乳酸菌和糖蜜對構樹葉青貯品質和細菌多樣性的影響

孫 蓉，劉 悅，陳 婷，呂仁龍，周漢林，李 茂*，字學娟*

(1.海南大學林學院，海南 儋州 571737；2.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；3.中國熱帶農業科學院湛江試驗站，廣東 湛江, 524000)

近年來我國畜牧業發展迅速，飼料需求增大，飼料供給不足限制了畜牧業的發展，因此，開發新的飼料資源十分必要[1]。構樹(Broussonetiapapyrifera)，廣泛分布在我國溫帶、熱帶地區，具有生物量大、生長快、適應性強等特點[2]。構樹嫩枝葉營養價值高，可作為新型的飼料資源，開發構樹飼料有利于緩解我國飼料短缺問題。但構樹含有單寧等抗營養因子，影響動物適口性和營養物質消化吸收，研究表明對構樹葉進行青貯處理，可以提高構樹葉適口性和飼用價值[3]。然而構樹葉本身附著的乳酸菌很少，且粗蛋白高，含糖低，難以調制優質青貯飼料，為了改善構樹青貯發酵品質和提高其營養價值，可在青貯時添加糖蜜和乳酸菌[4-5]。外源乳酸菌的加入有利于快速產生乳酸，降低pH值抑制不良微生物生長，促進乳酸發酵，使原料得以長期保存[4-6]。糖蜜主要成分是蔗糖，常被用來當作乳酸菌的發酵底物應用于飼草青貯調制[6]。糖蜜可促進青貯發酵使飼料中的乳酸菌產乳酸從而降低pH值，并抑制丁酸產生和防止原料蛋白水解，進而提高青貯發酵品質[7]。糖蜜和乳酸菌在構樹青貯中應用已有報道，對改善發酵品質和提高飼用品質均具有積極作用[3-5]。但關于構樹青貯微生物多樣性的研究報道較少，糖蜜和乳酸菌對構樹青貯微生物組成的影響尚不明確。為保證構樹青貯發酵品質，深入了解青貯細菌的組成和豐度亦非常必要。因此，本研究采用16S高通量測序技術研究添加糖蜜、乳酸菌對構樹葉青貯細菌群落組成影響，為構樹葉青貯飼料的加工調制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

構樹于2019年6月從海南省儋州市中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所畜牧基地采集，構樹嫩莖葉在采摘后用電動鍘草機切碎至2～3 cm，再進行3.5小時的晾曬處理后備用。乳酸菌添加劑為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，活菌數≥1×1010cfu·g-1，由日本國際農林水產研究中心蔡義民研究員提供)，糖蜜為工業廢棄物。

1.2 試驗設計

實驗共有四個處理組，直接青貯為CK組、糖蜜為M組(2%，FM)、乳酸菌為L組(1×106cfu·g-1，FM)、糖蜜和乳酸菌混合添加為ML組(添加量同上)，每組3個重復，構樹葉和添加劑充分混勻后裝入專用塑料青貯袋中，抽真空后室溫存放30天后，打開青貯袋，取樣分析各項指標。

1.3 測定指標及方法

1.3.1營養成分測定 取青貯材料200 g左右放置于信封內，將其放入105℃干燥箱中20 min左右，最后再放入65℃的烘箱中烘48個小時，烘干多余的水分至恒重，待自然冷卻后進行磨粉裝樣，用作營養成分測定。

1.3.2發酵品質測定 青貯后開封，稱取50 g混合均勻的構樹葉青貯料，放入燒杯中，并加入200 mL蒸餾水置于4℃冰箱內浸取24小時，拿出燒杯對浸液進行過濾，濾液裝入塑料管中蓋緊，放入離心機離心后取出，一部分用于測定青貯發酵指標，另一部份放入-80℃液氮保存用于微生物多樣性分析[8]。其中pH值用pH計測儀進行測定，乳酸、乙酸、丙酸、丁酸按照Li等[9]方法進行測定。

