JAK1/STAT1信號通路在白藜蘆醇減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用機制

宋光捷 方毅 陳黎 馮建青

(1湖北文理學院附屬醫院 襄陽市中心醫院神經內科，湖北 襄陽 441000；2中國人民解放軍聯勤保障部隊第九九一醫院骨科；3中國人民解放軍96608部隊醫院內一科)

缺血性腦卒中是全世界范圍內導致死亡和殘疾的主要原因之一，盡管大量的神經保護劑被不斷研究和開發，但仍未取得滿意的效果〔1〕。缺血性腦卒中在溶栓治療過程中，極有可能出現腦缺血再灌注損傷，進而造成神經細胞損傷或促進神經元凋亡〔2〕。因此，深入了解缺血再灌注所導致的氧化應激損傷機制，為缺血性腦卒中提供新的治療方法，具有十分重要的意義。Janus激酶(JAK)1是Janus激酶家族中的成員之一，存在于細胞膜表面，信號轉導與轉錄激活子(STAT)1是STAT家族中的成員之一，存在于細胞質中，JAK1/STAT1信號通路在細胞生長、凋亡中起著關鍵的調控作用〔3〕。機體一旦出現應激反應，細胞膜表面的JAK1被異常激活，隨后STAT1被JAK1激酶的細胞質酪氨酸激酶磷酸化，進而啟動細胞凋亡等一系列信號通路〔4〕。研究表明〔5〕，抑制JAK1/STAT1信號通路可抑制小膠質細胞的激活，減輕缺血性腦損傷。白藜蘆醇(Res)是一種多酚類化合物，存在于葡萄、桑葚、花生和葡萄酒中，被認為是一種有效的抗氧化、抗感染和抗凋亡藥物〔6〕。研究表明〔7,8〕，Res對腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用，但其詳細作用機制有待進一步闡明。本研究探討Res基于JAK1/STAT1信號通路減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器 Res(純度>98%，北京索萊寶科技有限公司)；10%水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠)；2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液(上海澤葉生物科技有限公司)；4%多聚甲醛(中國醫藥集團上海化學試劑公司)；免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(北京博奧森生物技術有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白質濃度測定試劑盒、電化學發光(ECL)檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；鼠抗JAK1單克隆抗體、鼠抗STAT1單克隆抗體(英國Abcam公司；辣根過氧化酶標記羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物有限公司)。

1.2實驗動物 健康、清潔級SD雄性大鼠40只，8～10周齡，體重260～300 g，由南京君科生物工程有限公司提供，合格證號：SCXK(蘇)2019-0002。所有大鼠喂養于標準環境中，控制溫度為22～24℃，并使其自由攝取食物和水。動物研究均嚴格按照國家衛生研究所和醫院動物倫理委員會所批準的實驗動物護理和使用指南執行。

1.3模型建立和分組 適應性喂養所有大鼠1 w，并將大鼠隨機分為假手術(Sham)組、腦缺血再灌注(I/R)組、Res低劑量組(10 mg/kg)、Res中劑量組(30 mg/kg)和Res高劑量組(60 mg/kg)各8只。采用文獻介紹的大腦中動脈栓塞(MCAO)法以建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，步驟如下，首先采用1 ml/100 g的10%水合氯醛溶液對大鼠進行腹腔注射麻醉，取仰臥位固定于手術臺上，從頸正中行一切口，使得右側頸總動脈暴露，并游離頸內動脈及頸外動脈，于頸外動脈距離頸總動脈交叉位置10 mm處結扎、離斷，使用動脈夾夾閉頸總動脈和頸內動脈，并于頸外動脈距離頸總動脈交叉位置5 mm處作出一個小切口，將線栓(直徑0.24 mm)經切口插入頸內動脈，結扎頸外動脈，將頸內動脈的動脈夾松開，繼續將線栓插入到達右側大腦中動脈，當線栓頂端距離頸總動脈分叉位置18～20 mm且感覺到有阻力時停止，并松開頸總動脈動脈夾，等到大鼠蘇醒之后進行Longa神經功能缺失評分，≥2分則判斷為栓塞成功，2 h后將線栓退到頸外動脈殘端位置以實現再灌注，假手術組不插入線栓，并注射生理鹽水，Res低、中、高劑量組于再灌注前通過大鼠尾部進行靜脈注射10、30、60 mg/kg劑量的Res。

1.4方法

1.4.1各組神經功能缺失評分 再灌注24 h之后，參照Zea Longa評分標準對其神經功能缺損進行評分，采用4級評分法，0分：無神經功能缺失；1分：輕度缺失，提尾時右前肢無法完全伸展；2分：中度缺失，向右側轉圈；3分：中至重度缺失，向右側傾倒；4分：重度缺失，意識喪失，甚至出現死亡。

