淫羊藿苷通過上調Runx2促進踝關節骨折大鼠骨重建及抑制破骨細胞形成

鄭國洪， 孫斌， 王潔瓊， 楊正明

（1.浙江省舟山市中醫院急診骨傷科，浙江舟山 316000；2.浙江大學醫學院附屬第二醫院骨科，浙江杭州 310000）

踝關節骨折是臨床常見的關節內創傷型骨折之一，發生率逐年升高[1]。踝關節是人體第一負重關節，最高可承受5倍個人體質量，但其關節面小，離地面近，承重力無法充分緩沖，因此極易受損[2]。目前，關于踝關節骨折的治療方案尚不統一，臨床多采用鎮痛、抗炎藥物配合外科手術的治療方法以達到增強關節穩定性、抑制炎癥的效果，但手術創傷易引發關節軟組織粘連且術后抗炎藥物不良反應較多，并不適用于全部患者尤其是老齡患者[3]。淫羊藿苷（icariin）是常用中藥淫羊藿[為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔 毛 淫 羊 藿Epimedium pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai的干燥葉]的主要有效成分之一。有研究[4-6]表明，淫羊藿苷在促進骨折愈合和治療骨缺損方面有著顯著作用，但具體作用機制尚不明確。本研究建立踝關節骨折創傷大鼠模型，進一步觀察淫羊藿苷的治療作用及機制，以期為其臨床應用治療骨折提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 55只SPF級8周齡雄性SD大鼠，體質量（280±20）g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2019-0002。本研究方案已經浙江省舟山市中醫院動物倫理委員會批準。

1.2 藥物、試劑與儀器 淫羊藿苷（純度：98%，上海源葉生物科技有限公司生產，批號：B21576，分子量：676.662，分子式：C33H40O15，分子結構見圖1）；復方骨肽注射液（南京新百藥業有限公司生產，國藥準字H32020004）。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司）；兔抗大鼠Runt相關轉錄因子2（Runx2）抗體（英國Santa公司）。SkyScan活體三維斷層掃描儀（德國Bruker公司）；SZX7顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；Doc EZ凝膠成像分析系統（美國伯樂公司）。

圖1 淫羊藿苷分子結構Figure 1 Molecular structure of icariin

1.3 建立踝關節骨折大鼠模型[7]大鼠適應性飼養1周后，腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉，備皮消毒后，仰臥位固定于手術臺，右下肢屈膝90°，踝關節充分外展，內踝處做1 cm長度切口，分離皮下筋膜，牽拉肌腱，暴露踝關節，骨鑿37°鑿入內踝，生理鹽水沖洗后縫合切口。術前腹腔注射青霉素預防感染，術后給予曲馬多鎮痛，每日1次，持續3 d。術后即刻行X線攝片，以踝關節斜形或橫形骨折，骨折端內固定效果理想，未發生明顯移位為建模成功標準。結果成功建立踝關節骨折模型50只。

1.4 分組與干預 將50只踝關節骨折大鼠隨機分為模型組，淫羊藿苷低、中、高劑量組及陽性藥組，每組10只。建模后次日，根據黃繼漢等《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》[8]進行給藥劑量換算。淫羊藿苷低、中、高劑量組腹腔注射淫羊藿苷生理鹽水2.5 mL（分別含淫羊藿苷30、60、120 mg/kg）[9]，陽性藥組腹腔注射復方骨肽注射液與生理鹽水混合溶液2.5 mL（含復方骨肽注射液5 mL/kg）[10]，模型組腹腔注射生理鹽水2.5 mL。每日1次，持續4周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 Micro-CT活體掃描 干預2、4周后做三維斷層掃描，戊巴比妥鈉麻醉后俯臥位固定于手術臺，屈曲雙下肢。設定分辨率47μm，行Micro-CT掃描，沿骨痂上下各取50個掃描層面。在骨折處建立三維感興趣區，CTAn軟件分析結果，計算骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）與骨體積分數（bonevolume/total volume，BV/TV）。

1.5.2 生物力學測試 末次Micro-CT活體掃描結束后，過量麻醉處死大鼠，取其右下肢踝關節，固定兩端后行三點彎曲實驗。以所取踝關節中點為加載點，頂端、底端跨距分別為8、20 mm，記錄剛度（骨頭在不被破壞的情況下能夠承受的力的大小的能力）及最大載荷（骨頭最大力學載荷耐受程度）。

1.5.3 TRAP染色法檢測破骨細胞數量 生物力學測試完成后，每組取5只大鼠包括骨痂組織的踝關節，置于4%福爾馬林溶液中固定72 h，移至10%乙二胺四乙酸二鈉脫鈣液，6周后常規脫水、浸蠟、包埋，以切片機切為4μm厚度，連續切片。根據TRAP染色試劑盒說明書步驟染色切片，置于顯微鏡下觀察。黃褐色細胞為陽性破骨細胞，隨機選取5個不相鄰的視野，記錄每個視野破骨細胞數，求其均值。

