雞血藤總黃酮對急性缺血性腦卒中大鼠腸道屏障功能、氧化應激及ERK基因表達與DNA甲基化的影響

馬敏兒， 黃浩華， 吳麗霞， 羅琿

（深圳市龍華區中心醫院，廣東深圳 518110）

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke）是臨床最為常見的腦類疾病，發病率和死亡率均較高，一直是研究的熱點。腦卒中歸屬于中醫學“中風病”范疇，痰瘀交阻，氣機升降逆亂是其主要病機。中醫藥及其有效活性成分對腦血管疾病的防治具有廣泛的應用前景。雞血藤，為豆科植物密花豆Spatholobus suberectusDunn的干燥藤莖，味苦、甘，性溫，歸肝、腎經，具有活血補血、調經止痛、舒筋活絡的功效，用于治療月經不調、痛經、經閉、風濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃等病證。雞血藤總黃酮是雞血藤的重要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗腸道病毒、保護心腦神經功能等作用[1-5]。既往研究[6]表明，雞血藤總黃酮對大鼠實驗性腦缺血具有一定的保護作用。因此，本研究以大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型大鼠為研究對象，進一步觀察雞血藤總黃酮保護腦功能的作用及其機制，旨在為其臨床治療腦卒中提供應用基礎，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 65只SFP級SD大鼠，雌雄各半，4～6月齡，體質量150～210 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產許可證號：SCXK（魯）20140012。所有操作嚴格按照實驗動物倫理委員會動物管理指南批準執行。

1.2 藥物、試劑與儀器 雞血藤總黃酮（成都科程生物科技開發有限公司，批號：603305101）；阿司匹林腸溶片（杭州賽諾菲醫藥有限公司，批號：8A433）。蘇木素-伊紅（HE）染色液（北京雷根生物技術有限公司，批號：1009A19）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（上海金穗生物科技有限公司）；二胺氧化酶（DAO）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、D-乳酸ELISA試劑盒（南京建成科技有限公司）；反轉錄試劑盒和實時聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。ASP300型封閉式全自動組織脫水機、EG1140型分體式組織包埋機、RM2145型半自動輪轉式切片機（德國徠卡微系統股份公司）。

1.3 模型建立 按照文獻方法[7]采用Zea Longa線栓法加以改進制作大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。方法：以10%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，切開頸中央分離頸動脈，將頸總動脈打結，在頸外動脈離心端1 cm處結扎頸外動脈、夾閉頸內動脈；頸外動脈行小型切口，把線栓插入后將頸外動脈阻斷，線栓沿頸內動脈至顱方向進入，距頸總動脈分叉處約20 mm遇到阻力時暫停插入。阻斷2 h后把線栓取出，打開頸總動脈結，使動脈貫通。待大鼠蘇醒后提起大鼠尾巴，若大鼠左前肢屈曲、前行時向左側劃圈，則表示急性缺血性腦卒中模型成功建立。結果不符合建模標準的有3只大鼠，因感染死亡2只，剩余50只大鼠均建模成功。

1.4 分組與給藥 按照隨機數字表將60只大鼠分為正常組，模型組，中藥低、中、高劑量組和阿司匹林組，每組10只。除正常組，其余各組大鼠構建MCAO模型。造模成功后，進行給藥。大鼠給藥劑量按成人與大鼠體表面積換算法[7]計算，設為中劑量。中藥低、中、高劑量組分別給予雞血藤總黃酮100、200、400 mg·kg-1·d-1灌胃，阿司匹林組給予阿司匹林100 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，給藥體積均為0.01 mL·g-1。連續給藥4周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 大鼠行為學檢測[8-9]①懸尾實驗（TST）：末次給藥1 h后，將單個大鼠尾端（在距尾尖部約2 cm處）采用醫用膠布粘于懸尾箱（30 cm×30 cm×25 cm）上部支架上，使成倒掛狀態，頭部離箱底約5 cm。懸掛時間為6 min，記錄后4 min內累計不動時間（不動狀態即大鼠停止掙扎不動或無任何活動）。②強迫游泳實驗（FST）：將大鼠放入高20 cm、直徑15 cm的玻璃箱內，放入約10 cm常溫水，待大鼠入水后計時6 min，記錄后4 min內大鼠在水中停止掙扎、呈漂浮狀態或僅微肢體運動以保持頭部浮于水面不動的時間。③曠野實驗：將大鼠置于直徑40 cm的圓形板內30 s，記錄其在圈內停留時間。

