殼寡糖調節db/db小鼠糖脂異常和抗氧化作用

程沁園 馬明 嚴琳 吳小瑜

(無錫衛生高等職業技術學校，江蘇 無錫 214111)

糖尿病是我國老年人群中的高發性疾病之一，是由于胰島素生成缺陷或(和)作用缺陷而引起的血糖水平超高〔1〕，其中90%以上均為2型糖尿病。其發病機制尚未完全探明，主要與遺傳因素、環境、生活方式與免疫等因素密切相關〔2〕。db/db小鼠屬遺傳性肥胖2型糖尿病動物模型，其發病與瘦素基因有關，可用于2型糖尿病血脂紊亂的研究和抗糖尿病物質的篩選〔3〕。糖尿病前期是介于糖代謝正常與糖尿病之間的一個狀態，包括空腹血糖受損(IFG)和糖耐量受損(IGT)，我國20 歲以上人群中糖尿病前期比例高達15.5%〔4〕。糖尿病前期不是一種疾病，而是一種不穩定的狀態，既可以進一步發展為顯性糖尿病，也可通過適當的干預措施而恢復正常或延長此過渡期〔5〕，對該人群進行早期干預，可使2型糖尿病發病危險降低58%〔4〕，因此選擇合適化合物對其進行干預具有重要的研究意義。殼聚糖是來源于甲殼類動物的一種線性多糖，其部分水解產物殼寡糖(COS)具有與其類似的生物活性，如抗菌、降低膽固醇、抗腫瘤等〔6～12〕。COS曾被報道具有降血糖作用〔13～15〕，臨床試驗表明，COS顯著改善了血糖水平、糖化血紅蛋白、促炎細胞因子及脂聯素水平〔16〕。然而，由于COS活性受分子量和脫乙酰度等性質的影響較大，各研究結論并不一致。同時關于COS在糖尿病前期的影響研究較少，一般都是出現血糖異常后才開始服用COS，對于其是否能預防或延緩糖尿病前期向糖尿病發展的作用有待研究。本文以db/db小鼠為自發性2型糖尿病模型動物，在其血糖尚未異常時給予不同劑量COS，探索COS在糖尿病前期和糖尿病發生、發展過程中對血糖異常、血脂異常和體內氧化應激等過程的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 自發性糖尿病db/db小鼠40只〔SPF標準，許可證號：SCXK(蘇)2016-0010〕，雄性，4周齡，體重(24.0±2.0)g，購于常州卡文斯實驗動物有限公司，穩定飼養1 w以適應環境。

1.2試劑及設備 COS(Mw=1 000 Da)，購自浙江金殼藥業股份有限公司，生產批號M-KG-1809001。正置顯微鏡：NIKON公司，型號ECLIPSE Ni；石蠟切片機：湖北徠克醫療儀器有限公司，型號SQ2125；攤片機：湖北徠克醫療儀器有限公司，型號PPTHK-21B；顯微圖像分析系統：NIKON公司，型號DS-Ri2；血糖測定儀：江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，型號306悅準Ⅱ型；血糖試紙：江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，生產批號380224；糖原、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、總蛋白定量測試盒：均為南京建成生物工程研究所；蘇木素染液，珠海貝索(BASO)生物技術有限公司，貨號714094；伊紅染液，珠海貝索(BASO)生物技術有限公司，貨號BA4099；其余試劑均為國產分析純。

1.3動物分組及受試物劑量 小鼠隨機分為4組，每組10只，其中對照(Control)組按體重每日灌胃生理鹽水(10 ml/kg)；COS低、中、高劑量(COS-L、COS-M、COS-H)組每日稱重后按250、500、1 000 mg/kg體重劑量灌胃COS溶液。連續給藥16 w，各組均自由進食飲水。

1.4指標觀察 (1)每日給藥后觀察各組小鼠的一般狀況并記錄。(2)血糖測定〔17〕：每周測定1次空腹血糖(FBG)。提前禁食8 h，取小鼠尾尖血約5 μl，用血糖儀測定即得FBG。(3)口服糖耐量測定(OGTT)〔18〕：每4 w測定1次。提前禁食8 h，每組按體重灌胃250 mg/kg葡萄糖，分別于0.0、0.5、1.0、2.0 h取尾尖血測定餐后血糖值(PG)，計算曲線下面積(AUC)。 (4)糖尿病病程判斷：根據2012年世界衛生組織(WHO)診療標準〔13〕，db/db小鼠FBG≥7.0 mmol/L或OGTT試驗中2 h PG≥11.1 mmol/L時即為糖尿病；6.1 mmol/L≤FBG<7.0 mmol/L且OGTT試驗中2 h PG<7.8 mmol/L時為IFG階段；7.8 mmol/L≤OGTT試驗中2 h PG<11.1 mmol/L且FBG<7.0 mmol/L時為IGT階段。(5)血脂指標檢測：給藥周期結束后采血，按測試盒說明書操作測定TC、TG、HDL-C、LDL-C等各項指標。(6)肝糖原和肌糖原測定：給藥周期結束后斷頸處死db/db小鼠，取其肝臟和右后肢股直肌，用生理鹽水清洗干凈后按照測試盒說明書進行測定。(7)肝臟抗氧化指標檢測：取db/db小鼠部分肝臟，用生理鹽水清洗干凈后吸干表面，按照測試盒說明書操作測定總蛋白、SOD、GSH-Px、MDA等各項指標。(8)器官系數及組織學檢查：db/db小鼠處死后立即剖取胰腺、肝、脾、腎等器官，生理鹽水清洗干凈后吸干表面，稱重計算器官系數(器官重量與小鼠體重之比)。各器官作組織切片，蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察其組織學變化。