1.4.2各組腦梗死體積和腦水腫率測定 再灌注24 h之后，取10%水合氯醛麻醉各組大鼠，斷頭取腦組織，均勻切成2 mm厚度冠狀切片，并浸入2% TTC溶液中，并置于37℃恒溫水浴鍋中孵育30 min，再浸入4%多聚甲醛中固定24 h，取出腦切片平鋪于培養皿中，并拍照，利用ImageJ軟件測定腦梗死體積。使用電子天平測定大鼠左、右兩側大腦濕重，置入100℃烤箱24 h，再測定干重，腦水腫率=(腦組織濕重-腦組織干重)×100%。

1.4.3免疫組化染色檢測凋亡相關蛋白表達 取各組腦組織進行石蠟包埋切片，常規脫蠟水化，再置于蘇木素中染色5 min，清水沖洗，再水化15 s，清水沖洗，再放入75%酒精、85%酒精各2 min，再置于0.5%伊紅中染色1 min，再次放入95%酒精Ⅰ、Ⅱ和100%酒精Ⅰ、Ⅱ中各5 min及二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5 min，最后，采用中性樹膠封片，并在顯微鏡下觀察腦組織形態變化。

1.4.4原位細胞凋亡檢測法(TUNEL)檢測缺血再灌注區腦神經元凋亡水平 取各組缺血再灌注區腦組織切片，常規脫蠟，滴加20 μg/ml不含DNA酶的蛋白酶K 50 μl，置于37℃烤箱孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，5 min/次，再加入TUNEL檢測液50 μl，37℃烤箱孵育1 h，PBS漂洗3次，5 min/次，最后使用抗熒光淬滅封片液在顯微鏡下進行觀察。

1.4.5RT-聚合酶鏈反應(PCR)檢測mRNA表達 取各組缺血再灌注區腦組織，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，并采用反轉錄試劑盒將RNA樣品反轉錄成cDNA，引物序列如下：GAPDH正向：5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′， 反向：5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2正向：5′-AGGATTGTGGCCTTCTTTGA-3′，反向：5′-CAGATGCCGGTTCAGGTACT-3′；Bcl-2相關X蛋白(Bax)正向：5′-GCTGGACACTGGACTTCCTC-3′， 反向：5′-ACTCCAGCCACAAAGATGGT-3′；含半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)-3正向：5′-TGCCAGAAGATACCAGTGGA-3′， 反向：5-TGACTGGATGAACCATGAC-C-3。引物由南京金斯瑞公司進行合成。最后采用SYBR試劑盒進行RT-PCR檢測。

1.4.6Western印跡檢測蛋白表達 取各組缺血再灌注區腦組織100 mg提取蛋白，并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將分離膠轉移至與目的蛋白區域大小對應的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，放入電泳槽進行轉膜，加入一抗Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、caspase-3(1∶500)、JAK1(1∶500)、STAT1(1∶500)、p-JAK1(1∶500)、p-STAT1(1∶500)孵育4℃過夜，TBST緩沖液清洗3次，各5 min，加入辣根過氧化酶標記的二抗IgG(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液清洗3次，各5 min，最后滴加1∶1混勻的A液和B液，以GAPDH作為內參，將膜放入凝膠成像系統中，拍照，并采用ImageJ軟件分析。

1.5統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1Res對I/R大鼠神經功能的影響 I/R組神經功能缺失評分顯著高于Sham組(P<0.01)，提示大腦中動脈栓塞后局部腦組織缺血，導致了明顯的神經功能缺失；Res低劑量組神經功能缺失評分與I/R組相比無明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組神經功能缺失評分顯著低于I/R組(P<0.01)，其中Res中劑量組改善效果最佳。見表1。

2.2Res對I/R大鼠腦梗死體積和腦水腫率的影響 I/R組腦梗死體積、腦水腫率顯著大于Sham組(P<0.01)，Res低劑量組腦梗死體積、腦水腫率與I/R組相比無明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組腦梗死體積、腦水腫率顯著小于I/R組(P<0.05)，表明30、60 mg/kg劑量的Res處理可顯著降低I/R大鼠腦梗死體積、腦水腫率。見表1、圖1。

表1 各組神經功能缺失評分、腦梗死體積百分比、腦水腫率、神經元凋亡及腦組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達比較

紅色表示正常腦組織，白色表示腦梗死組織

2.3Res對I/R大鼠病理改變的影響 Sham組腦神經元細胞排列規則、緊密，形態正常，無間質水腫，核仁清楚可見；I/R組腦缺血側結構疏松，細胞輪廓模糊，間質明顯水腫，細胞核固縮，細胞質嗜酸性增加，可見空泡形成；Res低劑量、中、高劑量組病理損傷均有不同程度上的減輕，與I/R組相比，神經元結構相對完整，正常神經元細胞明顯增多，Res中劑量組神經保護作用最明顯。見圖2。

圖2 HE染色檢測各組病理改變(×400)

2.4Res對I/R神經元凋亡的影響 I/R組陽性神經元數量顯著多于Sham組(P<0.001)，Res低劑量組陽性神經元數量與I/R組相比無明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組陽性神經元數量顯著少于I/R組(P<0.001)，表明30、60 mg/kg劑量的Res處理可顯著抑制I/R大鼠梗死區腦神經元凋亡。見表1。