1.5.2 ELISA法檢測血清二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸水平 經尾靜脈取血，于4℃以3 000 r/min離心（離心半徑10 cm）15 min，取上清。采用ELISA法檢測血清中DAO、D-乳酸水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.3 黃嘌呤氧化酶法檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）、硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（MDA）水平 取血清，按照試劑盒說明書，應用酶標儀于波長500 nm處檢測光密度（OD）值，繪制曲線，計算SOD、MDA值。

1.5.4 HE染色法觀察海馬組織病理學變化 將大鼠處死后取海馬組織，4%多聚甲醛溶液固定后石蠟包埋，制成5μm切片。二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10 min，梯度乙醇脫水各5 min，蘇木素染色5 min，75%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗返藍，伊紅染色2 min，自來水沖洗，梯度乙醇脫水各30 s，二甲苯透明1 min，晾干，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.5.5 實時聚合酶鏈反應（PCR）法檢測大鼠海馬組織ERK mRNA表達 采用TRIzol提取總RNA，采用分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000）測定RNA含量、純度及濃度，應用2%瓊脂糖凝膠分析總RNA完整性，用Bio-Rad iScriptTMcDNA Synthesis Kit試劑盒將RNA反轉錄成活性穩定的cDNA，采用TaKaRa寶生物工程有限公司設計合成的PCR引物進行PCR的擴增，反應結束后繪制PCR擴增后ERK和β-actin的標準曲線和確定PCR的特異性。最后采用2-△△CT（Livak）方法計算ERK mRNA相對表達量，由Bio-Rad CFX Manager system軟件自動分析。ERK上游引物序列為5’-AGAGA AGAATGGTTGGCAGCA-3’，下游引物序列為5’-TTGGGTAGATGGTAAGGTAGAGA-3’，擴增片段長度為171 bp；β-actin上游引物序列為5’-CGCTACC AATAACGCTTGCAAA-3’，下游引物序列為5’-TAGGCCAGGGGATCCAGTAA-3’，擴增片段長度為99 bp。

1.5.6 采用Sequenom Mass Array飛行時間質譜法檢測海馬細胞外信號調節激酶（ERK）DNA甲基化水平 ERK基因序列號：NM00104356。提取大鼠海馬組織ERK總DNA，-20℃保存。應用CpG Island Searcher軟件判斷ERK基因全序列，設計引物，ERK上游引物序列為5’-AGGAAGAGAGGTT ATAGGTAGGGGGTATAGGATGA-3’，下游引物序列為5’-CACTTAACCCAGTAATACTACTCTTTAAG ATCAAAACTCAACCCGGGAATTCT-3’，擴增片段長度為1 509 bp；β-actin上游引物序列為5’-CGT AAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游引物序列為5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3’，擴增片段長度為92 bp。用Sequenom Mass Array飛行質譜甲基化檢測平臺軟件獲取數據。

1.6 統計方法 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，符合方差齊及正態分布，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢測。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學比較 表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠TST不動時間縮短，FST不動時間和圈內保留時間延長（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組及阿司匹林組大鼠TST不動時間延長、FST不動時間和圈內保留時間縮短（P＜0.05）；中藥高劑量組各指標與阿司匹林組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠行為學比較Table 1 Comparison of the behaviors among various groups of rats （±s，s）

