黃芪提取物對DR模型大鼠眼部血流動力學的干預效果及對血清IL-6和VEGF水平的影響

儀立群 王淼 林琳 仲蘇鄂 王慶海

(三峽大學第二人民醫院眼科，湖北 宜昌 443000)

糖尿病(DM)患者人數在我國截止到2010年以達到九千余萬，每年呈上升趨勢。DM屬于慢性全身疾病，2型糖尿病(T2DM)患者占DM患者人數的95%，患者的身體健康及生存質量已經嚴重受到威脅〔1〕。糖尿病視網膜病變(DR)屬于一種慢性低度炎癥病變，是由DM引起的視網膜血管病變，導致DM患者喪失視力的主要原因〔2〕。有學者研究表示，DR嚴重的可導致患者失明，視網膜微血管系統損傷是由于糖代謝紊亂，導致視網膜血管周細胞凋亡、血管舒縮調節功能失常及血管基底膜增厚等〔3〕。DR患者在早期并無明顯癥狀，由于長期病變累積則會出現黃斑水腫、眼底出血、異常微血管瘤等，最終視力下降，嚴重者甚至失明〔4〕。本研究黃芪提取物對DR模型大鼠的干預效果及對白細胞介素(IL)-6、血管內皮生長因子(VEGF)水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取50只健康雄性SD大鼠，8～12個月，平均(10.6±1.2)個月，體重350～480 g，平均(420.6±20.4)g。由北京科奧協力飼料有限公司提供，合格證號：京動(2000)第015號，所有大鼠放于無病原菌的干凈籠子里喂養，飼養溫度維持在(23.0±1.6)℃，飲用水和食物均進行高溫及高壓消毒。本研究獲醫院倫理委員會批準。

主要藥物及主要儀器：黃芪(甘肅野生黃芪)，鏈脲佐菌素(STZ，上海穎心實驗設備有限公司)，免疫比濁法試劑盒(貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司)，酶聯免疫試劑盒(北京維德維康生物技術有限公司)，血糖檢測儀(德國羅氏)，兔抗大鼠IL-6、VEGF抗體(Sigma公司)，小鼠抗大鼠總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)抗體(Dako公司)，兔抗小鼠低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)抗體(Gibco 公司)。電子天平、pH計(上海京孚儀器有限公司)；蛋白垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；微量移液器(廣州雷得生物技術有限公司)；超純水儀(中天光學儀器有限責任公司)；磁力攪拌器(其林貝爾儀器制造有限公司)；多功能酶標儀(Bio-rad公司)；離心機(Sigma公司)；-80℃冰箱(日本三洋公司)；紫外分光光度計(莫賽飛公司)；恒溫水浴箱(上海一凱儀器設備有限公司)。

1.2方法

1.2.1黃芪提取物制作 稱取黃芪片20 g，加入100 ml蒸餾水，冷浸過夜后，進行加熱煮沸30 min,倒出清液，使用小火進行濃縮到10 ml，制成含生藥2 g/ml的藥液，使用濾紙將涼后的藥液過濾，使用一次性針頭濾器過濾，分裝滅菌放入安瓿瓶后放入冰箱備用。

1.2.2DR模型建立 選取40只大鼠制作模型，參考楊欽欽等〔5〕研究實驗中DR大鼠模型的建立方法并進行適當改動，建立DR模型，均以高脂飼料喂養6 w后禁止飲食飲水12 h，建立DR大鼠模型使用STZ 60 mg/kg進行腹腔注射。3 d后取大鼠尾尖血，測血糖≥16.7 mmol/L則DM大鼠造模成功。將DM大鼠繼續進行高脂飼料飼養1個月后以普通飼料喂養，DM大鼠眼底有明顯視網膜出血及滲出者為DR大鼠建模成功。

1.2.3用藥及分組 將建模成功的40只大鼠隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各組10只。低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別使用40、60、80 mg/kg黃芪提取物溶液進行灌胃處理，1次/d，連續干預2 w。正常組及模型組給予同等體積的無菌生理鹽水灌胃治療。治療期間大鼠均自由飲食。

