黃連解毒湯含藥血清對(duì)Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡及GRP78/PERK/CHOP通路的影響

龍春頻 林泉峰 歐陽堅(jiān) 梁卉 袁曉兵

(萍鄉(xiāng)衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院腫瘤研究實(shí)驗(yàn)室，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知障礙和記憶喪失等。老年斑是AD的主要病理變化之一，其主要分布在海馬區(qū)及附近，由β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成〔1〕。研究顯示，Aβ能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮毒性作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷過程中涉及氧化應(yīng)激和線粒體凋亡〔2,3〕。黃連解毒湯成分為黃連、黃柏、黃芩、梔子，為清熱解毒的代表方。研究報(bào)道，黃連解毒湯能夠通過抗氧化應(yīng)激，降低梔子導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡〔4〕。黃連解毒湯還可以提高神經(jīng)營養(yǎng)因子水平，減輕氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)的毒性作用〔5〕。研究顯示，細(xì)胞凋亡除含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)依賴途徑外，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)也有密切聯(lián)系〔6〕。Gerakis等〔7〕報(bào)道，在AD患者的腦組織中，Aβ沉積可引起神經(jīng)元發(fā)生ERS，導(dǎo)致神經(jīng)元退變。目前對(duì)于黃連解毒湯含藥血清對(duì)Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡的影響及其中涉及的機(jī)制尚不明確。本研究觀察黃連解毒湯含藥血清對(duì)Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78/蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)/CCAAT-增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)通路的影響，初步探討黃連解毒湯含藥血清對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22購自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司；Aβ25～35購自MCE公司；2月齡、體重(200±10)g SPF級(jí)雄性SD鼠20只購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；6孔板、24孔板和96孔板購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和0.2%胰蛋白酶溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡(綠色熒光)檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、Caspase-3抗體、GRP78抗體、PERK抗體和CHOP抗體均購自Abcam(中國)公司。生物安全柜購自廣州淶泊銳科技股份有限公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；高速低溫離心機(jī)購自SIGMA公司；電泳儀、凝膠成像儀、酶標(biāo)儀均購自Bio-Rad公司。

1.2Aβ25～35溶液制備 將Aβ25～35溶于去離子水中，用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾，37℃孵育7 d，-20℃避光保存。實(shí)驗(yàn)使用10 μmol/L Aβ25～35〔8〕作用于海馬神經(jīng)元細(xì)胞建立損傷模型。

1.3黃連解毒湯含藥血清制備 黃連解毒湯處方：黃連9 g、黃柏6 g、黃芩6 g、梔子9 g，加蒸餾水煎煮濃縮至1∶2，待冷卻后緩慢加入乙醇攪拌，使含醇量達(dá)50%后靜置2 d，過濾取上清并回收乙醇，藥劑使用前加蒸餾水稀釋至所需濃度。將20只SD鼠隨機(jī)分為空白組和黃連解毒湯低、中、高劑量組，每組5只，用藥劑量按照動(dòng)物體表面積比率換算等劑量法，黃連解毒湯低、中、高劑量組大鼠分別以2.7、5.4、8.1 g/kg灌胃給藥，空白組給予蒸餾水灌胃，灌胃1次/d、2 ml/次，連續(xù)7 d。最后1次給藥3 h后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈穿刺取血，離心取上清并除菌滅活，儲(chǔ)于-20℃環(huán)境備用。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將HT22細(xì)胞隨機(jī)分為5組，每組各設(shè)置10個(gè)平行對(duì)照：1、對(duì)照組：給予HT22細(xì)胞空白血清培養(yǎng)24 h；2、Aβ組：向HT22細(xì)胞中加入Aβ25～35(40 μmol/L)和空白血清，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；3～5、黃連解毒湯低、中、高劑量組：向HT22細(xì)胞中加入Aβ25～35(40 μmol/L)1 h后再加入黃連解毒湯含藥血清，培養(yǎng)24 h。

1.5MTT法檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性 將HT22細(xì)胞以5×104個(gè)/ml的密度接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，按照1.4中的分組進(jìn)行處理。每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后，1 500 r/min離心10 min，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，避光并用振蕩器混勻，通過酶標(biāo)儀測(cè)定每孔細(xì)胞的570 nm吸光度(A)值。細(xì)胞活性(%)=(A1～5-A空白組)/(A1-A空白組)×100%，空白組為150 μl的細(xì)胞培養(yǎng)基，用以排除培養(yǎng)板和培養(yǎng)基本底吸光值對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

1.6TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 在24孔板中放入已消毒的蓋玻片，加入密度為5×105個(gè)/ml的HT22細(xì)胞培養(yǎng)過夜，按照1.4中的分組進(jìn)行處理，遵循TUNEL檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)取出的蓋玻片進(jìn)行固定、洗滌、孵育和顯色，熒光顯微鏡下觀察。用不含末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記液代替TUNEL混合反應(yīng)液作陰性對(duì)照，用陽性對(duì)照試劑盒為陽性對(duì)照。計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡(陽性)細(xì)胞數(shù)/視野細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7Western印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、PERK和CHOP蛋白蛋白表達(dá)水平 將HT22細(xì)胞以1×106個(gè)/ml的密度接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，按照1.4中的分組進(jìn)行處理。棄去培養(yǎng)基后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止后低溫1 500 r/min離心10 min，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，再次離心棄上清，加入細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，小心取出凝膠并使用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行聚偏氯乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜，在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，加入稀釋(1∶1 000)的對(duì)應(yīng)一抗，4℃搖床孵育過夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1∶2 000)的二抗溶液，室溫?fù)u床1 h，洗膜3次，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1黃連解毒湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 對(duì)照組HT22細(xì)胞呈現(xiàn)多極形或錐形，細(xì)胞間突起相互連接成網(wǎng)，胞體折光性強(qiáng)。Aβ25～35處理細(xì)胞后，細(xì)胞突起收縮，胞間連接斷裂，胞體折光性下降，可見部分胞體溶解死亡。黃連解毒湯含藥血清干預(yù)細(xì)胞后，可明顯改善Aβ對(duì)HT22細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損傷，見圖1。