表1 各組大鼠行為學比較Table 1 Comparison of the behaviors among various groups of rats （±s，s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組阿司匹林組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10 TST不動時間/s 126.12±38.59 76.79±16.67①78.12±17.03①③87.85±23.56①②③102.67±29.78①②100.84±28.65①②3.711＜0.001 FST不動時間/s 7.56±0.96 15.92±1.85①15.23±1.79①③12.63±1.50①②③9.58±1.19①②9.62±1.21①②12.680＜0.001圈內保留時間/s 12.56±2.23 27.57±5.96①26.79±5.88①③21.58±4.67①②③17.74±2.96①②18.12±3.02①②7.454＜0.001

2.2 各組大鼠血清中DAO、D-乳酸含量比較 表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清中DAO、D-乳酸含量較高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組血清中DAO、D-乳酸含量降低（P＜0.05），而阿司匹林組DAO、D-乳酸含量無顯著性差異（P＞0.05）；與阿司匹林組比較，中藥中、高劑量組血清中DAO、D-乳酸含量顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸含量比較Table 2 Comparison of serum levels of diamine oxidase（DAO）and D-lactate among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸含量比較Table 2 Comparison of serum levels of diamine oxidase（DAO）and D-lactate among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組阿司匹林組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10 DAO/（U·L-1）16.12±2.33 27.79±3.75①26.16±3.68①21.85±3.30①②③18.78±2.69①②③25.85±3.72①8.359＜0.001 D-乳酸/（mg·L-1）7.11±0.75 15.92±1.85①15.76±1.79①12.85±1.25①②③9.87±0.98①②③15.79±1.80①13.960＜0.001

2.3 各組大鼠海馬組織病理學變化比較 圖1結果顯示：正常組大鼠腦皮質區域的神經細胞良好且胞體形態規則，排列穩定有序，神經細胞、膠質細胞及毛細血管與周圍腦間質空間無擴增現象；模型組與中藥低劑量組梗死灶皮質細胞排列紊亂，核固縮、核變形顯著，血管及神經細胞與周圍腦間質的間隔空隙較大；中藥中劑量組皮質區仍可見神經細胞變性腫脹現象，仍有少量細胞萎縮和壞死現象；中藥高劑量組與阿司匹林組梗死灶皮質細胞排列趨于整齊，周圍腦間質空間縮小，核固縮和核變形顯著改善，神經元結構趨于完整。

圖1 各組大鼠海馬組織病理學變化比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of histopathological changes in the hippocampus tissue among various groups of rats（HE staining，×400）

2.4 各組大鼠海馬組織中SOD、MDA水平比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠海馬組織中SOD水平降低、MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組及阿司匹林組大鼠海馬組織中SOD水平升高、MDA水平降低（P＜0.05）；中藥高劑量組各指標與阿司匹林組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠海馬組織中SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of SOD and MDA levels among various groups of rats （±s，μmol·L-1）

表3 各組大鼠海馬組織中SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of SOD and MDA levels among various groups of rats （±s，μmol·L-1）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組阿司匹林組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10 SOD 275.45±12.19 175.15±19.85①176.33±18.10①③198.21±16.73①②③212.56±14.55①②210.71±14.28①②13.620＜0.001 MDA 1.19±0.12 3.12±0.31①3.08±0.30①③2.75±0.23①②③1.96±0.19①②2.05±0.20①②18.360＜0.001

2.5 各組大鼠海馬組織ERK mRNA表達及ERK DNA甲基化水平比較 表4結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠海馬組織中ERK mRNA表達水平降低、ERK DNA甲基化水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組及阿司匹林組大鼠海馬組織中ERK mRNA表達水平升高、ERK DNA甲基化水平降低（P＜0.05）；中藥高劑量組各指標與阿司匹林組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