1.3.3微生物多樣性分析測定 本研究中青貯微生物測序及分析由北京百邁客生物科技有限公司協助完成。將上述每一組的三個重復樣本均勻混合后經過處理提取樣本DNA，PCR擴增選用細菌16S rRNA(V3+V4)區域通用引物，具體序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，5′-GGACTAC-HVGGGTWTCTAAT-3′，再通過高通測序技術的雙末端測序方法，構建片段文庫進行測序，微生物測序是基于Illumina HiSeq測序平臺，采用雙末端測序(Paired-End)，構建小片段文庫進行測序，并對結果進行分析，包括Alpha多樣性指數(Ace指數、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數)、beta多樣性分析、微生物區系結構分析[8-10]。

1.4 數據處理

青貯微生物生物信息分析和作圖在百邁客云平臺(www.biocloud.net)完成。青貯發酵指標采用Excel 2003對數據進行整理，并采用SAS 9.3軟件包進行統計分析，結果用“平均值±標準差”表示，用Duncan法對各測定數據進行多重比較分析，P<0.05表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同添加劑對構樹葉青貯飼料發酵品質的影響

由表1可知，糖蜜的使用能降低構樹葉青貯的pH值(P<0.05)，糖蜜與乳酸菌混合使用降低pH值的效果低于單獨使用糖蜜；與CK相比，添加處理均能顯著提高構樹青貯飼料乳酸含量(P<0.05)；所有添加處理組的乙酸(P<0.05)、丙酸含量均降低，其中，M組的丙酸含量下降較明顯(P<0.05)，本研究中，所有添加處理組均未檢出丁酸。綜上，添加糖蜜及糖蜜、乳酸菌混合的構樹葉青貯效果優于直接青貯，亦優于乳酸菌單獨添加處理。其中，單獨添加糖蜜的青貯飼料發酵效果最好。

表1 構樹葉青貯發酵品質

2.2 構樹青貯α多樣性分析

構樹葉青貯細菌多樣性如表2所示，Shannon指數值越大表明微生物多樣性越高，M組的微生物多樣性最高，其次是ML組，CK組和L組最低且相同。Simpson指數值越小表明菌群豐度越高，菌群豐度從高到底依次為M組、ML組、CK組、L組。與對照組(CK)相比，乳酸菌(L)的添加使構樹葉青貯的細菌環境菌群豐度降低。糖蜜(M)及糖蜜、乳酸菌混合(ML)的添加，使構樹葉青貯細菌多樣性及豐度提高。

表2 構樹葉青貯α多樣性指數

如圖1所示，構樹葉青貯的OTU聚類分析共有111個不同的OTU被檢測到，從OTU貢獻數量來看，糖蜜、乳酸菌混合(ML)組的OTU數量最高，有109個，糖蜜(M)組的OTU數量107個，對照組(CK)組的OTU數量為106，乳酸菌(L)組的OTU數量為105個，說明ML組的細菌種類豐度最高。同時對四個處理組做OTU韋恩圖進行比較，發現四個處理組共享的OTU為101個，對照組(CK)和乳酸菌(L)組特有的OTU為0，糖蜜(M)組特有的OTU為1個，糖蜜和乳酸菌混合(ML)組特有的OTU為2個，說明M組和ML組均產生獨特的群落差異。

圖1 構樹葉青貯細菌群落OTU分析和韋恩圖

2.3 β多樣性分析

通過PCA分析不同處理OTU組成反映樣本間的差異，不同色點代表不同處理，不同色點之間的距離越近，表明不同處理之間細菌群落結構的相似性越高。由圖2可知，PC1成分的貢獻率為89.49%，PC2成分的貢獻率為3.53%。M組點與其他組距離較遠，說明其菌群結構組成與其他三組差異較大。CK與L組相對較靠近，表明兩組之間細菌群落結構比較相似。ML較為分散，其中有兩點距離其他組均較遠，說明ML組與其他三組的細菌群落結構也存在明顯差異。