2.2黃連解毒湯對(duì)Aβ?lián)p傷HT22細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組相比，Aβ組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)；與Aβ組相比，黃連解毒湯各組的細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)，見表1。

2.3黃連解毒湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，Aβ組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與Aβ組比較，黃連解毒湯各組的細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05)，見表1、圖2。

圖1 黃連解毒湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(TUNEL染色，×400)

表1 黃連解毒湯對(duì)Aβ?lián)p傷HT22細(xì)胞活性、凋亡、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平及GRP78、PERK和CHOP蛋白表達(dá)的影響

圖2 黃連解毒湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL染色，×100)

2.4黃連解毒湯對(duì)Aβ?lián)p傷HT22細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白水平的影響 與對(duì)照組相比，Aβ組細(xì)胞Bcl-2/Bax水平顯著降低，cleaved-/pro-Caspase-3水平顯著升高(均P<0.05)；與Aβ組比較，黃連解毒湯各組細(xì)胞Bcl-2/Bax水平顯著升高，cleaved-/pro-Caspase-3水平顯著降低(均P<0.05)，見表1、圖3。

2.5黃連解毒湯對(duì)Aβ?lián)p傷HT22細(xì)胞GRP78、PERK和CHOP蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，GRP78、PERK和CHOP蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)；與Aβ組比較，黃連解毒湯各組細(xì)胞GRP78、PERK和CHOP蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)，見表1、圖4。

1～5:對(duì)照組，Aβ組，黃連解毒湯低劑量組，黃連解毒湯中劑量組，黃連解毒湯高劑量組；圖4同

圖4 黃連解毒湯對(duì)Aβ?lián)p傷HT22細(xì)胞GRP78、PERK和CHOP蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

AD屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，患者在記憶、運(yùn)動(dòng)和語言等方面發(fā)生障礙，嚴(yán)重者喪失生活自理能力。AD患者神經(jīng)系統(tǒng)病變主要包括：Aβ沉積形成的老年斑、細(xì)胞內(nèi)異常磷酸化蛋白聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)和細(xì)胞凋亡造成的神經(jīng)元突觸連接丟失〔9〕。越來越多的研究顯示，誘發(fā)AD的各種原因中均涉及Aβ積聚和沉積，它是AD發(fā)生的關(guān)鍵因素〔10～12〕。因此，如何解除Aβ引起的神經(jīng)元損害，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，成為AD治療策略相關(guān)研究的一個(gè)焦點(diǎn)。

Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡過程中涉及的一類調(diào)節(jié)因子，它的成員抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax是否平衡對(duì)細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡通路起重要作用。Bcl-2維持線粒體膜通透性，保護(hù)線粒體的完整性，減少細(xì)胞色素C的釋放，抑制細(xì)胞凋亡；Bax則影響線粒體膜的滲透性，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體膜間隙進(jìn)入胞漿，間接促進(jìn)Caspase-3剪切激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔13,14〕。黃連解毒湯是經(jīng)典的清熱解毒方。有報(bào)道稱，黃連解毒湯可通過清除或減少Aβ、抑制微管相關(guān)蛋白Tau過度磷酸化和抗感染等多種途徑對(duì)AD起到治療作用〔15〕。張茹蘭等〔16〕研究報(bào)道，黃連解毒湯含藥血清可通過抗氧化應(yīng)激和抑制線粒體凋亡途徑來減輕Aβ誘導(dǎo)HT22細(xì)胞毒性作用，降低細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示，黃連解毒湯能夠逆轉(zhuǎn)Aβ引起的海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力降低，抑制細(xì)胞凋亡，可能通過抑制氧化應(yīng)激及線粒體凋亡實(shí)現(xiàn)。

有研究報(bào)道，ERS與細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系〔6〕。ERS由細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境改變導(dǎo)致，會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)發(fā)生聚集和鈣流失導(dǎo)致的穩(wěn)態(tài)失衡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)紊亂，大量促凋亡蛋白被激活，誘導(dǎo)ERS反應(yīng)性細(xì)胞凋亡〔17〕。長時(shí)間持續(xù)的ERS會(huì)啟動(dòng)GRP78/PERK/CHOP凋亡通路，正常結(jié)合在GRP78上的PERK被解離下來并得到激活，促進(jìn)其下游促凋亡基因CHOP的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔18〕。Xu等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，靜壓引起大鼠髁突軟骨細(xì)胞發(fā)生ERS，GRP78、PERK和CHOP表達(dá)上調(diào)，激活凋亡通路引起細(xì)胞凋亡。Yi等〔20〕在建立的神經(jīng)元ERS模型中檢測(cè)到PERK和CHOP蛋白表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致下丘腦神經(jīng)損傷。本研究結(jié)果表明，黃連解毒湯可能抑制GRP78/PERK/CHOP通路的激活，提示黃連解毒湯還可能通過抑制ERS，抑制Aβ所誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步豐富了黃連解毒湯的藥理作用。

綜上，黃連解毒湯含藥血清可降低Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，抑制GRP78/PERK/CHOP通路激活，發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。但AD涉及的信號(hào)通路及作用機(jī)制較復(fù)雜，需要深入研究。