基于Notch1/Hes1信號通路探討葛根素對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡和心室重構的影響

張馳 徐莉 任浩進 徐超 劉金華 王麗岳

(武漢市普仁醫(yī)院，湖北 武漢 430081)

傳統理論認為，心肌梗死發(fā)生時心肌細胞的首要表現就是壞死，但根據最新試驗證實，長時間缺血會使心肌細胞發(fā)生明顯凋亡的一系列特征，隨后發(fā)生壞死〔1〕。心肌細胞凋亡的發(fā)生區(qū)域包括梗死中心區(qū)、邊緣區(qū)甚至涉及遠處的存活心肌細胞。持續(xù)進行的細胞凋亡會導致進行性心肌細胞丟失、細胞中膠原支架斷開及心室壁的厚度下調，發(fā)生心室重構最終演變?yōu)樾乃ァ＜毎蛲鲞^程受多基因的共同調控，B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)分別是促進和抑制細胞凋亡的標志性基因，與凋亡過程相關〔2〕。葛根素屬于中藥葛根中的一種異黃酮化合物，其藥理作用廣泛，抑炎、抗凋亡、抗氧化及調節(jié)血管舒張等，被認為是能夠用于治療心肌梗死、心絞痛、冠心病等一系列心血管病的藥用有效成分〔3～5〕。而目前，葛根素對于心梗造模大鼠的心臟一系列功能的影響和涉及的生物學機制尚不明確。缺刻基因(Notch)1/發(fā)狀分裂相關增強子(Hes)1信號通路屬于一條保守進化的生物胞間轉導通路，研究發(fā)現其對于細胞增殖、生長、分化和組織器官發(fā)育發(fā)揮一定作用，該通路活化也與多種炎癥、氧化應激反應過程密切相關〔6～8〕。有研究指出，激活Notch1/Hes1通路能夠具有心肌保護效應，而其是否參與了心肌梗死中的心肌保護過程未見相關報道〔9〕。本研究建立心肌梗死大鼠模型，基于Notch1/Hes1信號通路探討葛根素對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡和心室重構的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 雄性Wistar大鼠(購自中國科學院生物研究所)、葛根素(購自四川玉鑫藥業(yè)有限公司)、戊巴比妥(購自陜西漢江藥業(yè)股份有限公司)、HE染液(索萊寶科技有限公司)、Notch1的胞內片段(NICD)一抗及二抗、Hes1一抗及二抗、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)一抗及二抗、p-蛋白激酶B(Akt)一抗及二抗、Bcl-2一抗及二抗、Bax一抗及二抗(購自北京奧維亞生物技術有限公司)、原位末端缺刻標記法(TUNEL)檢測試劑盒(購自武漢普健生物科技有限公司)、蛋白酶K(購自武漢普健生物科技有限公司)、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑(購自上海雙贏生物科技有限公司)。

1.2模型制備 制備心肌梗死大鼠模型時，首先使用3%質量分數的戊巴比妥(劑量為40 mg/kg)進行腹腔注射麻醉，進行口氣管固定之后連接呼吸機，從大鼠的左側3～ 4肋骨間一步步打開胸腔及心包，待心臟暴露出來，使用絲線對大鼠冠脈前降支進行結扎，通過心電圖可以觀察到ST段明顯抬高，心臟左室前壁發(fā)白，模型建造成功后，使肺部完全膨脹，排出胸腔的氣體進行胸腔關閉。

1.3分組 將96只雄性Wistar大鼠(200～250 g)隨機分成3組：對照組：進行假手術，穿線操作相同但不進行結扎；模型組：按照模型制備操作結扎大鼠心臟冠脈；葛根素干預組：同模型組進行模型制備后24 h進行腹腔注射葛根素120 mg/(kg· d)，對照組和模型組均腹腔注射與其等量的生理鹽水，1次/d。3組按照術后1、2、3、4 w記錄各時間點血液流變學指標后處死大鼠，每組每個時間點8只大鼠。

1.4血液流變學指標檢測 對大鼠麻醉處理固定后進行右頸總動脈的分離，插入PE-50導管于頸部總動脈，待數值穩(wěn)定觀察動脈收縮壓(SBP)，再將導管移入左心室，通過BL-420生物機能實驗系統對左室舒張末期壓(LVEDP)、左室壓上升(下降)最大速率(±dp/dt max)進行測量。

