22份百脈根種質資源表型數量性狀的遺傳多樣性分析

謝文輝，趙文武，王雷挺，趙麗麗*，王普昶

(1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州師范大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

百脈根(Lotuscorniculatus)是豆科百脈根屬多年生草本植物，原產于歐亞大陸溫帶地區[1]，在我國廣泛分布于華東、華中、西南和西北地區[2]。百脈根具有很高的經濟效益與生態效益，它的莖葉營養含量豐富、粗蛋白含量高、富含縮合單寧、適口性好，是牛、馬、兔等家畜的優良牧草，也是人工草地建植和放牧草地改良的優良草種[3]。百脈根中的縮合單寧能夠促進反芻動物的消化[4-5]，這使得其與多數豆科牧草不同，不易造成家畜患膨脹病[6]。此外，百脈根根系發達，側根眾多，莖枝匍匐生長，枝葉茂密，覆蓋度大，具有改土肥田、防止水土流失，美化環境的作用[7]。

自上世紀80年代以來，我國陸續從國外引進了一些百脈根栽培品種[8]，生產試驗表明這些品種有較強的適應性和較高的生產性能，廣泛種植于我國西北河西走廊灌溉地區和新疆沙漠綠洲[9]。在我國西南巖溶地區，目前關于百脈根的品種選育研究還不系統，百脈根新品種較少。通過引進新的優良百脈根種質資源，培育適宜不同生態區和用途的百脈根品種，這對百脈根在我國西南巖溶山區的規模化種植及當地生態畜牧業發展具有重要的現實意義。

種質資源的遺傳多樣性分析是新品種選育的基礎，通過表型性狀檢測遺傳多樣性是最直接且最簡易的方法[10]。表型性狀是作物基因和外部環境綜合作用的結果，張本瑜等人[11]將69份俄羅斯百脈根種質資源劃分為3大類群，并發現這69份材料各具特點，差異明顯，類型廣泛。郝裕輝等人[12]分析了參試的29份無芒雀麥(Bromusinermis)種質資源表型性狀差異，發現無芒雀麥種質間遺傳變異較大，是環境因子和遺傳物質共同作用的結果，育種潛力巨大。此外，前人對箭筈豌豆(Viciasativa)[13]、苜蓿(Medicagosativa)[14]、胡枝子(Lespedeza)[15]等作物表型性狀存在的變異也進行了廣泛深入研究，為不同牧草種質資源的收集、保護和遺傳改良提供了參考。本研究基于表型性狀對來自國內外的22份百脈根種質材料的遺傳多樣性進行分析和比較，擬為優異百脈根種質資源的創新利用和新品種選育提供初步參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為22份百脈根種質種子(表1)，其中21份由中國農業科學院草原研究所國家種質資源牧草中期庫提供，1份由貴州眾志恒生態科技有限公司提供。

表1 材料名稱及來源

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計與種植 測定完種子表型性狀后，先在培養皿上育苗，出苗10 d后，選取長勢一致的幼苗移栽至花盆(高30 cm，長35 cm，寬20 cm)，每份種質種植3盆，每盆5株。溫室適應生長2周后(光照16 h，黑暗8 h，生長溫度(22±2)℃)，移至室外培養，定期澆水并除草，所有材料均可以完成全部生育期并開花結種。種子形態性狀測定包括種莢長，種莢寬，種莢厚，種子周長，種子寬，種子長和種子長寬比；植株表型性狀測定包括分枝數，莖長，株高和冠幅，共11個指標。

1.2.2表型數量性狀的測定方法 種子形態：使用光學平板掃描儀(V800 PHOTO，Epson，日本)對每份種質種子(每份種子100粒，3次重復)進行掃描，獲得種質的種子圖像，圖像分辨率為300 dpi，像素為1024×1024。使用數字圖像分析系統(WinFOLIA 2014，加拿大)對種子圖像進行分析，得到種子長、種子寬、長寬比、種子周長。

種莢形態：使用數顯游標卡尺(AIRAI SR44，精度0.01 mm，山東青島)測量種莢長度、種莢寬度、種莢厚度。

在利用直尺(量程為30 cm)測量同一時間不同種質百脈根的莖長、冠幅、株高及記錄百脈根的分枝數。其中，莖長：用直尺測量莖頂端至基部的總長度。冠幅：分枝直徑的最大值。株高：用直尺測量從地上莖部分到植株花序頂端的自然高度；分枝數：初花期統計并記錄百脈根根頸部的一級分枝數。

1.3 數據統計與分析

利用Microsoft Excel 2016對試驗數據進行整理，并基于單因素(One-Way ANONA)方差分析的最小顯著差(LSD)多重比較法。利用Origin2021軟件的模式分析，包括聚類和主成分分析(Principal component analysis，PCA)，控制數據質量并以圖像方式直觀展示本試驗研究中22份種質表型數量性狀的差異變化情況，選用基于平方歐氏距離的最長距離法對22份種質的植株表型及種子表型性狀指標進行聚類分析，為了消除量綱對聚類關系的影響，種質性狀數據通過z值標準化后進行聚類，其中，z值標準化計算公式如下：