1.5.4 HE染色觀察骨痂組織學變化 取各組剩余5只大鼠踝關節，切取骨折處上下6 mm×6 mm骨痂組織，分成2份。一份置于10%中性甲醛固定48 h，常規脫水、浸蠟、包埋，切片機切為4μm厚度連續切片；另一份投入液氮中保存。二甲苯脫蠟踝關節切片，水化后自來水沖洗，移至蘇木素染液內染色5 min。自來水沖洗，分化液分化。自來水沖洗，移入藍化液返藍，伊紅液染色2 min。自來水漂洗，常規脫水、透明。滴入中性樹脂封固，置于顯微鏡下觀察骨痂組織病理變化，并拍照記錄。

1.5.5 Western Blot法檢測骨痂組織Runx2蛋白表達水平 取液氮中保存的骨痂組織，研磨后裂解，以9 000 r/min（離心半徑10 cm）離心15 min，取上清，BCA法定量蛋白濃度。取40μg樣本蛋白，混合4倍體積上樣緩沖液，金屬浴煮沸5 min。同條件下離心取上清，恒壓下行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離，濕轉至膜。加入封閉液封閉2 h，TBST洗膜，加入Runx2一抗（1∶500體積比稀釋），4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000體積比稀釋），室溫孵育2 h，ECL發光，暗盒顯影。經凝膠成像分析儀分析蛋白條帶灰度值，Runx2蛋白相對表達量以Runx2蛋白/內參GAPDH灰度值表示。

1.6 統計方法 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s），多組樣本資料比較采用單因素方差分析，進一步以LSD-t法行兩兩比較。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠骨重建指標比較 表1結果顯示：干預2、4周后，與模型組同期比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組和陽性藥組Tb.N增加，BV/TV值升高（P＜0.05），淫羊藿苷各劑量組作用效果呈劑量依賴性；但淫羊藿苷各劑量組Tb.N、BV/TV值均低于陽性藥組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠骨重建指標比較Table 1 Comparison of bone reconstruction indexes among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠骨重建指標比較Table 1 Comparison of bone reconstruction indexes among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性藥組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷低劑量組比較；④P＜0.05，與淫羊藿苷中劑量組比較

組別模型組淫羊藿苷低劑量組淫羊藿苷中劑量組淫羊藿苷高劑量組陽性藥組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 Tb.N/（個·mm-1）給藥2周后2.09±0.41 2.49±0.42①②2.90±0.44①②③3.32±0.45①②③④3.79±0.53①11.926＜0.001給藥4周后2.65±0.43 3.07±0.45①②3.51±0.48①②③3.98±0.51①②③④4.49±0.57①21.928＜0.001 BV/TV值給藥2周后0.21±0.03 0.25±0.04①②0.30±0.05①②③0.36±0.06①②③④0.41±0.04①32.010＜0.001給藥4周后0.26±0.03 0.30±0.04①②0.34±0.04①②③0.39±0.05①②③④0.45±0.06①27.304＜0.001

2.2 各組大鼠生物力學指標比較 表2結果顯示：與模型組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組和陽性藥組最大載荷、剛度增加（P＜0.05），淫羊藿苷各劑量組作用效果呈劑量依賴性；但淫羊藿苷各劑量組最大載荷、剛度均低于陽性藥組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠生物力學指標比較Table 2 Comparison of biomechanical indexes among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠生物力學指標比較Table 2 Comparison of biomechanical indexes among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性藥組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷低劑量組比較；④P＜0.05，與淫羊藿苷中劑量組比較

組別模型組淫羊藿苷低劑量組淫羊藿苷中劑量組淫羊藿苷高劑量組陽性藥組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10最大載荷/N 34.25±2.39 37.65±3.01①②40.22±2.38①②③43.02±2.60①②③④47.21±3.11①33.441＜0.001剛度/（N·mm-1）80.87±9.65 90.24±10.21①②101.52±11.36①②③113.29±13.35①②③④125.67±12.68①23.899＜0.001

2.3 各組大鼠骨痂組織破骨細胞數量比較 表3、圖2結果顯示：與模型組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組和陽性藥組骨痂組織破骨細胞數量減少（P＜0.05），淫羊藿苷各劑量組作用效果呈劑量依賴性；但淫羊藿苷各劑量組骨痂組織破骨細胞數量均高于陽性藥組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠骨痂組織破骨細胞數量比較Table 3 Comparison of number of osteoclasts in callus tissue among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠骨痂組織破骨細胞數量比較Table 3 Comparison of number of osteoclasts in callus tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性藥組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷低劑量組比較；④P＜0.05，與淫羊藿苷中劑量組比較

組別模型組淫羊藿苷低劑量組淫羊藿苷中劑量組淫羊藿苷高劑量組陽性藥組F值P值鼠數/只55555破骨細胞數/（個·視野-1）4.20±0.57 3.20±0.45①②2.40±0.29①②③1.20±0.14①②③④0.60±0.07①83.805＜0.001

2.4 各組大鼠骨痂組織學改變比較 圖3結果顯示：模型組骨小梁不具有明顯的方向性，成骨細胞功能不活躍，骨小梁較細；淫羊藿苷低、中劑量組可見較多骨性骨痂，骨小梁較粗，部分成熟，存在明顯礦化，排列較整齊；淫羊藿苷高劑量組、陽性藥物組可見軟骨性及纖維性骨痂形成，軟骨性骨痂邊緣鈣化明顯，骨外膜下可見成骨細胞形成骨小梁。

