干擾FAM201A通過調(diào)控miR-146a-5p/GATA6影響直腸癌細胞生物學行為

張麗 董巧云 宋榮 侯麗 陶菊花

(1巴彥淖爾市醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2巴彥淖爾市臨河區(qū)人民醫(yī)院；3巴彥淖爾市醫(yī)院腫瘤中心)

直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，放射治療是局部晚期直腸癌治療的方式之一，聯(lián)合手術(shù)治療可降低局部復發(fā)率，提高患者總生存率〔1,2〕；然而放射抵抗性的出現(xiàn)降低了放療效果，提高癌細胞的放射敏感性是提高其治療效果的重要途徑和方法。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(lncRNA)可通過調(diào)節(jié)各種機制影響放射敏感性，有望在將來成為放射治療的潛在治療靶標〔3〕。序列相似性201家族成員(FAM201)A是一種新型的lncRNA，研究報道抑制FAM201A可在體外抑制肺鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并在體內(nèi)抑制腫瘤的生長〔4〕。FAM201A在放射抵抗的非小細胞肺癌患者組織中顯著上調(diào)，與患者放射抵抗和生存期降低密切相關(guān)；沉默F(xiàn)AM201A在體外和體內(nèi)均可在X射線照射下抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡〔5〕。抑制lncRNA FAM201A通過靶向miR-488-3p可抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進胃癌細胞凋亡，并增加其放射敏感性〔6〕。然而FAM201A對直腸癌細胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響尚不清楚。

miR-146a-5p是miR-146a家族中主要成員之一，研究報道m(xù)iR-146a-5p在結(jié)直腸癌中失調(diào)表達，可作為檢測結(jié)直腸癌的非侵入性生物標志物〔7〕。miR-146a-5p可通過影響結(jié)直腸癌細胞的細胞周期進程而發(fā)揮抑癌作用〔8〕。miR-146a-5p可以通過激活DNA修復途徑和抑制復制蛋白(RP)A3來抑制肝癌細胞的增殖，并促進放射敏感性和凋亡〔9〕。表明miR-146a-5p可抑制結(jié)直腸癌進展，還可影響腫瘤放射敏感性。本實驗通過在線軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p和人GATA結(jié)合蛋白(GATA)6有結(jié)合位點；GATA6基因位于染色體18q11.1～q11.2上，在多種腫瘤中作為促癌基因〔10〕。GATA6蛋白在結(jié)腸癌組織中表達量增加，與患者預后有關(guān)〔11〕。miR-455過表達通過靶向GATA6抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲〔12〕。抑制GATA6顯著增加了輻射誘導的結(jié)腸癌細胞HT55和HT29凋亡〔13〕。然而miR-146a-5p是否通過調(diào)控GATA6影響直腸癌進展及放射敏感性尚不清楚，且FAM201A對直腸癌細胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響是否與miR-146a-5p和GATA6有關(guān)也不清楚。因此，本實驗旨在研究FAM201A對直腸癌細胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響及其機制是否與miR-146a-5p和GATA6有關(guān)。

1 材料與方法

1.1臨床組織來源 選取內(nèi)蒙古巴彥淖貝爾市醫(yī)院外科手術(shù)切除的23例直腸癌患者癌組織及癌旁正常黏膜組織，男13例、女10例，年齡40～61歲，平均(47.63±3.47)歲;病程1～3年，平均(1.02±0.54)年，分期1期8例，2期10例，3期5例。所有患者手術(shù)前未進行過放化療，患者均知情且同意。

1.2材料 直腸癌細胞SW837購自美國ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國invitrogen公司；熒光定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；凋亡檢測試劑盒購自美國Biovision公司；蛋白提取試劑盒購自亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國AAT Bioquest公司。

1.3細胞處理與分組 直腸癌細胞SW837用RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，將si-NC、si-FAM201A、miR-NC、miR-146a-5p轉(zhuǎn)染至SW837細胞中，記為si-NC組、si-FAM201A組、miR-NC組、miR-146a-5p組；將si-FAM201A分別與anti-miR-NC、anti-miR-146a-5p共轉(zhuǎn)染至SW837細胞中，記為si-FAM201A+anti-miR-NC組、si-FAM201A+anti-miR-146a-5p組。

