咪達唑侖調控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路對缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞增殖及凋亡的影響

舒蕤 趙立芳 彭井印 張如意

(濱州醫學院附屬醫院麻醉科，山東 濱州 256603)

腦缺血再灌注損傷是臨床常見的一種病理過程，海馬神經元細胞增殖、凋亡異常是腦缺血再灌注損傷發生的重要原因之一，因而如何減輕腦缺血再灌注損傷成為研究重點〔1～3〕。咪達唑侖屬于γ氨基丁酸受體激動劑，其具有鎮靜、抗焦慮等作用，咪達唑侖通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)-細胞外調節蛋白激酶(ERK)途徑而抑制氧化應激誘導的神經元細胞凋亡從而減輕細胞損傷〔4〕。但咪達唑侖對缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞損傷的影響及其可能作用機制尚未闡明。miR-214-3p在阿爾茨海默病中表達水平降低，并可通過抑制自噬而減輕認知障礙〔5〕。miR-214可調控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號通路而參與口腔癌的發生過程，已有研究表明MAPK/ERK-環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)通路被激活后可促進海馬神經元細胞凋亡而造成細胞損傷〔6，7〕。但咪達唑侖是否可通過調控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路而減輕腦缺血再灌注損傷尚未可知。本研究采用缺氧復氧誘導大鼠海馬神經元細胞建立細胞損傷模型，探討咪達唑侖對缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞增殖、凋亡的影響及其對miR-214/MAPK/ERK-CREB通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 咪達唑侖購自江蘇恩華藥業股份有限公司；大鼠海馬神經元細胞購自美國模式菌種收集中心(ATCC)細胞庫；DMEM培養基購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000、凋亡檢測試劑購自北京索萊寶科技有限公司；MAPK/ERK-CREB通路抑制劑PD98059(母液20 mg/ml)購自碧云天生物技術研究所；anti-miR-con、anti-miR-214購自廣州銳博生物科技有限公司；噻唑藍(MTT)試劑購自廣州勞斯生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；兔抗鼠、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗鼠MAPK、p-ERK、p-CREB抗體與IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.2實驗分組 大鼠海馬神經元細胞置于密閉缺氧的培養箱內(95% N2、5%CO2)缺氧處理4 h，將其轉移至37℃、體積分數5%CO2正常培養箱復氧處理24 h〔8〕，記為缺氧復氧組。同時將正常培養的細胞記為NC組。大鼠海馬神經元細胞加入含有不同濃度(3、6、12 μmol/ml)咪達唑侖的培養基處理24 h后進行缺氧復氧處理〔9〕，分別記為3、6、12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧組。anti-miR-con、anti-miR-214分別轉染入大鼠海馬神經元細胞后加入12 μmol/ml咪達唑侖處理24 h后進行缺氧復氧處理，分別記為12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組。anti-miR-214轉染入大鼠海馬神經元細胞后加入12 μmol/ml 咪達唑侖與50 μmol/L抑制劑PD98059處理24 h后進行缺氧復氧處理〔10〕，記為PD98059+12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組。

1.3MTT檢測細胞增殖 收集各組海馬神經元細胞接種于96孔板(150 μl/孔)，每孔加入質量濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后棄上清，加入150 μl DMSO，室溫避光振蕩孵育5 min后應用酶標儀檢測各孔吸光度值(A值)。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組海馬神經元細胞加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清，將500 μl結合緩沖液加入細胞沉淀后分別加入5 μl膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)，振蕩搖晃孵育10 min后應用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(PCR)檢測細胞中miR-214的表達水平 收集各組海馬神經元細胞后采用Trizol法提取RNA，反轉錄合成cDNA，PCR擴增反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-214相對表達量。

1.6Western印跡檢測MAPK、p-ERK、p-CREB、Bax、Bcl-2蛋白表達 提取各組海馬神經元細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃條件下孵育一抗稀釋液(1∶1 000)過夜，TBST洗滌，室溫條件下孵育二抗稀釋液(1∶2 000)1 h，滴加電化學發光(ECL)顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.7統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1不同濃度咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經元細胞活性的影響 與NC組比較，缺氧復氧組細胞活力明顯降低(P<0.05)；與缺氧復氧組比較，3、6、12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧組細胞活力明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.2不同濃度咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經元細胞凋亡的影響 與NC組比較，缺氧復氧組細胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與缺氧復氧組比較，3、6、12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧組細胞凋亡率明顯降低，Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

2.3不同濃度咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經元細胞中miR-214表達水平的影響 與NC組比較，缺氧復氧組miR-214的表達水平明顯降低(P<0.05)；與缺氧復氧組比較，3、6、12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧組miR-214表達水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經元細胞活性、凋亡和細胞中miR-214表達水平的影響

1～5：對照組、缺氧復氧組、3 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組、6 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組；圖2同

圖2 Western印跡檢測各組Bax、Bcl-2蛋白表達

2.4下調miR-214表達抑制咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經元細胞的影響 與12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組比較，12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組細胞活力降低，凋亡率升高，Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖3、表2。

2.5缺氧復氧處理的大鼠海馬神經元細胞中MAPK/ERK-CRE通路相關蛋白表達 與NC組比較，缺氧復氧組MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與缺氧復氧組比較，12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組比較，12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見表3、圖4。

1，2：12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組

表2 下調miR-214表達抑制咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經元細胞的影響

表3 缺氧復氧處理的大鼠海馬神經元細胞中MAPK/ERK-CRE通路相關蛋白表達

1～5：對照組、缺氧復氧組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組

2.6抑制劑PD98059可以逆轉miR-214下調表達對咪達唑侖處理的缺氧復氧大鼠海馬神經元細胞的影響 與12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組比較，PD98059+12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組細胞活力升高，凋亡率降低，MAPK、p-ERK、p-CREB、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5、表4。

1，2：12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組、PD98059+12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組

表4 抑制劑PD98059可以逆轉miR-214下調表達對咪達唑侖處理的缺氧復氧大鼠海馬神經元細胞的影響

3 討 論

咪達唑侖可減輕脂多糖誘導的肝損傷而對肝臟組織發揮保護作用〔11〕。咪達唑侖可通過調控JNK-ERK途徑而抑制氧化應激誘導的神經細胞凋亡從而減輕細胞損傷〔12〕。本研究結果提示,咪達唑侖可促進缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞增殖。本研究結果與相關文獻報道結果相似〔13〕，咪達唑侖可抑制缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞凋亡。

本研究結果提示，咪達唑侖可能通過上調miR-214的表達而減輕缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞損傷。研究表明，miR-214在脂多糖誘導的膿毒癥、急性腎損傷等疾病中表達異常，還可減輕神經細胞損傷〔14～16〕。本研究結果提示，抑制miR-214表達可拮抗咪達唑侖對缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞增殖及凋亡的作用。MAPK家族成員的作用為將細胞外信號轉導入細胞內部，其與ERK1/2在海馬區可發揮重要調控作用，ERK通路激活后可促進CREB發生磷酸化而調控神經元增殖及凋亡等過程〔17，18〕。本研究結果提示，咪達唑侖可能通過調控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路而發揮作用。同時，本研究為進一步證實上述猜測，將MAPK/ERK-CREB通路抑制劑與miR-214抑制劑添加至缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞中，結果提示咪達唑侖可通過促進miR-214的表達而抑制MAPK/ERK-CREB通路從而發揮作用。

綜上，缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞中miR-214的表達水平降低，咪達唑侖可促進miR-214的表達而促進缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元細胞增殖及抑制細胞凋亡，其作用機制與抑制MAPK/ERK-CREB通路的活化有關。