β-細辛醚對氧糖剝奪/復糖復氧誘導星形膠質細胞損傷的保護作用及機制研究*

盧志剛，盧 青，丁運宇，高志遠

(湖北民族大學附屬荊門市第一人民醫院神經內科，湖北荊門 448000)

腦血管病已成為危害健康的重要疾病，具有較高的發生率、復發率、致殘率和死亡率。約85%的腦卒中是由大腦動脈閉塞引起的缺血性腦卒中[1]。缺血性卒中導致了大腦缺血區域的細胞功能障礙及細胞死亡。通過再灌注恢復血液供應可以挽救缺血組織，但再灌注本身會造成組織損傷，稱為腦缺血再灌注損傷(CIRI)[2]。缺血卒中區域的再灌注和血供的恢復往往會導致一系列的細胞生化后果，CIRI的病理機制包括過度活性氧(ROS)的產生、細胞氧化損傷、炎癥級聯反應的激活及再灌注組織中細胞凋亡的誘導[3-4]。目前，靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)和血管內治療已被廣泛應用于臨床，并已證明可降低致殘風險[5]。然而，這些治療方法可能在加重神經元死亡的同時也加重神經功能障礙[6]。探索腦損傷的機制，尋找減輕CIRI的藥物已成為腦缺血治療的重點。中藥在這方面發揮著獨特的作用，主要體現在抗氧化和病理損傷、減少興奮性氨基酸的神經毒素、清除自由基、減少鈣超載、影響血小板和血栓形成、調節凋亡等[7]。

石菖蒲的有效活性物質β-細辛醚能有效改善CIRI，與抑制炎性反應、減輕氧化應激、改善能量代謝、降低細胞興奮性毒性及保護血腦屏障等作用機制關系密切[8]。然而，β-細辛醚的作用機制尚未完全闡明。星形膠質細胞介導的炎癥和氧化應激在急性缺血性腦卒中后引起了CIRI[9]。本實驗采用星形膠質細胞氧糖剝奪(OGD)/復氧復糖(R)損傷模擬構建CIRI體外模型，觀察β-細辛醚對星形膠質細胞的神經保護作用，為進一步探討CIRI的機制和腦保護機制提供有價值的思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

6～8周齡的15只雄性C57BL/6小鼠，體重20～30 g，購自華中科技大學實驗動物中心(SCXK2016-2009)。

1.1.2主要藥品與試劑

β-細辛醚對照品(美國Sigma公司，純度>98%，貨號：5273-86-9)。胎牛血清、DMEM高糖培養基(美國Gibco公司，批號分別為10099、p002548)。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，批號分別為A005-1-2、A020-1-2、A003-1-2、A001-3-2)。小鼠核因子-κB亞基p65(NF-κB p65)、白細胞介素(IL)-1β、IL-18 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為E-EL-M0838c、E-EL-M0037c、E-EL-M0730c)。實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑、cDNA合成試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號分別為11781200、20190607)。Nrf2多克隆抗體、醌氧化還原酶1(NQO1)多克隆抗體、血紅素氧化酶-1(HO-1)多克隆抗體、GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、Nrf2抑制劑N-{4-[2,3-二氫-1-(2’-甲基苯甲酰)-1H-吲哚-5-基]-5-甲基-2-噻唑基}-1,3-苯并二氧唑-5-乙酰胺(ML385)、活性氧熒光探針(DCFH-DA)試劑盒、CCK-8試劑盒(美國Sigma公司，批號分別為PA5-27882、PA5-115666、PA5-77834、PA5-116420、MA5-15367、SML1833、BL714A、7010000)。膜聯蛋白(Annexin)V-PE/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司，批號CA1120)。

1.1.3主要儀器

Forma371型細胞培養箱、ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀(美國BD公司)；iMark全自動酶標儀(美國Bio-RAD公司)；WD-9413B型凝膠成像系統(北京六一生物科技有限公司)；JY92-IIN超聲波細胞破碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；CKX31SF倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1星形膠質細胞的分離培養[10]