圖2 構樹葉青貯β多樣性分析

2.4 構樹葉細菌群落結構分析

如圖3(A)所示，構樹葉青貯飼料細菌群落結構中，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為四個處理組的優勢菌門。其中厚壁菌門相對豐度最高是M組(68%)，接著是CK組(53%)、ML組(46%)、L組(44%)，變形菌門相對豐度由高到低依次為L組(51%)、ML組(47%)、CK組(42%)、M組(29%)。其他菌門包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria)，其相對豐度在四個處理組中均不足7%。M組厚壁菌優勢明顯說明在構樹葉青貯中，添加糖蜜可以增加厚壁菌門相對豐度，降低變形菌門相對豐度。

如圖3(B)所示，CK組的優勢菌為魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)，相對豐度分為34%，27%和17%。L組的優勢菌屬為魏斯氏菌屬(Weissella)和腸桿菌屬(Enterobacter)，相對豐度分別為37%，33%。M組的優勢菌是乳桿菌屬，相對豐度為64%。ML組的優勢菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和魏斯氏菌屬(Weissella)，相對豐度分別23%，32%，19%。其他菌屬包括泛菌屬(Pantoea)、埃希氏-志賀菌(Escherichia-Shigella)、拉烏爾菌屬(Raoultella)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、氣球菌屬(Aerococcus)等，其相對豐度在四個處理組中均不超于10%。M組中乳桿菌屬為顯著優勢菌屬，說明添加糖蜜可以提高乳桿菌屬的相對豐度，降低腸桿菌屬、魏斯氏菌屬及其他菌屬的相對豐度。

圖3 構樹葉青貯細菌群落組成(門和屬水平)

2.5 不同添加劑處理對青貯菌群豐度的影響

由圖4(A)可知，在門水平上，四組處理相對豐度較高的兩種細菌是厚壁菌門和變形菌門。與CK組相比，M組厚壁菌門相對豐度顯著提高(P<0.05)，而變形菌門相對豐度顯著降低(P<0.05)；相反，L和ML組的厚壁菌門相對豐度降低，變形菌門相對豐度提升。不同添加處理對構樹葉青貯細菌相對豐度的影響存在明顯差異，由圖4(B)可知，在屬水平上，相對豐度較高的菌屬為魏斯氏菌屬、腸桿菌屬和乳桿菌屬。與CK組相比，L組乳桿菌屬相對豐度顯著降低(P<0.05)，ML的乳桿菌屬相對豐度組則顯著提高(P<0.05)，M組的乳桿菌屬相對豐度極顯著提高(P<0.01)；M組的魏斯氏菌屬和腸桿菌屬相對豐度極顯著降低(P<0.01)，L組的腸桿菌屬相對豐度顯著上升(P<0.05)，ML組的魏斯氏菌屬相對豐度顯著下降(P<0.05)。由此可知，糖蜜(M)的單獨添加明顯改變了青貯細菌的菌群相對豐度，使乳桿菌屬大幅增加，腸桿菌屬、魏斯氏菌屬等不利菌顯著減少，有助于青貯發酵品質的提升。

圖4 構樹葉青貯細菌豐度差異分析

3 討論

3.1 乳酸菌和糖蜜對構樹青貯飼料發酵品質的影響

青貯發酵品質是由pH值和乳酸等有機酸及多因素共同決定的[11]。優良的青貯飼料含有較多的乳酸、丙酸以及少量的乙酸[12]。青貯飼料pH值低說明發酵效果好，反之越差，決定青貯飼料pH值下降的主要因素是乳酸和乙酸的含量，其中乳酸和乙酸的含量比是判斷青貯發酵好壞的重要指標。在本實驗中，糖蜜(M)及乳酸菌、糖蜜(ML)的混合添加使構樹葉青貯的乳酸含量與對照組相比有顯著提高(P<0.05)，且乳酸∶乙酸比例均大于1，該乳酸含量比對青貯發酵具有改善作用，與王超等[13]研究結果一致。構樹葉青貯飼料中添加糖蜜產生的乳酸最多，糖蜜的添加為乳酸菌發酵提供動力，使青貯飼料產生大量乳酸，進而降低青貯料pH值，抑制有害菌的生長，保證發酵產品的質量[14]。本實驗中，糖蜜和糖蜜、乳酸菌混合添加這兩個處理組對青貯發酵品質提升有促進作用，而乳酸菌添加處理對改善構樹葉青貯發酵品質沒有效果，說明發酵底物的缺乏對青貯發酵品質的限制作用遠大于乳酸菌數量的添加。華金玲等[15]研究結果也表明，乳酸菌單獨添加發酵效果不佳，為了提高發酵的質量需要添加糖類。穆麟等[16]研究表明糖蜜的添加可以降低青貯料pH值，與本實驗研究結果一致。乳酸菌的添加增加了發酵飼料的乳酸菌數量，其生長需消耗大量的發酵底物產生乳酸，但構樹原料本身含糖少，無法提供更多的發酵底物，糖蜜的添加則補足了發酵底物，促進青貯飼料中的乳酸菌生長，而單獨添加乳酸菌不能起到促進作用。