2.5Res對I/R凋亡相關蛋白表達水平的影響 I/R組缺血再灌注區腦組織Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平顯著低于Sham組，Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達水平顯著高于Sham組(P<0.05)；Res低劑量與I/R組相比無明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平顯著高于I/R組，Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達水平顯著低于I/R組(P<0.05)。見表1、表2、圖3。

2.6Res對I/R JAK1/STAT1信號通路的影響 I/R組缺血再灌注區腦組織p-JAK1、p-STAT1蛋白表達水平顯著高于Sham組(P<0.01)；Res低劑量與I/R組相比無明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組p-JAK1、p-STAT1蛋白表達水平顯著低于I/R組(P<0.01)，各組JAK1、STAT1蛋白表達水平相比無明顯變化(P>0.05)。見表2、圖4。

表2 各組腦組織Bcl-2、Bax、caspase-3、JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達比較

1～5:Sham組,I/R組,Res低劑量組,Res中劑量組,Res高劑量組；圖4同

圖4 Res對I/R大鼠JAK1/STAT1信號通路的影響

3 討 論

缺血性腦卒中后腦損傷是由一些列復雜的病理生理事件所導致的，包括興奮性毒性、氧化應激、炎癥和細胞凋亡〔9〕。然而，有關缺血性腦卒中后腦損傷并無最佳治療措施，原因與缺血性腦卒中后發生的細胞和分子變化并不完全清楚有關，這些變化也是導致神經元凋亡的原因之一。因此，對腦缺血再灌注損傷的分子機制進行深入研究，以制定出增加有效的治療方案，對改善缺血性腦卒中患者預后具有十分重要的意義。

Res廣泛存在于70多種植物中，具有很強的抗氧化活性，藥理學研究顯示，其可對炎癥反應、氧化應激及心血管疾病等發揮作用〔10〕。報道發現，Res對心臟損傷/心肌梗死、出血性腦、肺、皮膚損傷等有一定的保護作用，而這些作用是通過抑制炎癥和氧化應激，升高一氧化氮水平，介導離子通道激活以及促進自噬來實現的〔11〕。Fang等〔12〕研究表明，Res可降低腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦梗死面積、腦水腫量，減少神經元凋亡，降低髓過氧化物酶和腫瘤壞死因子-α水平，提示Res對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能與減輕腦缺血再灌注所致的炎癥和細胞凋亡有關。本研究結果說明，模型建立成功，符合臨床觀察結果。本研究結果提示，中、高劑量Res能夠減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，改善神經功能，發揮腦組織保護作用。張躍奇等〔13〕報道亦表明，Res預處理干預可有效改善大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能。

JAK/STAT信號通路是一種多效性級聯反應通路，能夠將信號從質膜傳至細胞核內〔14〕。JAK/STAT家族包含多個成員，其中JAK1/STAT1信號通路在缺血再灌注損傷中發揮著重要的作用〔15〕。有實驗〔16〕表明，JAK1/STAT1信號通路可影響心肌缺血再灌注小鼠caspase-3表達，減輕心肌細胞凋亡，保護心肌組織〔16〕。另外，JAK1/STAT1信號通路被抑制以后，氧化應激反應明顯受到抑制，炎癥反應也明顯減輕，腦組織凋亡亦減少，提示JAK1/STAT1信號通路能夠減少神經元細胞凋亡，發揮腦保護作用〔17〕。本研究結果表明，Res處理可抑制p-JAK1、p-STAT1磷酸化，上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制促凋亡蛋白Bax表達，同時抑制caspase-3表達，進而減少神經元細胞凋亡，以減輕腦缺血再灌注損傷，最終發揮腦組織保護作用。即Res可能是通過影響凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3表達，來抑制神經元凋亡，進而減輕腦缺血再灌注損傷。既往研究〔18〕表明，Res可上調海馬Bcl-2表達，進而減輕腦缺血神經損傷。Park等〔19〕通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型發現，Res可激活蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激酶(GSK)-3β信號通路，增加Akt、GSK-3β磷酸化水平，下調caspase-3表達，抑制細胞凋亡，發揮神經保護作用。Lei等〔20〕研究指出，采用Res處理MCAO法建立的大鼠發現，其神經功能缺損評分顯著降低，腦水腫明顯減少，炎癥反應明顯減輕，而使用磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制劑LY294002抑制PI3K/Akt信號通路后，以上作用均被阻斷，提示Res主要通過PI3K/Akt信號通路減輕局灶性腦缺血再灌注損傷。本研究初步闡明了Res處理可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的機制，但Res調節大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的詳細分子機制有待深入研究。

綜上，Res處理可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，其機制可能是通過抑制JAK1/STAT1信號通路，降低其磷酸化水平，進而影響凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3表達，提示Res對缺血性腦卒中有一定的治療價值。