基于TLR4/NF-κB信號通路探討槲皮素對直腸癌模型大鼠炎癥反應和應激反應的影響

馬仕虎 余昌達 陳志冰 張開華

(九江市第一人民醫院普外科，江西 九江 332000)

直腸癌(CRC)是胃腸道最常見的惡性腫瘤，也是世界上第三大癌癥相關死亡原因〔1〕，統計數字表明，男性比女性更易患直腸癌〔2〕。盡管CRC可以在任何年齡發生，但這種疾病的發生與年齡密切相關，最常見于50歲以上的人〔3〕。其他與生活方式和飲食因素相關的危險因素包括大量食用紅色或加工過的肉類、肥胖、低水平的體力活動和吸煙，據報道都是導致CRC發生和發展的因素〔4〕。此外，CRC通常伴隨著預后不良，在高收入國家(如澳大利亞、加拿大、美國和一些歐洲國家)5年相對生存率低于65%，但在低收入國家仍然低于50%〔2〕。目前CRC的治療方法已經取得一定效果，但是耐藥及治療后的轉移仍是亟待解決的一大難題。因此探究合適的治療藥物對于CRC的研究意義重大。槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮)是廣泛分布于各種水果和蔬菜中。槲皮素及其衍生物具有許多健康促進作用，包括腫瘤的治療。Toll樣受體(TLR)4和核因子(NF)-κB在包括CRC在內的腫瘤發生過程中扮演著重要的角色。研究表明，在潰瘍性結腸炎發展成CRC的研究中發現，使TLR4/NF-κB信號通路失活，可以減輕脂多糖(LPS)處理的人結腸組織細胞的氧化應激和炎癥反應，阻止CRC的發生〔5〕。本研究通過建立CRC大鼠模型，從TLR4/NF-κB通路著手，研究槲皮素介導TLR4/NF-κB信號通路對CRC模型大鼠炎癥反應和應激反應的影響。

1 資料與方法

1.1實驗材料 SW480(美國ATCC)保存在Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM，美國Invitrogen，美國)。雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購于濟南金豐實驗動物有限公司。二甲基肼(DMH)購于J&K化學技術公司；槲皮素注射液來自醫院合作實驗室；TLR4和NF-κB p65一抗，購于abcam公司；PrimeScript RT試劑盒購于寶日醫生物科技公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司；PCR試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型構建和分組 選擇雄性SD大鼠(體重160～170 g)60只，在受控條件下將其置于適當的籠子中使其適應環境，并飼喂市售固體食物，大鼠隨意進食和飲水。分為4組：Model組、槲斗皮素-L(25 mg/kg)組、槲斗皮素-M(50 mg/kg)組和槲斗皮素-H(75 mg/kg)組，選擇NC組作為正常對照。NC組和Model組腹腔注射二甲基亞砜(DMSO)0.2 ml，生理鹽水1 ml，1次/d；槲皮素處理組按照對應濃度每天腹腔注射，生理鹽水1 ml，1次/d。每周皮下注射DMH(30 mg/kg)，持續18 w，建立CRC模型。動物實驗獲得了醫院動物實驗倫理委員會的批準。

1.2.2ELISA測定 在麻醉狀態下取血后頸椎脫臼處死，4℃離心分離血清，分離后的血清放置在-80℃保存，使用ELISA試劑盒檢測血清中白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色 所有的腫瘤標本經甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，進行HE染色，按照試劑盒操作進行試驗。HE染色光鏡病理組織學檢查并攝片，觀察各組顯色情況。在形態學圖像分析系統，在100倍放大倍數下取不同組別，并隨機采集圖像，實驗重復3次。

1.2.4qRT-PCR法 采用RNA提取試劑盒(10296010，Invitrogen公司，上海，中國)提取各組腫瘤組織或職場組織總RNA，鑒定RNA純度和完整性后，然后使用PrimeScript RT試劑盒(RR014A，寶日醫生物科技公司，北京，中國) 將RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄體系10 μl，設計TLR4、NF-κB p65和GAPDH引物，交由TaKaRa公司合成。按PCR試劑盒操作步驟進行qRT-PCR，采用2-△△Ct法檢測各組基因的表達量并進行比較。

1.2.5Western印跡 采用總蛋白提取液RIPA試劑盒(R0010，北京索萊寶科技有限公司)提取同一患者的直腸癌組織和癌旁組織總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)方法測定蛋白濃度。根據不同濃度進行定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后采用濕轉方法將蛋白轉至NC膜上，5%牛血清蛋白(BSA)室溫下封閉1 h。滴加稀釋的一抗小鼠抗人單克隆抗體TLR4和NF-κB p65，GAPDH，36 kD為內參照。4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次10 min，然后孵育辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG抗體。TBST漂洗3次。使用凝膠成像分析系統分析，以樣本的平均吸光度除以相應內參照的平均吸光度，即為樣本蛋白的相對含量，然后將各樣本蛋白的相對含量間做統計分析圖。一抗和二抗都是購自Abcam公司，實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術 碘化丙啶(PI)單染法檢測：分別取各組組織100 mg，放入預冷的培養皿中，用眼科剪剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，調整為1×106個/ml，取1 ml細胞1 500 r/min離心10 min，棄上清，每毫升細胞加2 ml PBS，再離心，棄上清后，加入預冷的70%乙醇固定細胞，4℃過夜。第二天用PBS洗滌細胞2次，取100 μl細胞懸液，加入50 μg含RNAase的PI染液，避光30 min后用100目的尼龍網過濾，流式細胞儀檢測細胞周期。膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/PI雙標染色：將處理好的細胞置于培養箱中培養48 h，收集細胞、洗滌、離心，將細胞重懸于200 μl結合緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300 μl結合緩沖液，用流式細胞儀以激發波長488 nm檢測細胞凋亡情況。