1.5大鼠心臟質量和心肌梗死面積檢測 各組大鼠處死后得到心臟，使用0.85%氯化鈉洗滌吸干水分后進行全心重量(THW)、左心室的實際重量(LVW)稱量，分別除以大鼠整體體重(BW)，兩者比值能夠提示全心、左心室肥厚程度。沿左室長軸的垂直線將其均分4份，每一份中選取5 μm心臟組織行蘇木素-伊紅(HE)染色，成像后進行分析，取心內、外膜表面的梗死瘢痕弧長和心內、外膜表面周長的均值。心肌梗死面積=(瘢痕外弧長+瘢痕內弧長)/(內周長+外周長)× 100%。

1.6制備心肌組織切片 各組大鼠處死后得到心臟，濃度為0.85%的氯化鈉進行反復沖洗后再運用10%的甲醛進行細胞24 h固定，經過石蠟包埋處理對心梗病灶周圍1 mm以內的心肌組織沿左室軸線進行4 μm厚石蠟切片處理，進行HE染色顯微鏡下觀察，并通過Western印跡法檢測Notch1/Hes1信號通路蛋白及Bcl-2、Bax蛋白表達。

1.7檢測心肌細胞凋亡 通過TUNEL選取各組切片各5張，按照TUNEL試劑盒操作說明書進行檢測。首先進行固定包埋切片，隨后脫蠟處理，運用H2O2封閉處理0.5 h，使用濃度為25 mg/L的蛋白酶K對膜、核蛋白進行消化，再向其中加入一定量的TUNEL反應液，室溫條件下孵育1 h，添加抗熒光素抗體及DAB顯色試劑，經過蘇木素復染、脫水、透明操作后進行封片。在400倍視野觀察每張切片的5個不同視野總細胞數和細胞凋亡數目，凋亡系數=細胞凋亡數/總細胞數。

1.8統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行SNK-q檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1心肌梗死大鼠模型的制備結果 建立心肌梗死大鼠模型后，大鼠的整體死亡率為34.50%，模型組死亡率為16.50%，葛根素干預組死亡率為14.80%，模型組和葛根素干預組比較無統計學差異(P>0.05)，模型制備結束后對模型組大鼠進行開胸檢查發(fā)現心臟肥大，左心室的游離壁上一部分心臟肌肉變薄、發(fā)白，同時可見心肌梗死灶存在。見圖1。

A：大致觀察；B：光學顯微鏡下觀察(×200)，箭頭指向心肌梗死灶

2.2各組血液流變學指標 模型組及葛根素干預組血液LVEDP較相同時間的對照組顯著上升(P<0.05)，±dp/dt max及SBP則明顯下調(P<0.05)。3 w時，葛根素干預組+dp/dt max和SBP較相同時間的模型組顯著上升(P<0.05)，LVEDP則明顯下降(P<0.05)；2 w時，葛根素干預組-dp/dt max較相同時間的模型組顯著上升(P<0.05)。見表1。

2.3各組心肌梗死面積及左心室重量比較 術后不同時間點各組BW無統計學差異(P>0.05)，模型組和葛根素干預組心肌梗死面積差異顯著(P<0.05)。術后4 w時，模型組THW/BW、LVW/BW數值較對照組顯著上升(P<0.01)，使用葛根素干預可以顯著削減心肌梗死模型大鼠左心室肥大現象(P<0.05)。見表2。

表1 各組血液LVEDP、SBP、+dp/dt max、-dp/dt max比較

表2 各組心梗面積及左心室重量的比較

2.4各組心肌細胞凋亡結果 光學顯微鏡下不同程度染色的棕褐色代表凋亡心肌細胞核，輪廓清晰，藍色染色的代表正常心肌細胞核，而心肌壞死細胞的輪廓結構不清晰。術后1 w對照組心肌梗死灶附近未出現細胞凋亡現象，心肌細胞核呈現藍色，葛根素干預組及模型組均出現心肌細胞凋亡現象，葛根素干預組心肌凋亡細胞核數比模型組顯著下調，凋亡著色變淺。葛根素干預組心肌梗死灶附近的凋亡心肌細胞均比相同時間點模型組顯著下降(P<0.01)。見圖2、表3。

圖2 手術后1 w各組心肌細胞凋亡狀況(TUNEL染色，×400)

表3 不同時間模型組和葛根素干預組心肌細胞凋亡系數對比

2.5各組Bax/Bcl-2比值隨時間的變化 術后1、3、4 w時，模型組Bax/Bcl-2數值較相同時間的對照組顯著上升(P<0.05)，術后3、4 w時，模型組的Bax/Bcl-2數值較同組術后1 w時顯著上升，且4 w時上升更加顯著(P<0.05)，4 w時，葛根素干預組Bax/Bcl-2數值較模型組顯著下降(P<0.05)。見表4。