3.2 乳酸菌和糖蜜對青貯發酵過程中細菌多樣性的影響

青貯飼料發酵質量的好壞很大程度上由微生物組成決定[17]。青貯飼料發酵過程中菌群的豐度和結構的變化影響著青貯飼料的發酵品質和營養成分[18]。細菌群落組成對于控制發酵質量非常重要，發酵過程實質為乳酸菌與其他菌群間的動態變化[19]。充足的發酵基質和乳酸菌數量是青貯過程中發酵成功的關鍵因素[20]。青貯厭氧環境提供了乳酸菌生長條件，添加糖蜜為菌群生長提供了營養，使細菌快速繁殖，影響并改變青貯飼料的細菌結構[21]。在門水平上，構樹青貯菌群中四個處理組占絕對優勢的是厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。Eikmeyer等[22]研究中發現，在飼草青貯過程中，厚壁菌門占比較大。McGarvey等人[23]認為，苜蓿青貯飼料的主要優勢菌門是厚壁菌門和變形菌門。兩個研究均與本實驗結果一致。在屬水平上，乳桿菌屬(Lactobacillus)和魏斯氏菌屬(Weissella)、腸桿菌屬(Enterobacter)在四個處理組菌群中占優勢。研究發現，一般青貯發酵過程乳桿菌屬為主要優勢菌屬，與本實驗研究結果一致[24-25]。乳桿菌屬和魏斯氏菌屬通常能夠降低青貯環境的pH值，保證青貯發酵品質，乳桿菌屬的作用效果更佳，而腸桿菌屬屬于不良菌，腸桿菌屬的相對豐度增加使青貯環境pH值上升，限制其他有益菌的生長，不利于青貯發酵。乳桿菌屬能夠產生乳酸，降低青貯環境pH值，在青貯發酵過程起重要作用。糖蜜添加組(M)的乳桿菌屬相對豐度比魏斯氏菌屬高，其原因可能是魏斯氏菌屬主要在發酵前期發揮作用，發酵后期因糖蜜水解后為乳桿菌屬生長提供營養條件，使得乳桿菌屬數量快速增長。本研究結果表明，糖蜜的加入使構樹青貯pH值顯著下降(P<0.05)，由此可得出添加糖蜜后乳桿菌屬的相對豐度上升，對青貯有利，對改善青貯飼料發酵品質有明顯效果。張想峰等[26]認為乳酸桿菌對青貯發酵起重要作用，楊楊等[27]認為乳桿菌屬在青貯中，發揮著重要的作用，研究結果與本實驗一致。綜上研究結果可得，乳桿菌屬在青貯細菌群落結構中為優勢細菌，在保證青貯發酵品質中發揮主要作用。

4 結論

構樹葉直接青貯品質不佳，添加糖蜜或混合添加糖蜜、乳酸菌均能一定程度的改善青貯發酵品質，單獨添加乳酸菌對改善青貯發酵品質未起到良好作用。另外，糖蜜的添加改變構樹葉青貯飼料細菌群落結構，使乳桿菌屬相對豐度升高，魏斯氏菌屬和腸桿菌屬相對豐度降低，利于青貯發酵。綜合考慮，構樹葉青貯時單獨添加糖蜜便可獲得良好的效果。