各表型數量性狀之間的相關性和主成分分析在IBM SPSS Statistics 21中分析，其中，基于主成分提取結果，我們構建了1個新的變量y(y1，y2，y3，y4)，通過因子分析來反映主成分分析提取到的主成分的得分：

y=∑cx

(1)

公式(1)中，c為特征向量，特征向量為(相應載荷因子/特征根的開方)，x為標準化后的種質表型性狀值。隨后，將提取到的主成分的方差貢獻率C作為系數，結合公式(1)構建綜合評價模型：

F=C1y1+C2y2+C3y3+C4y4

(2)

最終以評價得分F為基準對各百脈根種質進行綜合評價[16]。

2 結果與分析

2.1 百脈根種質資源形態特征多樣性

22份百脈根種質表型性狀結果表明(表2)，除種寬外，22份百脈根種質間各性狀均存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異。其中，株高、莖長、分枝數及冠幅等百脈根形態指標的變異系數均超過50%，株高變異幅度最大，為69.48%，種子和種莢性狀(種子長、種子寬、種長寬比、種子周長、種莢長、種莢寬、種莢厚)的變異系數較小，在12.11%和20.81%之間。此外，除種子寬外，22份百脈根種質間的種長寬比和種子周長性狀存在顯著差異(P<0.05)，其余各性狀(株高、莖長、分枝數、冠幅、種子長、種莢長、種莢寬、種莢厚)均存在極顯著差異(P<0.01)。

表2 22份百脈根種質表型數量性狀變異

2.2 百脈根種質材料不同性狀間的相關性分析

對22份百脈根種質材料的11個表型性狀進行相關性分析(圖1)，結果顯示分枝數與莖長、株高和冠幅性狀之間呈極顯著正相關(P<0.01)，而分枝數與種莢長呈顯著負相關(P<0.05)，與種莢寬和種莢厚性狀之間呈極顯著負相關(P<0.01)。莖長與種莢厚和種子長呈顯著負相關(P<0.05)。種莢長與種莢寬和種莢厚之間呈極顯著正相關(P<0.01)，種子長，種子寬，種周長之間呈極顯著正相關(P<0.01)。種子長寬比和種子長之間呈極顯著正相關(P<0.01)，而與種子寬之間呈極顯著負相關(P<0.01)。此外，種莢厚，種子長均與莖長呈顯著負相關(P<0.05)。總體而言，不同性狀間存在顯著相關性。

圖1 22份百脈根種質不同性狀間的相關性分析

2.3 22份百脈根種質資源的聚類分析

通過聚類分析，將22份百脈根種質資源分成3個大的類群(圖2)。第I類群僅包含1份種質，種質編號為21，從熱圖可以看出，該野生百脈根種質的莖分枝數、莖長、株高和冠幅直徑高于其它類群種質資源，但該類群種質種子小也是一個主要表型特征，這表明類群I種質的種子小但植株高大，地上生物量高。

圖2 基于表型性狀數據的22份百脈根種質材料聚類分析熱圖

第II類群包含12份種質，種質編號為17，16，19，18，15，22，14，9，7，5，8和2，包含除眉縣的所有陜西種質(14，15，16，17，18，19)以及部分國外種質(5，7，22)，該類群種質整體表現為種莢和種子小，植株矮小，地上生物量低。第Ⅲ類群包含9份種質資源，種質編號為13，12，10，11，6，3，20，4和1，包含來自甘肅的全部2份種質(11，20)及部分國外種質(12，6，3，4，1)。與I、II類群不同，雖然類群Ⅲ種質的種莢及種子整體大于其它2個類群，但該類群種質整體表現為植株矮小，地上生物量低。

2.4 主成分綜合分析及評價

本研究首先對22份百脈根種質的11個性狀指標進行了KMO(Kaiser-Meyer-Olkin)檢驗和Bartlett's球形檢驗，結果顯示，KMO值=0.519>0.5，Bartlett's檢驗的P值小于0.001，拒絕零假設，因此可以進行主成分分析。

以特征值>1為標準，共提取到4個主成分(表3)，累積貢獻率達73.181%，這表明這4個主成分能夠代表11個表型性狀的大部分信息。其中，第1主成分特征值為2.590，貢獻率為23.549%，載荷較大的因子包括莖長(-0.752)、株高(-0.581)、冠幅(-0.708)、種子周長(0.516)及種子長(0.554)。第2主成分特征值為2.304，貢獻率為20.946%，載荷較大的因子包括種子周長(0.807)和種子寬(0.852)。第3主成分特征值為1.791，貢獻率為16.282%，載荷較大的因子包括種莢長(0.500)、種莢寬(0.570)、種莢厚(0.505)及種子長寬比(0.527)。第4主成分特征值為1.364，貢獻率為12.404%，載荷較大的因子包括種子長寬比(0.732)。

表3 主成分分析結果

隨后，我們將提取的4個主成分的方差貢獻率作為系數，結合公式(1)構建了綜合評價模型：F=0.23549y1+0.20946y2+0.16282y3+0.12404y4，并以評價得分為基準對各百脈根種質進行綜合評價，評價結果顯示(表4)，11和12號種質的得分最高，綜合表現整體優良。