1.5統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1COS對血糖的影響 Control組db/db小鼠FBG上升很快，第1周即已超過6.1 mmol/L，進入IFG階段；第3周已超過7.0 mmol/L，進入糖尿病階段，病程發展較為迅速。COS對FBG控制見效快，攝入1 w后即可顯著降低FBG(P<0.05)，至第3～4周時各劑量均已可顯著降低FBG(P<0.01)；至第16周時，COS-L、COS-M、COS-H各組FBG分別較對照組降低了40.89%、39.27%和51.01%。見表1。

表1 攝入COS對各組FBG的影響

2.2攝入COS對各組OGTT實驗中AUC的影響 COS降低AUC的作用十分迅速且顯著，自第4周起各COS組的AUC即顯著低于Control組(P<0.01)；至試驗結束時，COS各劑量組AUC分別較對照組降低了20.55%、19.53%和20.87%，即該作用無劑量依賴性。見表2。

2.3COS對各組db/db小鼠自發性2型糖尿病發展進程的影響 Control組平均進入IFG階段的時間是在試驗第1周，進入IGT階段并發展為糖尿病的速度較快，第2周已進入糖尿病階段；COS各組進入糖尿病前期和糖尿病階段的時間均有一定的延后，但均在第2～3周進入IFG階段，在第5～6周時進入糖尿病階段。COS對延長db/db小鼠IGT階段的效果較好，尤其是在COS-H組中db/db小鼠進入IGT階段的時間被延長至第6周。攝入低、中、高劑量的COS可延長db/db小鼠處于糖尿病前期的時間，使其進入糖尿病階段的時間分別延長至第4周、第5周和第5周(Control組為第2周)，即可延緩db/db小鼠的自發性2型糖尿病的發展進程。見表3。

表2 攝入COS對AUC的影響

2.4COS對肝糖原和肌糖原的影響 與Control組相比，各劑量COS組均可顯著地提高肝臟和肌肉中糖原的含量，且具有劑量依賴性(均P<0.05)。見表4。

2.5COS對血脂的影響 與Control組比較各劑量COS組血清TC、TG、LDL-C水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)，HDL-C水平無統計學差異(P>0.05)。見表4。

2.6COS對肝臟抗氧化指標的影響 與Control組比較，各劑量COS組肝組織內SOD和GSH-Px比活力有所提高，COS-M組和COS-H組SOD、GSH-Px比活力明顯提高，COS-L組、COS-M組、COS-H組MDA水平顯著降低(均P<0.01)。見表5。

2.7COS對器官系數和組織學檢查的影響 攝入COS對db/db小鼠胰腺、肝臟、脾和腎等器官系數的影響如表5所示。與Control組比較，COS-L組、COS-M組、COS-H組胰腺和腎的器官系數差異顯著(均P<0.01)，肝臟和脾器官指數差異不顯著(P>0.05)。見表5。組織切片結果見圖1，Control組胰腺萎縮，形狀不規則，有炎細胞浸潤，胰腺受損，COS各組胰腺均為較完整的橢圓形，形態較為完好，炎細胞減少，即COS對胰腺組織具有一定的保護作用，可部分抵御血糖異常引起的胰腺損傷。COS組肝臟內脂肪空泡數量明顯減少(圖中黑色箭頭所示)，肝細胞排列整齊，肝組織形態有所改善。

表3 各組自發性2型糖尿病發生發展情況

表4 COS對各組db/db小鼠肝糖原、肌糖原和血脂的影響

表5 攝入COS對肝臟抗氧化指標的影響及器官系數的變化

圖1 COS對各組胰腺組織的影響(HE染色，×200)