圖3 各組骨痂組織HE染色結果（×200）Figure 3 HE staining results of the callus tissue in various groups（×200）

2.5 各組大鼠骨痂組織Runx2蛋白表達量比較表4、圖4結果顯示：與模型組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組和陽性藥組骨痂組織Runx2蛋白表達量升高（P＜0.05），淫羊藿苷各劑量組作用效果呈劑量依賴性；但淫羊藿苷各劑量組骨痂組織Runx2蛋白表達量均低于陽性藥組（P＜0.05）。

表4 各組大鼠骨痂組織Runx2蛋白表達比較Table 4 Comparison of Runx2 protein expression in callus tissue among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠骨痂組織Runx2蛋白表達比較Table 4 Comparison of Runx2 protein expression in callus tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性藥組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷低劑量組比較；④P＜0.05，與淫羊藿苷中劑量組比較

組別模型組淫羊藿苷低劑量組淫羊藿苷中劑量組淫羊藿苷高劑量組陽性藥組F值P值鼠數/只55555 Runx2蛋白相對表達量0.09±0.01 0.20±0.02①②0.38±0.05①②③0.53±0.06①②③④0.72±0.08①122.365＜0.001

圖4 各組骨痂組織Runx2蛋白Western Blot電泳圖Figure 4 Western Blot electrophoretogram of Runx2 protein in callus tissue

3 討論

踝關節骨折是由于脛腓骨下端沖擊與之相連距骨，發生翻轉、扭動而造成的下肢骨損傷，多發生于體育鍛煉、生活勞動時，以踝部腫脹、壓痛，皮下瘀斑，踝關節無法自由活動為主要臨床表現[11]。骨折，愈合是骨折處組織反復進行吸收與形成的過程，其中破骨細胞主導骨吸收，成骨細胞主導骨形成，二者相互抑制形成動態平衡，但由于炎癥反應的存在，成骨-破骨平衡狀態被打破，破骨細胞優勢明顯，成骨功能降低，骨愈合放緩，導致病程延長[12]。因此，尋找抑制破骨細胞、提升成骨能力的新藥物或手段是治療踝關節骨折的關鍵。

中醫治療骨折歷史悠久，將骨折治療定為“瘀去”“新生”“骨合”三期，現代中醫在三期辨證的基礎上靈活運用，認為其病位在于腎、肝，主要病機為骨斷筋傷，血瘀不散，經絡阻滯，累積傷腎，腎陽虧虛，以致筋脈失養、骨髓不愈，故治療應以舒筋活血、補腎壯陽為主[13]。淫羊藿溫燥助陽之性較強，除長于補命火、壯腎陽外，其通痹、強筋骨、治風冷疼痛癥較佳，常用于治療性機能衰退、腰膝無力、風濕痹痛、四肢麻木等癥。《別錄》言淫羊藿能“堅筋骨”。《日華諸家本草》曰淫羊藿治“一切冷風勞氣，筋骨攣急，四肢不仁，補腰膝”。《本草備要》云淫羊藿能“補命門，益精氣，堅筋骨，利小便”。《本草求真》指出：“淫羊藿氣味甘溫，則能補火助陽，兼有辛香，則冷可除而風可散耳。”淫羊藿苷是從淫羊藿中提取的單體黃酮類化合物，本研究結果顯示，經淫羊藿苷干預2、4周后，踝關節骨折大鼠Tb.N、最大載荷、剛度增加，BV/TV值升高，破骨細胞數減少，且呈劑量依賴性，提示淫羊藿苷可提升骨重建能力及生物力學性能，抑制破骨細胞形成。

Runx2屬于轉錄因子Runx家族成員，是一種異二聚體核蛋白，作為骨細胞特異性轉錄蛋白，參與多種骨骼系統疾病的發生與發展[14]。Runx2是成骨分化前期重要的上游因子，可調控細胞外基質蛋白表達，誘導骨髓間充質干細胞發育為成骨或軟骨細胞，并直接調控成骨細胞特異性基因如OSX表達[15]。此外，Runx2的羧基端SMID/NMTS區域是骨分化的必需片段[16]。Liu等[17]研究發現，骨折后Runx2在脛骨組織中的表達水平明顯降低，上調其表達后可提升骨密度及最大載荷、彎曲強度、彈性應力、彈性應變，在骨組織修復、促進脛骨骨折愈合中發揮重要作用。本研究結果顯示，與模型組比較，經淫羊藿苷干預后骨痂組織Runx2蛋白表達量升高，且呈劑量依賴性，提示淫羊藿苷可能通過上調Runx2蛋白表達抑制踝關節骨折創傷大鼠破骨細胞分化。

綜上所述，淫羊藿苷可促進踝關節骨折創傷大鼠骨重建，抑制破骨細胞形成，提高生物力學性能，其作用機制可能與上調Runx2蛋白表達有關；但淫羊藿苷作用效果不及復方骨肽注射液，其醫用生物有待進一步的深入研究。