1.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測FAM201A、miR-146a-5p和GATA6 mRNA的表達水平 提取直腸癌組織、癌旁組織及細胞的總RNA，合成cDNA后按熒光定量試劑盒說明進行PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算相對表達量。FAM201A上游引物：5′-CCAGGCTCTTTGATCACCAT-3′，下游：5′-GAGTTTCCTGGGATGTGGAA-3′；miR-146a-5p上游引物：5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游：5′-CCCA TGGAATTCAGTTCTCATT-3′；GATA6上游引物：5′-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3′，下游：5′-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3′；GAPDH上游引物：5′-TCA CCATCTTCCAGGAGCG-3′，下游：5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′；U6上游引物：5′-CAAGGATGACACGCAAA-3′，下游：5′-TCAACTGGTGTCGTG-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5克隆形成實驗 將1.3中各組細胞以適宜密度接種于培養(yǎng)皿中，細胞融合達至80 %左右，分別給予0、2、4、6、8 Gy的射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)約2 w，用吉姆薩染色30min，在低倍光學顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的集落。克隆形成率(PE)=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%，存活分數(shù)(SF2)=照射劑量組的集落數(shù)/(該組細胞接種數(shù)×未照射組PE)。采用GraghPad Prism5軟件，按單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，SF2=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D為照射劑量(Gy)，D0為平均致死劑量，Dq為準閾劑量(代表存活的寬肩度)，N為外推值。放射增敏比(SER)=單純照射組D0/聯(lián)合照射組D0。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡1.3中各組細胞接種于6孔板中。分別給予0、4 Gy的射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 按試劑盒說明操作，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7Western印跡法檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每孔上樣40 μl蛋白樣品，電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜，然后用脫脂奶粉封閉，洗膜后加入一抗孵育，然后加入二抗室溫孵育，加入化學發(fā)光液顯影，然后定影、成像；用Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白的相對表達量。

1.8雙熒光素酶報告實驗 構(gòu)建FAM201A及GATA6的野生型和突變型熒光素酶報告載體，將其分別與miR-146a-5p及miR-NC共轉(zhuǎn)染至直腸癌細胞SW837中，按試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1FAM201A、miR-146a-5p和GATA6在直腸癌組織中的表達 與癌旁組織相比，直腸癌組織中FAM201A和GATA6 mRNA表達水平顯著升高，miR-146a-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2干擾FAM201A對直腸癌細胞放射敏感性及凋亡的影響 與si-NC組相比，si-FAM201A組0 Gy、4 Gy直腸癌細胞集落形成數(shù)及2、4、6、8 Gy細胞存活率顯著減少，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表2、表3、圖1。單擊多靶模型擬合計算得出(表4)，si-FAM201A組SER為1.885。

表1 FAM201A、miR-146a-5p 和GATA6 在直腸癌中的表達

表2 干擾 FAM201A 對直腸癌細胞存活率的影響

表3 干擾FAM201A對直腸癌細胞集落形成、凋亡及FAM201A、miR-146a-5p、GATA6表達的影響

A：干擾FAM201A抑制直腸癌細胞集落形成(吉姆薩染色，×40)；B：干擾FAM201A誘導直腸癌細胞凋亡

表4 si-NC組與si-FAM201A組SER

2.3干擾FAM201A對直腸癌細胞miR-146a-5p、GATA6表達的影響 與si-NC組相比，si-FAM201A組FAM201A表達水平顯著降低，miR-146a-5p表達水平顯著升高，GATA6 蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

2.4miR-146a-5p對直腸癌細胞放射敏感性及凋亡影響 與miR-NC組相比，miR-146a-5p組miR-146a-5p表達水平升高，GATA6 蛋白表達水平降低，直腸癌細胞集落形成數(shù)減少，細胞凋亡率升高，2、4、6、8 Gy細胞存活率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3～5、表5、表6。單擊多靶模型擬合計算得出(表7)，miR-146a-5p組的SER為2.109。

圖2 GATA6蛋白表達

圖3 Western印跡檢測GATA6蛋白表達

圖4 miR-146a-5p抑制直腸癌細胞集落形成(吉姆薩染色，×40)

圖5 miR-146a-5p誘導直腸癌細胞凋亡

表5 miR-46a-5p對直腸癌細胞存活率的影響

表6 miR-146a-5p對直腸癌細胞集落形成及凋亡的影響

表7 單機多靶參數(shù)