1.2.4視網膜組織觀察 使用10%水合氯醛對大鼠進行麻醉處理后處死，解剖快速取出新鮮大鼠雙眼視網膜，放置于甲醛溶液中，固定24 h，常規脫水、透明、石蠟包埋，間距5 μm做連續切片。將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入100%、95%、80%、75%濃度的酒精中各復水3 min。使用蘇木素染色15 min后清洗3次，使用鹽酸-酒精分化處理30 s，再次清洗兩次，使用1%氨水泛藍，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察。

1.2.5血脂檢測 采取禁食12 h后的大鼠腹靜脈抽取靜脈血液3 ml，離心后取血清，采用CHOD-PAP法檢測TC水平，GPO-PAP法檢測TG水平，檢測過程分別按照總膽固醇單試劑測定試劑盒、TG檢測試劑盒操作說明書進行。采用直接法-過氧化物酶清除法檢測LDL-C、HDL-C。酶標儀預熱0.5 h，波長調節至240 nm，將檢測工作液37℃反應5 min，提取已采集的血清樣本，加入190 μl工作液，在酶標儀上振動5 s開始計時，記錄240 nm下初始吸光值A1和1 min后的吸光值A2。計算公式A=A1-A2。

1.2.6IL-6、VEGF 取各組大鼠血清標本，使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-6、VEGF水平：對抗原進行稀釋后將其加入聚苯乙烯的反應孔中，加蓋處理后，在溫度4℃的條件下放置24 h，次日洗滌3次后，拋干，在每孔中均加入稀釋液(pH值為7.4 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標本0.1 ml，并加入陽性和陰性對照標本，在溫度為42℃的條件下放置60 min，將液體移除并洗滌3次后，拋干，在每孔中加入IL-6、VEGF抗體0.1 ml，再次放置60 min，將液體移除并洗滌3次，拋干，并在每孔中加入底物液〔0.1 mol/L的磷酸氫二鈉(Na2HPO4),0.05 mol/L的枸櫞酸〕混勻，且加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L硫酸 (H2SO4) 0.05 ml放置各孔內，終止反應。使用酶標儀檢測A450值，分析IL-6、VEGF水平。

1.2.7空腹血糖檢測 大鼠進行麻醉處死前，使用血糖監測儀對血糖進行檢測，并進行組間比較。

1.2.8視網膜中央動脈(CRA)血流動力學變化檢測 實驗大鼠在最后一次給藥前1 d對大鼠右眼進行彩色多普勒檢查，檢測每次大鼠右眼CRA的血流動力學指標收縮期峰值血流速度(Max)、舒張末期流速(Min)、平均血流速度(TAMx)。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1DR模型建立前后大鼠圖片 正常大鼠晶狀體透明，無異常病變現象；DR模型大鼠晶狀體組織較為混濁。見圖1。

圖1 DR模型建立前后大鼠

2.25組大鼠病理形態學觀察 正常組大鼠視網膜結構完整，內外顆粒層細胞排列規則、緊密，無異常現象。模型組與正常組比較，視網膜內外顆粒層細胞排列雜亂且較為稀疏、腫脹，伴有空泡樣變化；與模型組相比，低劑量組，中劑量組，高劑量組視網膜內外顆粒層細胞充血、腫脹情況緩解，內膜光滑程度上升，細胞排列雜亂情況出現緩解。與低劑量組、中劑量組相比，高劑量組內膜較為光滑，內外顆粒層細胞排列最為緊密，細胞充血、腫脹情況基本消失。見圖2。

2.35組血脂水平及空腹血糖比較 模型組TC、TG、LDL-C、空腹血糖水平明顯高于正常組，HDL-C水平明顯低于正常組(P<0.05，P<0.001)；低劑量組、中劑量組、高劑量組TC、TG、LDL-C、空腹血糖水平明顯高于正常組，明顯低于模型組，HDL-C明顯低于正常組，明顯高于模型組(均P<0.001)；高劑量組TC、TG、LDL-C、空腹血糖水平明顯低于低劑量組，中劑量組，HDL-C明顯高于低劑量組、中劑量組(均P<0.001)。見表1。

圖2 5組病理學形態觀察(HE染色，×400)