表4 基于主成分分析的22份百脈根種質資源綜合得分

3 討論

種質資源表型性狀是植物基因型和環境互相影響的綜合體現[17]，因此具有相對穩定且豐富的表型變異特征[18]。對優質牧草百脈根種質資源的表型性狀進行遺傳多樣性分析，是百脈根種質資源研究的重要工作[19]，也是篩選特異牧草資源作為育種材料的前提[20]。本研究結果表明，除種寬外，22份百脈根種質間各性狀均存在顯著(P<0.05)的表型性狀差異，這些表型性狀的變異表明在各種質內存在潛在可用的遺傳變異。變異系數(Coefficient of variation，CV)反映不同種質特征性狀的變異程度，CV值越大，說明不同種質間相應的特征性狀的差異越大，之前的研究表明，當CV達到10%以上時，表明所選種質材料間有顯著差異[21-22]，這與本研究結果一致。此外，本研究中的22份百脈根種質的CV值均大于50%，可能是因為22份種質來自全球不同國家和地區，海拔，氣候等環境差別較大，而環境條件是種質資源遺傳變異的重要因素之一[23]。

22份百脈根種質表型性狀相關性分析表明，種子長寬比與種子周長間無顯著相關性，這與對小麥(Triticumaestivum)、青稞(Hordeumvulgare)的研究結果相似[24]。之前的研究表明，種子長寬比主要用來描述種子形狀，而與種子大小性狀無關[15]，結合本研究，百脈根的種子大小與種子形狀這兩個數量性狀可能也為獨立遺傳。百脈根種質的分枝數與莖長，株高和冠幅性狀間呈正相關，而這些表型性狀都是構成株型的重要因素，本世紀以來，包括玉米、水稻和小麥在內的眾多作物在株型育種中已經取得了較大的進展[25-27]。對于牧草而言，合理的株型能保證牧草在生長過程中利用良好的生長姿勢進行光合作用，進而提升產量[28]。本研究中，百脈根的株型性狀如株高、分枝數，都屬于數量性狀，應考慮各株型性狀間的相關性從而更全面的研究株型形成的機制，來改良百脈根株型性狀以提高其產量和品質。

聚類分析是植物育種的必要手段之一[29]，應用聚類熱圖分析可以直觀呈現多個種質的多個表型性狀值的全局大小變化，同時反映不同種質資源間的遺傳差異和各類群的特點。本研究中。通過聚類熱圖分析，將22份百脈根種質劃分為3個具有明顯差異的類群，第I類群包含的21號種質資源，與其它種質資源具有較遠的親緣關系，該種質株高和冠幅均大于其它種質。第II類群包含了除眉縣外的所有來自陜西省的種質及部分國外種質，表明來自同一生態區的百脈根種質表型性狀的差異不明顯，這也表明，盡管不同種質間的性狀特征和地理來源間可能存在一定的相關性，但地理來源并不對表型性狀起決定作用[12]。類群Ⅲ種質的種莢及種子隨整體大于其它2個類群，但該類群種質整體表現為植株矮小，之前的研究表明，大粒種子的萌發率高于小粒種子，因為相比小粒種子，大粒種子能夠儲存豐富的營養物質及更完整的酶系統，進而促進種子更快萌發[30]，但種子大小對植株形態特征的影響較小，可能是因為幼苗生長至營養物質的積累階段時，大粒種子的優勢不再顯著[31-32]。

由于百脈根種質材料表性狀指標眾多，且各指標間存在很強的相關性。因此，需要通過提取主成分，以降維的方法將指標重新組合，將多個性狀指標轉化為較少的幾個相關性不強的綜合指標，從而達到綜合和簡化的目的[33]，該方法在燕麥(Avenasativa)[34]，披堿草(Elymusdahuricus)[35]等植物種質資源的遺傳多樣性評價中廣泛運用。本研究中，11個聯系相關的指標經主成分分析，轉化為4個主成分，累計貢獻率達到73.181%，包含了大部分性狀信息，莖長、株高、冠幅、種子周長、種子長、種子寬和種子長寬比的主成分載荷較高，是造成百脈根種質資源表型差異的主要因素。在牧草育種研究中應充分利用主成分因子，有效選擇育種材料，以縮短育種周期[36]。基于主成分分析的綜合評價顯示，聚類分析后的第Ⅲ類群的11和12號種質主成分綜合得分最高，是2份綜合表現整體優良的種質材料，依據這些信息，在育種工作中，可根據實際用途或育種目標從中再進一步選擇，為選擇優良的育種親本或栽培材料提供參考，提高育種效率[37]。

4 結論

本研究已初步證明，參試的22份百脈根種質資源遺傳變異較大，11個表型數量性狀間具有廣泛相關性，各指標在各種質之間多樣性較豐富，通過聚類分析將22份種質分為3類，基于主成分綜合得分篩選出2份綜合表現優良的材料11和12號，并且這2份材料均聚類為同一類，具有較大的種莢和種子，可作為選育種子高產品種的目標親本加以利用。本研究可為百脈根的實際應用提供理論參考。