2.5抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾FAM201A對直腸癌細胞放射敏感性及凋亡影響 與si-FAM201A+anti-miR-NC組相比，si-FAM201A+anti-miR-146a-5p組miR-146a-5p表達水平降低，GATA6 蛋白表達水平升高，直腸癌細胞集落形成數(shù)增加，細胞凋亡率及2、4、6、8 Gy細胞存活率降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6～8、表8、表9。單擊多靶模型擬合計算得出(表10)，si-FAM201A+anti-miR-146a-5p組的SER為0.542。

2.6FAM201A、miR-146a-5p和GATA6的靶向關(guān)系 Starbase軟件預測顯示FAM201A與miR-146a-5p具有結(jié)合位點，targetscan軟件預測顯示miR-146a-5p與GATA6具有結(jié)合位點(圖9)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，WT-FAM201A或WT-GATA6與miR-146a-5p共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而MUT-FAM201A或MUT-GATA6與miR-146a-5p共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光素酶活性無明顯變。見表11。

1，2：si-FAM201A+anti-miR-NC組，si-FAM201A+anti-miR-146a-5p組，圖7，8同

圖7 抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾FAM201A對直腸癌細胞集落形成的抑制作用(吉姆薩染色，×40)

圖8 抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾FAM201A誘導直腸癌細胞凋亡

表8 抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾FAM201A對直腸癌細胞集落形成及凋亡的影響

表9 miR-46a-5p對直腸癌細胞存活率的影響

表10 單機多靶參數(shù)

圖9 FAM201A、miR-146a-5p和miR-146a-5p、GATA6的互補序列

表11 雙熒光素酶報告實驗

3 討 論

放射治療是腫瘤的重要治療手段之一，但目前面臨著腫瘤放療抵抗的難題，如何增強腫瘤的放射敏感性，提高放射治療效果是亟需解決的問題〔14〕。研究腫瘤放射敏感性的分子機制，尋找潛在的增敏靶點進而提高放射敏感性是重要方法〔15〕。研究報道FAM201A在耐輻射食管鱗癌組織中表達上調(diào)，其表達增加與食管鱗癌的抗輻射性和低存活率密切相關(guān)，F(xiàn)AM201A通過miR-101調(diào)節(jié)ATM和mTOR表達介導食管鱗狀細胞癌的放射敏感性〔16〕。FAM201A通過miR-186-5p/TNKS1BP1軸增強三陰性乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，并加速細胞凋亡〔17〕。本實驗結(jié)果說明干擾FAM201A可抑制直腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，干擾FAM201A可提高直腸癌細胞對射線的敏感性。

研究報道m(xù)iR146a-5p通過羧肽酶(CP)M/src-局部黏著斑激酶(FAK)途徑促進人結(jié)直腸癌中的細胞遷移和侵襲〔18〕。本實驗結(jié)果表明過表達miR-146a-5p可抑制直腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡。研究報道m(xù)iR-146a-5p過表達可增強卵巢癌細胞OVCAR3、SKOV3對順鉑的敏感性〔19〕。本實驗結(jié)果表明過表達miR-146a-5p可增強直腸癌細胞的放射敏感性。研究報道m(xù)iR-944過表達通過靶向GATA6抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移〔20〕。本實驗結(jié)果提示，miR-146a-5p可能通過靶向調(diào)控GATA6影響直腸癌進展。

研究報道lncRNA電壓門控鉀通道亞家族Q1重疊轉(zhuǎn)錄物(KCNQ1OT1)通過miR-146a-5p/堿性神經(jīng)酰胺酶(ACER)3軸抑制放射敏感性并促進肝細胞癌的發(fā)生〔21〕。lncRNA可通過調(diào)控miR-146a-5p影響腫瘤進展及放射敏感性。本實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM201A可靶向調(diào)控miR-146a-5p；而抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾對直腸癌細胞集落形成，凋亡及放射敏感性的影響，提示，F(xiàn)AM201A可能通過調(diào)控miR-146a-5p影響直腸癌進展。

綜上所述，干擾FAM201A可通過調(diào)控miR-146a-5p/GATA6抑制直腸癌細胞集落形成，促進細胞凋亡，增強其放射敏感性。