表1 5組血脂水平、空腹血糖水平比較

2.45組IL-6、VEGF水平及CRA血流動力變化 模型組Max、Min、TAMx水平明顯低于正常組，IL-6、VEGF明顯高于正常組(均P<0.001)；低劑量組、中劑量組、高劑量組Max、Min、TAMx水平明顯低于正常組，明顯高于模型組；IL-6、VEGF水平明顯高于正常組，明顯低于模型組(均P<0.001)；高劑量組Max、Min、TAMx水平明顯高于低劑量組、中劑量組，高劑量組IL-6、VEGF水平明顯低于低劑量組、中劑量組(均P<0.001)。見表2。

表2 5組CRA血流動力學及IL-6、VEGF變化

3 討 論

DR屬于DM最常見的并發癥，視網膜血管屏障的破壞、血管通透性增加、視網膜局部缺氧等病理現象均有多種炎性因子參與〔6〕。視網膜微血管循環功能異常開始在DR最早時期，視網膜微血管循環功能異常主要表現是血液流變學和血流動力學〔7〕。DR的病理特征主要有視網膜新生血管形成和血-視網膜屏障破壞〔8〕。

黃芪主要成分包括黃芪總黃酮、黃芪總皂苷、黃芪總多糖及各種氨基酸和微量元素等〔9〕。主要藥理作用有利尿降壓、抗炎鎮痛，抗氧自由基生成及提高免疫功能〔10〕。有學者研究表示，DM患者及并發癥使用黃芪治療有一定的療效，可以改善學流動力學，使血糖降低，保護血管內皮細胞的同時還可以抑制微血管病變的功能〔11〕。有學者研究發現，患者高糖狀態下產生的大量活性氧可以被黃芪甲苷有效清除，并且可以在調節足細胞凋亡相關蛋白的表達后，來抑制足細胞凋亡〔12〕。

本研究顯示，DR大鼠視網膜組織細胞排列出現雜亂、稀疏現象，視網膜內外顆粒層細胞出現腫脹、空泡樣變化，使用黃芪提取物進行干預的DR大鼠膜組織細胞排列雜亂、稀疏、內外顆粒層細胞腫脹、空泡樣變化明顯緩解，出現這一研究結果原因可能是使用黃芪提取物進行干預能夠調節DR大鼠血糖、血脂水平，從而發揮干預效果。黃芪干燥根中提取的大分子多糖成分屬于黃芪多糖，抵抗自由基損傷，可以清除氧自由基，降低脂質過氧化，調節免疫功能、抗衰老等多種功效〔13〕。有學者研究發現，黃芪多糖可以調節血脂，降低正常人群血液中的TC、TG、LDL-C水平〔14〕。本研究說明，使用黃芪提取物可以有效調控血脂指標水平，從而對DR大鼠起到干預效果。

有學者研究發現，在DM慢性炎癥反應中，多種炎性因子逐漸受到重視，IL-6在DM中存在獨立危險因素，在急性相反應中屬于始發因子和主要物質，胰島素與其相互作用〔15〕。研究顯示，增加到一定程度上的IL-6，可以抑制胰島素分泌，進而損傷β細胞，導致DM的加重〔16,17〕。VEGF在DR患者中屬于一種可溶性血管因子，由視網膜缺血產生，不僅可以使血管再生，還可以增加血管的通透性，在患者視網膜缺血狀態下，VEGF會異常高表達，從而促進患者視網膜新生血管生長，加重患者病情〔18,19〕。本研究結果說明，黃芪提取物能夠調控IL-6、VEGF及血糖水平，改善血糖及眼底視網膜環境，從而治療DR大鼠。

CRA是眼動脈終末分支，反映視網膜學流動力學改變可以通過監控患者血流流速，血液流變學改變主要體現在紅細胞凝集性增高、變形能力下降和血液黏度增高，視網膜學流動力學變化監測可以檢測以上相關指標〔20〕。本研究結果說明，黃芪提取物能夠調控Max、Min、TAMx水平，改善動態實時眼部血管學流動力學水平，從而發揮干預效果。

綜上，黃芪提取物能夠調控血脂紊亂，改善血糖及眼底血液供應，從而治療DR大鼠，為臨床治療DR提供理論依據。