circ_0016788靶向調控miR-1200抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲

于海東 楊海明 馬存凱 郭應興

(青海大學附屬醫院介入診療科，青海 西寧 810000)

肝細胞癌是全球最常見的癌癥，其死亡率高，近年來，分子靶向療法已經在臨床上用于治療包括肝癌在內的多種癌癥，更具選擇性和特異性，因此研發出更多旨在靶向特定途徑的靶向藥物對肝細胞癌的臨床治療具有重要意義〔1,2〕。環狀核糖核酸(circRNA)在人類癌癥的發生中起重要作用，circRNA表達的改變與肝癌的發生、侵襲和轉移有關，有作為診斷和預后生物標志物的潛在價值〔3〕。研究報道在肝癌組織和細胞系中circ_0016788被上調；circ_0016788沉默可通過miR-486/細胞周期蛋白依賴激酶(CDK4)途徑抑制肝細胞癌體外細胞的增殖、侵襲，并促進細胞凋亡〔4〕。circ_0016788高表達與較短的總生存期相關，其具有潛在的生物標志物的作用，可協助外科肝癌患者進行個性化治療，腫瘤治療和預后監測〔5〕。然而circ_0016788影響肝癌細胞惡性生物學行為的分子機制尚未完全清楚。本實驗通過在線預測軟件預測發現circ_0016788和miR-1200存在互補結合位點。且研究報道RGMB-AS1通過海綿miR-1200促進同源異型盒基因(HOX)B2表達，從而促進神經膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力〔6〕。circ-0001785通過使miR-1200海綿化以上調HOXB2表達來調節骨肉瘤的發病機制〔7〕。說明長鏈非編碼RNA(lncRNA)和circRNA均可通過靶向調控miR-1200的表達影響腫瘤的發生發展。因此，本實驗旨在研究circ_0016788是否可通過調控miR-1200抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取2018年1月至2020年6月在青海大學附屬醫院接受肝切除術治療的肝癌患者9例，收集患者手術切除癌組織及癌旁組織。所有患者臨床及病理資料完整，且簽署知情同意書。

1.2材料 肝癌細胞MHCC97購自上海冠導生物工程有限公司；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購自美國Biovision公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；凋亡檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；RPMI1640培養基購自上海谷研實業有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.3細胞轉染與分組 將肝癌細胞MHCC97接種至RPMI1640培養基進行常規培養，待細胞長至對數生長期，將circ_0016788干擾載體質粒si-circ_0016788及其陰性對照si-NC分別轉染至細胞內，記為si-circ_0016788組、si-NC組；將si-circ_0016788與miR-1200抑制劑anti-miR-1200及其陰性對照anti-miR-NC分別共轉染至MHCC97細胞內，記為si-circ_0016788+anti-miR-1200組和si-circ_0016788+anti-miR-NC組。

1.4RT-qPCR檢測癌組織及癌旁組織circ_0016788和miR-1200表達水平 提取癌組織及癌旁組織中細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA進行PCR擴增。miR-1200以U6為內參，circ_0016788以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算其相對表達量。其中circ_0016788上游引物：5′-CAGTTTATGATTGCCG TCCTCC-3′，下游：5′-GTGATCGTCTAGGTGGTAACC-3′；miR-1200上游引物：5′-ACACT CCAGCTGGGCT CCTGAGCCATTCTG-3′，下游：5′-CTCAACTGGTGTC GTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAGGCTCA-3′；GAPDH上游引物：5′-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3′，下游：5′-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3′；U6上游引物：5′-CGTTCACGCATCTTTAAAATTGGA-3′，下游：5′-TTATGCGTGTCATCCTTGCG-3′。

1.5circ_0016788對細胞增殖活性的影響檢測 將對數生長期肝癌細胞MHCC97制成細胞懸液后接種至96孔板，于CO2孵育箱常規培養24 h，在96孔板內加入20 μl MTT溶液繼續培養4 h，每孔中再加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)于搖床上振蕩10 min充分反應，通過多功能酶標儀于450 nm波長下檢測其吸光度(OD)值。

1.6Western印跡檢測蛋白表達 將對數生長期肝癌細胞MHCC9裂解提取總蛋白，測定蛋白濃度后進行電泳分離，電泳結束后將凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在凝膠中加入封閉液37℃封閉2 h，加入一抗4℃孵育24 h；次日加入相應二抗37℃孵育1 h，采用ImageJ軟件對各蛋白條帶灰度值進行分析。

1.7Transwell檢測細胞遷移、侵襲 侵襲實驗前需要預先在Transwell小室上層鋪設基質膠，遷移實驗無需鋪膠，其余實驗步驟一致。收集對數生長期肝癌細胞MHCC9接種至24孔板，加入無血清培養基孵育12 h后棄去培養基，胰酶消化后通過無血清培養將其液制成至1×105個/ml的單細胞懸液，Transwell小室上層加入150 μl/孔肝癌細胞MHCC9，下層加入600 μl/孔培養基于CO2孵育箱孵育24 h，多聚甲醇固定15 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加結晶紫染色20 min，再次用PBS沖洗至背景清晰后于熒光顯微鏡下拍照，計數穿膜細胞。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組對數生長期肝癌細胞MHCC9接種至96孔板培養48 h，加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶制成單細胞懸液。加PBS沖洗細胞后，重懸于結合緩沖液中并制成1.0×106個/ml的單細胞懸液。加入10 μl的膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)染液和5 μl的碘化丙啶(PI)染液，充分混勻后4℃避光孵育20 min；上機檢測細胞凋亡率。