表4 不同時間點各組心肌細胞Bax/Bcl-2變化

2.6各組Notch1/Hes1信號通路蛋白表達比較 干預4 w后，模型組心肌組織中的NICD、Hes1及PTEN蛋白及p-Akt表達與對照組有統計學差異(P<0.01)；葛根素干預組心肌組織中的NICD、Hes1、p-Akt/Akt、PTEN蛋白表達均與對照組和模型組存在顯著性差異(均P<0.01)。見表5、圖3。

表5 各組干預4 w后Notch1/Hes1信號通路蛋白表達比較

圖3 各組Notch1/Hes1信號通路蛋白表達比較

3 討 論

研究發(fā)現，心肌梗死主要病理機制涉及冠狀動脈閉塞所引發(fā)的心肌組織缺氧及缺血。心肌梗死也是導致心臟功能損傷的主要原因，嚴重情況下會使患者在短時間內發(fā)生死亡。心肌梗死的病理表現同時包括心肌大面積壞死及心肌收縮力減弱，從而導致供血不足及其他惡性并發(fā)癥的發(fā)生，對于患者的生活品質產生嚴重影響。所以，對于防治心肌梗死的相關課題一直是學術研究的熱點〔10～12〕。心肌梗死一般會在急性缺血期出現細胞死亡現象，并且在亞急性、慢性期丟失存活細胞，以上現象主要與心肌細胞的凋亡有關。心肌細胞發(fā)生凋亡后會被纖維組織及成纖維細胞取代，促進了心力衰竭的進展及心功能減退。相關研究發(fā)現，抑制心肌梗死模型鼠的心肌細胞凋亡能夠顯著改善心臟功能，抑制心肌細胞的病理變化，同時顯著阻止心肌的受損〔13〕。所以，控制心肌細胞發(fā)生凋亡將會是治療心肌梗死的可行性方法。葛根素屬于傳統中草藥葛根中的重要活性成分，其多重藥理活性包括促進血流微循環(huán)、舒張血管、抗感染、抗氧化及抗凋亡等，所以其在高血壓、心臟病、心絞痛、心肌受損等一系列心血管病中能夠發(fā)揮重要作用〔14〕。有研究報道指出，葛根素能夠顯著抑制慢性心衰模型大鼠的心肌炎癥及心肌細胞凋亡，明顯提高模型鼠生存率并改善心功能。另外有試驗發(fā)現，葛根素能夠顯著控制糖尿病模型鼠被誘導的心肌細胞凋亡，控制心肌梗死面積從而進行對心臟的保護作用〔15〕。

研究發(fā)現，心肌梗死發(fā)生之后，心肌梗死的周邊區(qū)域細胞凋亡顯著。本次研究結果提示，葛根素于早期即能夠保護一部分心肌，細胞凋亡數隨時間推移顯著下調。凋亡過程是受相關基因調控的，激發(fā)、抑制均受不同基因的控制，Bax、Bcl-2基因分別促進和抑制細胞的凋亡。Bcl-2/Bax數值即能夠體現細胞存亡，Bcl-2蛋白水平的上調會使Bax/Bcl-2下調，表明細胞凋亡被抑制，細胞能夠存活，相反，Bax蛋白的過度表達促進細胞死亡〔16～18〕。本研究結果提示，心肌細胞缺血受損時Bcl-2馬上被啟動，Bcl-2基因產物能夠逆轉心肌細胞凋亡過程，對心肌梗死中的存活細胞進行保護，心肌梗死的慢性時期，增生膠原纖維促使梗死附近的心肌組織缺氧、缺血，誘導了凋亡發(fā)生過程，促進Bax的表達過度。本研究發(fā)現，葛根素主要在后期抑制細胞凋亡，并且隨時間推移，心肌細胞凋亡顯著下降。

心肌梗死發(fā)生時的心室重構過程屬于心臟對血液流變學變化的代償反應，阻止細胞凋亡、降低細胞進行丟失概率，會顯著改善左心室的功能〔19～21〕。本研究表明，心臟的彈性功能受到明顯損傷，提示葛根素在后期發(fā)揮主要作用，下調左室的充盈壓，進行左心室功能改善。本研究結果提示，心肌梗死的面積大小取決于心梗發(fā)生的開始短時期，葛根素作為中藥成分可能藥效作用緩慢。同時，長時間運用葛根素干預能夠減輕全心、左心肥大，心室重構過程得到抑制。此外，葛根素干預能夠明顯激活Notch1/Hes1信號通路的表達。

綜上，心肌梗死大鼠心肌細胞會發(fā)生明顯凋亡現象，并且伴隨左心室功能降低，使用葛根素進行干預能夠通過促進Bcl-2抑制Bax基因的表達一定程度上減輕心肌細胞凋亡，有助于左心室功能改善以及減輕心室重構，這些過程與其激活Notch1/Hes1信號通路的表達密切相關。