1.3統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1槲皮素抑制直腸癌大鼠腫瘤發生 NC組、Model組、Quercetin-L組、Quercetin-M組、Quercetin-H組分別有12、11、10、9、9只大鼠存活至實驗結束。Model組、Quercetin-L組、Quercetin-M組、Quercetin-H組大鼠直腸腫瘤發生率分別為100%(11/11)，100%(10/10)，77.8%(7/9)，66.7%(6/9)。

2.2槲皮素抑制IL-1β、IL-6和TNF-α表達 Model組炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α表達較NC組顯著升高(P<0.05)，與Model組相比，槲皮素各處理組炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α顯著降低(P<0.05)。且隨著槲皮素濃度增大，IL-1β，IL-6，TNF-α表達明顯降低(均P<0.05)，見表1。

2.3槲皮素改善CRC組織病理結構 HE染色結果顯示，NC組組織結構完整，腸腺排列規則，而Model組結腸組織上皮細胞不規則，出現畸形腺窩灶，結構被破壞，槲皮素-L組、槲皮素-M組、槲皮素-H組結腸組織病理結構稍微有所改善，并且隨著槲皮素濃度的增大，病理結構依次改善，見圖1。

2.4槲皮素抑制TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白表達 Model組TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白表達較NC組顯著升高(P<0.05)，與Model組相比，槲皮素各處理組TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白明顯降低(P<0.05)，且隨著槲皮素濃度增大，TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 各組CRC炎癥因子IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達

圖1 各組組織病理學變化(HE染色，×200)

2.5槲皮素促進CRC細胞凋亡 與NC組相比，Model組S期、G2/M期細胞明顯增多，G0/G1期細胞明顯減少，與Model組相比，槲皮素各處理組S期、G2/M期細胞明顯減少，G0/G1期細胞明顯增多(P<0.05)，且隨著槲皮素濃度增大，G0/G1期細胞明顯增多，S期、G2/M期細胞明顯減少(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI 雙標染色法檢測結果顯示，與NC組相比，Model組凋亡率明顯減少(P<0.05)，與Model組相比，槲皮素各處理組凋亡率明顯降低(P<0.05)，且隨著槲皮素濃度增大(P<0.05)，各組細胞凋亡率明顯降低增大，見表2、圖3。

1～5：NC組，Model組，槲皮素-L組，槲皮素-M組，槲皮素-H組

表2 槲皮素促進CRC細胞凋亡

3 討 論

CRC常伴有嚴重的腸道和身體免疫系統疾病。腫瘤介導的炎癥反應是其重要的病理特征之一，也是治療腫瘤中遇到的難題。Malcomson等〔6〕研究表明，細胞的炎癥反應促進CRC的發生發展，通過改善炎癥反應可以改善腫瘤的進程，Solmaz等〔7〕研究表明，miR-330誘導通過在轉錄后水平抑制堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子(BACH)1表達來抑制CRC細胞的增殖，能夠進一步調控炎癥反應進程，說明炎癥反應和腫瘤細胞之間存在著密切的調控關系在治療方面，對于CRC患者，化學療法是不可避免的治療方法，但是會加劇免疫功能障礙。腸黏膜炎是接受聯合化療的癌癥患者中最常見和最有害的副作用之一，目前尚無有效的預防和控制措施。所以從炎癥反應進行突破，尋找更加有效，副作用更小的CRC治療藥物有重要的意義。

槲皮素在正常細胞中具有潛在的抗癌能力，而沒有明顯的細胞毒性〔8〕。越來越多的研究表明槲皮素可能對各種類型的癌癥(如結腸癌)具有治療作用。Qi等〔9〕研究表明，槲皮素和β-葡聚糖交替食用可以降低結腸癌小鼠的死亡率。 另一項研究表明，槲皮素負載的單甲氧基聚(乙二醇)e聚(ε-己內酯)納米膠束在體外和體內均可表現出增強的抗腫瘤活性，這可能是CRC治療的潛在候選藥物〔10〕。在其他腫瘤中，槲皮素可以通過降低Notch 1的表達及下游信號蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化水平改善白血病細胞的〔11〕。槲皮素還可以靶向調控胰腺癌細胞中的癌干樣細胞和上皮間質轉化表型〔12〕。

TLR是位于細胞表面的活性分子，可以觸發細胞質信號通路來激活核因子(如NF-κB，IRF)，從而導致細胞增殖，耐藥性及免疫細胞募集到腫瘤部位〔13〕。TLR系統構成了一把雙刃劍，需要在腫瘤疾病的治療中進行專門研究，TLR4被公認為是促進許多癌細胞免疫逃逸的關鍵因子〔14〕。NF-κB在腫瘤調控中也發揮重要作用，Zhu等〔15〕研究表明，MyD88調節的LPS/NF-κB/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路影響LPS誘導的結直腸癌細胞的炎癥和生物學行為。Li等〔16〕在CRC中的研究表明，抑制NF-κB P65移位進入細胞核能夠大腸癌異種移植物的肺轉移，Ezrin和NF-κB的異常激活與大腸癌轉移和預后不良有關。