通過誘導的現象重塑腫瘤微環境促進癌細胞增殖，導致癌細胞更易發生侵襲、轉移，發生肺轉移[41]。本研究結果顯示，模型組的乳腺腫瘤組織中Laminin呈強陽性表達，而金蓉顆粒組中Laminin表達水平明顯下降，提示金蓉顆粒可以通過抑制乳腺腫瘤細胞衍生Laminin改變腫瘤微環境，達到抑制腫瘤細胞增殖及發生轉移的作用。

既往研究提示，雌激素與乳腺癌發病關系密切[42-43]，雌激素的過度氧化代謝產物可與DNA結合形成脫嘌呤加合物，造成DNA損傷，導致基因組不穩定，誘導基因突變[2，44-45]。核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）是細胞保護反應的主要調節因子，Nrf2的激活被認為有助于癌癥的預防，因為Nrf2的表達控制著許多抗氧化和抗炎反應細胞保護基因的表達，是對抗致癌物、ROS和其他DNA損傷因子的主要細胞防御機制，維持細胞氧化還原狀態[2-3，46-47]。激活的Nrf2可以調節細胞抗氧化調節因子，它可以上調正常細胞中HO-1、超氧化物歧化酶1（SOD-1）等下游基因的表達，以維持細胞內氧化還原平衡，抑制ROS依賴的DNA損傷和癌變，減少腫瘤發生[4，48]。Nrf2依賴的解毒酶如NAD（P）H-醌氧化還原酶1（NQO1）還可以促進雌激素的清除，被認為是一種防止雌激素相關癌變的重要機制[12]。本研究結果顯示，金蓉顆粒能降低機體E2水平，降低ROS水平，提高抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC）的表達，下調8-OHdG水平，促進Nrf2及其下游HO-1、NQO1 mRNA的表達。結果表明，金蓉顆?？梢哉{節雌激素誘導癌變過程的氧化應激反應，抑制ROS中介物的產生和積累，提高機體抗氧化的防御能力，降低細胞DNA的氧化損傷，其抗雌激素的氧化、癌變效應的主要機制可能是通過ROS/Nrf2信號通路，激活Nrf2及其下游蛋白來抑制氧化應激，達到延緩乳腺癌變、抑制乳腺腫瘤的進展。

綜上所述，本研究以MMTV-PyMT自發乳腺癌轉基因小鼠作為動物模型，發現金蓉顆粒可明顯延緩乳腺癌的發展，其可能是通過激活E2/ROS/Nrf2通路，抑制氧化應激過程，從而起到抑制乳腺癌進程的作用。本實驗尚存在一定的局限性，如樣本量過少，未對E2去勢或加用ER受體拮抗劑進行激活ROS/Nrf2通路驗證，未對ROS/Nrf2通路進行敲除或阻斷驗證，未進行有效物質基礎的探討，也未從細胞層面深入探索金蓉顆粒抗腫瘤的機制等。后續將在細胞實驗上進一步研究，以期為乳腺癌的治療提供潛在靶標，為乳腺癌治療提供更多參考。