1.9circ_0016788和miR-1200的靶向關系驗證 構建circ_0016788野生型(WT-circ_0016788)和circ_0016788突變型(MUT-circ_0016788)熒光素酶表達載體，將上述載體與miR-1200過表達質粒(miR-1200 mimics)、陰性對照質粒(miR-NC)共轉染至肝癌細胞MHCC97中，通過雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細胞熒光素酶活性。

1.10統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1肝癌組織circ_0016788和miR-1200表達水平 circ_0016788在肝癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，miR-1200表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 肝癌組織circ_0016788和miR-1200表達水平

2.2抑制circ_0016788表達降低肝癌MHCC97細胞增殖活性 與si-NC組相比，si-circ_0016788組肝癌MHCC97細胞增殖活性及circ_0016788、CyclinD1表達水平顯著降低(P<0.05)，p21表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、表2。

2.3抑制circ_0016788表達抑制肝癌MHCC97細胞遷移、侵襲 與si-NC組相比，si-circ_0016788組肝癌MHCC97細胞遷移、侵襲細胞數及MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2、圖3。

圖1 兩組CyclinD1、p21蛋白表達

表2 抑制circ_0016788表達降低肝癌MHCC97細胞增殖活性及遷移、侵襲能力

2.4抑制circ_0016788表達促進肝癌MHCC97細胞凋亡 與si-NC組比，si-circ_0016788組肝癌MHCC97細胞凋亡率及Bax表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、表3。

圖2 兩組MMP-2、MMP-9蛋白表達

圖3 抑制circ_0016788表達抑制肝癌MHCC97細胞遷移侵襲能力(結晶紫染色，×200)

圖4 抑制circ_0016788表達促進肝癌MHCC97細胞凋亡

表3 抑制circ_0016788表達促進肝癌MHCC97細胞凋亡

2.5circ_0016788靶向調控miR-1200的表達 circ_0016788的序列中包含與miR-1200的結合位點(圖5)。實驗結果顯示，與共轉染WT-circ_0016788和miR-NC的細胞相比，共轉染WT-circ_0016788和miR-1200的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而共轉染MUT-circ_0016788與miR-1200細胞的熒光素酶活性與共轉染MUT-circ_0016788和miR-NC的細胞相比無顯著差異(P>0.05)。見表5。

2.6miR-1200的下調逆轉了抑制circ_0016788對肝癌MHCC97細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與si-circ_0016788+anti-miR-NC組相比，si-circ_0016788+anti-miR-1200組肝癌MHCC97細胞活性及遷移、侵襲細胞數顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率降低(P<0.05)；miR-1200、p21、Bax表達水平顯著降低(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖6、圖7、表5、表6、圖8。

圖5 circ_0016788與miR-1200互補結合位點

表5 細胞熒光素酶活性

圖6 肝癌MHCC97細胞遷移、侵襲能力(結晶紫染色，×200)

圖7 細胞凋亡流式圖

表5 miR-1200的下調逆轉了抑制circ_0016788對肝癌MHCC97細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

表6 miR-1200的下調逆轉了抑制circ_0016788對肝癌MHCC97細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關蛋白表達的影響

1～4:si-NC組，si-circ_0016788組，si-circ_0016788+anti-miR-NC組，si-circ_0016788+anti-miR-1200組

3 討 論

越來越多的分子靶向藥物已用于治療晚期肝癌，但是，因為腫瘤的異質性和復雜的細胞信號轉導，單靶標治療結果不盡如人意，因此提出針對多靶點的聯合治療〔8〕。而深入研究肝癌發病的分子機制，才能尋找更有效的靶點以開發新的靶向藥物。研究表明circRNA可通過調控miRNA影響肝癌的進展〔9〕。如circ_0000502通過靶向miR-124促進肝細胞癌轉移并抑制細胞凋亡〔10〕。circRNA_103809通過調節miR-377-3p/成纖維細胞生長因子受體(FGFR)1/細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)軸促進肝細胞癌的發展〔11〕。circRNA-104718通過miR-218-5p/TXNDC5可加速肝細胞癌細胞增殖、遷移、侵襲并抑制細胞凋亡〔12〕。研究證實，circ_0016788在肝細胞癌組織和細胞系中表達上調，抑制circ_0016788表達可降低肝癌MHCC97細胞的增殖和轉移能力，促進其凋亡〔4〕。本實驗結果顯示，肝癌組織中circ_0016788表達水平升高，而抑制circ_0016788表達可抑制肝癌MHCC97細胞增殖、遷移及侵襲，誘導細胞凋亡，與既往研究結果相一致。

研究表明，miRNA在肝癌的發生發展過程中發揮著重要作用，miR-1179過表達減弱了肝癌細胞的增殖和遷移能力〔13〕。miR-206通過調節cMET表達抑制肝癌細胞的增殖和遷移，但促進凋亡〔14〕。本實驗通過在線預測軟件預測顯示circ_0016788與miR-1200存在互補結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果證實circ_0016788可靶向調控miR-1200。有研究報道顯示circ_0026359通過靶向miR-1200/DNA聚合酶δ4亞基(POLD4)途徑增強胃癌的順鉑耐藥性〔15〕。本實驗結果提示miR-1200可能參與了肝癌的進展過程。同時抑制miR-1200和circ_0016788表達可促進肝癌MHCC97細胞增殖、遷移及侵襲，抑制細胞凋亡，說明下調miR-1200表達可逆轉抑制circ_0016788對MHCC97細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用。綜上，circ_0016788可通過靶向調控miR-1200抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。