腦卒中時可引起大腦皮質和紋狀體梗死，造成皮質額頂部、感覺運動區及四肢遠端運動協調功能、精細運動功能等產生障礙，而TST不動時間、FST不動時間和圈內保留時間等可在一定條件下反映腦損傷的程度[10-11]。本研究結果顯示，中藥組大鼠TST不動時間較模型組延長、FST不動時間和圈內保留時間較模型組縮短，并明顯改善海馬組織病理損傷，與阿司匹林組效果相當，表明腦卒中后由于運動神經元受損導致其對運動神經的掌控能力減退，伴隨出現行為功能障礙、運動功能損傷，而雞血藤總黃酮干預可有效改善急性缺血性腦卒中大鼠行為學癥狀，修復腦損傷，值得深入研究。

腦卒中患者腸道內致病細菌量升高，且腸道由于缺血缺氧可使炎癥因子過度生成、菌群失調、腸動力及免疫障礙發生進而導致腸道屏障功能損傷[12]。腸道屏障功能與腦卒中預后密切相關[13]。DAO和D-乳酸作為腸道關鍵因子可在一定程度上反映出腸道屏障狀態[14-15]。相關研究表明，改善腦卒中大鼠的腸吸收及腸內營養對修復腸黏膜屏障、恢復受損神經功能、增強機體免疫具有重要的意義[16]。本研究結果顯示，中藥組血清中DAO、D-乳酸含量較模型組明顯下降，表明雞血藤總黃酮可促進急性缺血性腦卒中大鼠腸黏膜損傷的恢復，提高腸道免疫機制，有維持腸道內環境的作用。其中，中藥高劑量組降低效果顯著優于阿司匹林組。考慮其原因可能是阿司匹林可直接刺激其胃腸功能，雖見效快但胃腸道副作用明顯，相比之下雞血藤總黃酮胃腸道副作用較小。

腦卒中發生時，由于腦部血供障礙導致體內自由基失衡，同時自由基的防御系統SOD酶活性的下降、氧化產物MDA的增加導致神經元膜以及相關微血管被攻擊，進而引起脂質過氧化損傷并破壞血腦屏障，最終引起神經元損壞促進疾病進程[17]。本研究結果顯示，中藥組大鼠海馬組織中SOD活性較模型組升高，MDA水平較模型組顯著降低，中藥高劑量組與阿司匹林組治療效果相當。表明雞血藤總黃酮可減輕急性缺血性腦卒中大鼠氧化應激反應，起到腦保護的作用。

表4各組大鼠海馬組織ERK mRNA表達及ERK DNA甲基化水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression of ERK and DNA methylation level of ERK in hippocampal tissue among various groups of rats （±s）

表4各組大鼠海馬組織ERK mRNA表達及ERK DNA甲基化水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression of ERK and DNA methylation level of ERK in hippocampal tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組阿司匹林組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10 ERK mRNA相對表達量1.95±0.19 0.15±0.02①0.17±0.03①③0.64±0.08①②③1.21±0.12①②1.15±0.10①②29.790＜0.001 ERK DNA甲基化水平1.19±0.15 3.34±0.36①3.29±0.33①③2.49±0.28①②③1.85±0.21①②1.93±0.22①②17.430＜0.001

ERK通路涉及中樞神經系統的發育以及神經細胞的增殖、生存、分化過程，該通路的激活對腦缺血損傷修復具有重要的作用[18-21]。缺血性損傷后DNA甲基化增加，引起大量基因的轉錄抑制，導致腦損傷增加[22]，DNA甲基化抑制藥物已經被證實可以改善大鼠缺血模型的神經學結果[23]。本研究結果顯示，與模型組比較，中藥高劑量組大鼠海馬組織中ERK mRNA表達水平升高、ERK甲基化水平降低，并與阿司匹林組治療效果相當。結果表明，雞血藤總黃酮可促進急性缺血性腦卒中大鼠海馬組織ERK mRNA表達、抑制ERK DNA甲基化，從而起到腦保護作用。

綜上所述，雞血藤總黃酮可改善急性缺血性腦卒中大鼠癥狀、修復腦損傷，其機制可能與調節腸道屏障功能、減輕海馬組織氧化應激及促進海馬組織ERK mRNA表達、抑制ERK甲基化DNA甲基化水平有關。