3 討 論

國際糖尿病聯盟的研究表明，幾乎所有的2型糖尿病患者發病前都要經過糖尿病前期階段(IGT或IFG)，而且隨著病程的逐漸延長，其轉化為糖尿病的自然年轉化率逐年升高〔19〕。糖尿病前期階段是一可逆階段，人體內糖代謝、脂代謝等已開始處于代償性紊亂狀態，是由正常人群向糖尿病患者過渡的階段。因此，對糖尿病前期人群進行及時有效的干預和治療，通過改變飲食習慣和增加體育鍛煉，并輔以必要的藥物干預，對延緩糖尿病前期向2型糖尿病轉變，減少相關并發癥等有著非常重要的作用〔20〕。已有多篇文獻報道COS具有較好的降血糖作用〔1，17，21，22〕，然而其作用對象均為已發生血糖異常的患者或動物，且降糖效果隨COS性質、實驗對象等不同而有較大差異。

本研究結果表明，COS可將db/db小鼠進入IFG、IGT和糖尿病階段的時間都有所延后，延長其處于糖尿病前期的時間，對自發性糖尿病的發生發展具有一定的阻滯作用。肝臟是哺乳動物進行葡萄糖新陳代謝的一個主要場所，通過進行糖原合成以及糖酵解過程增加肝臟葡萄糖的攝取，通過糖原分解和糖異生作用增加肝臟葡萄糖的輸出，從而保持機體血糖處于一個相對穩定的狀態〔23〕。2型糖尿病患者的胰島素抵抗在肝臟組織主要表現為肝糖輸出增多，從而造成FBG升高〔24〕。骨骼肌也是2型糖尿病胰島素抵抗發生的主要組織，由小腸吸收的葡萄糖經門靜脈先被肝臟攝取和利用，其余進入體循環的葡萄糖主要被骨骼肌攝取，代謝轉化為肌糖原儲存，因此骨骼肌攝取葡萄糖的減少是餐后血糖升高的主要原因之一〔17〕。已有研究顯示〔6〕，COS的降糖機制可能與骨骼肌細胞葡萄糖攝取增加、肝葡萄糖生成減少有關，與本研究中肝糖原和肌糖原的變化一致。提示COS降低db/db小鼠血糖的機制之一為減少糖原分解，使肝、肌糖輸出減少，增加葡萄糖攝取，減少游離葡萄糖，使血糖濃度下降。

糖尿病不僅可引起血糖升高，還可加速脂肪分解，過多的脂肪酸重新酯化成TG釋放入血，形成高脂血癥等并發癥〔25〕。COS具有良好的降脂作用，Muanprasat等〔6〕研究表明，COS可抑制胰腺脂肪酶活性，并與膽汁酸結合，導致腸道脂肪吸收減少，糞便脂肪排泄增加。COS的攝入抑制3T3-L1脂肪細胞的細胞分化、TG的積累和成脂標志物的表達，并抑制大鼠和小鼠肥胖模型的脂肪積累〔26〕。因此COS不僅可延緩db/db小鼠的糖尿病發生發展進程，還可以通過降低體內TC、TG和LDL-C改善其血脂異常，預防和延緩相關并發癥的發生發展。本研究結果提示，COS可部分改善糖尿病發生發展過程中伴隨的血脂異常。因此，COS不僅可延緩db/db小鼠糖尿病發生發展進程，還可以通過降低體內TC、TG和LDL-C水平，改善其血脂異常，預防和延緩相關并發癥的發生發展。

氧化應激與糖尿病的發生發展密切相關。由于持續和慢性高血糖，糖尿病患者在胰島中表現出高氧化應激標志物和活性氧(ROS)，從而消耗抗氧化防御系統的活性，促進自由基生成；自由基水平異常高和抗氧化防御機制同時下降可能導致細胞和酶的損傷、脂質過氧化增加和胰島素抵抗的發展〔27〕。SOD和GSH-Px能夠清除超氧陰離子和羥基離子，是體內重要的抗氧化酶。MDA是脂質過氧化的終產物，是脂質過氧化的指標〔28〕。本研究結果提示，COS可有效減輕氧化應激引起的氧化損傷。COS提高了db/db小鼠體內抗氧化酶系統的活力，降低氧化損傷，這可能是其減緩db/db小鼠糖尿病發生發展進程的機制之一。本研究結果提示，COS可改善胰腺組織形態，增加胰腺系數，減少肝組織脂肪空泡，可使肝臟系數有所增加，但無統計學差異，與以往報道有所不同〔29〕，這可能是與所用COS性質、劑量和時間等不同有關。糖尿病腎病是糖尿病嚴重的微血管并發癥，而腎臟肥大是糖尿病腎病早期的重要病理特征〔29〕。本研究提示，COS可有效控制腎臟肥大，對糖尿病小鼠的腎臟具有保護作用，對糖尿病腎病的預防和治療具有一定的作用，可部分抵御糖尿病發生發展過程中代謝異常引起的組織損傷。

綜上，COS可能通過控制血糖、改善血脂異常、抵抗體內氧化應激、保護組織等途徑延緩自發性糖尿病發生發展的進程，但是否還存在其他作用機制有待進一步研究。