取出乳鼠-20 ℃冰凍麻醉，75%乙醇消毒，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后分離腦組織，加入DMEM培養基洗滌，分離出大腦皮質，剪碎后胰蛋白酶消化，孵育過篩，加入D-Hanks液洗滌離心，棄上清液得細胞團。與培養液混合后，接種到包被多聚賴氨酸后的細胞培養板中，種板后換液繼續培養。14 d后搖床下分離出星形膠質細胞，經GFAP免疫熒光鑒定確認。

1.2.2OGD/R體外模型的建立[11]及分組處理

將星形膠質細胞分為5組：對照組、模型組、β-細辛醚(50 μg/mL)組、ML385(5 μmol/L)組、β-細辛醚(50 μg/mL)+ML385(5 μmol/L)組。OGD/R體外模型的構建：純化后的原代星形膠質細胞在正常培養條件下，種板培養融合率在80%時去除原培養基，PBS洗滌細胞3次，換成無血清無糖培養液，在含95%氮氣及5%二氧化碳的培養箱內37 ℃培養6 h，隨后更換為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基。β-細辛醚組、ML385組、β-細辛醚+ML385組分別加入50 μmol/L β-細辛醚、5 μmol/L ML385及50 μmol/L β-細辛醚+5 μmol/L ML385，放在含5%二氧化碳及95%空氣的培養箱內37 ℃培養24 h。對照組一直在含糖含氧環境中培養，模型組僅予以OGD 6 h/R 24 h處理。

1.2.3CCK-8法檢測細胞存活率

5組細胞按照1.2.2方法處理后接種到96孔板內，每孔內加入CCK-8溶液10 μL，在37 ℃、5%二氧化碳的培養箱內繼續孵育1 h，未接種細胞的孔為空白凋零孔，采用全自動酶標儀在450 nm處測定吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組A值/空白組A值×100%。

1.2.4二硝基苯肼法檢測LDH漏出率

5組細胞按照1.2.2方法處理后，分別收集各組細胞及其上清液，細胞被超聲破碎為勻漿，按照LDH檢測試劑盒嚴格檢測上清液和細胞勻漿中LDH的A值，計算LDH漏出率。漏出率=上清液中A值/(上清液LDH A值+細胞勻漿中LDH A值)×100%。

1.2.5流式細胞術[12]測定細胞凋亡水平

5組細胞按照1.2.2方法處理后，用冷PBS清洗處理過的細胞，加入胰酶室溫消化，取細胞懸浮液4 ℃離心，棄上清液后收集細胞。細胞PBS重懸后再次離心棄上清液，加入緩沖液懸浮細胞后嚴格按照試劑盒步驟加入2 μL Annexin-V抗體及2 μL 7-AAD染料進行染色，然后采用流式細胞儀進行檢測。

1.2.6星形膠質細胞氧化應激水平的檢測

1.2.6.12’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)法檢測ROS的表達

嚴格按試劑盒說明書要求操作。細胞于無血清培養基稀釋DCFH-DA至終濃度為10 μmol/L，吸走培養基，加入DCFH-DA至終濃度為10 μmol/L，37 ℃培養箱內孵育20 min，用無血清培養基洗滌細胞，胰酶消化，離心后重懸細胞，流式細胞術檢測其熒光強度。對照組作為參照(熒光強度為100%)，其余4組與之比較代表其相對ROS的活性。

1.2.6.2生化法檢測上清液中氧化應激水平

細胞按1.2.2方法處理以后，收集經胰蛋白酶消化后的各組細胞，在冰上超聲裂解，離心后取上清液。按照試劑盒步驟硫代巴比妥酸法檢測MDA，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，分光光度法檢測GSH-Px。

1.2.7ELISA檢測上清液中的炎癥因子

細胞處理同1.2.6.2方法，采用ELISA試劑盒按說明書步驟檢測上清液中NF-κB p56、IL-1β和IL-18水平。

1.2.8RT-qPCR檢測Nrf2、HO-1 mRNA的表達水平

取各組細胞，采用TRizol法提取細胞內總RNA，超微量分光光度計檢測RNA濃度后置于—80 ℃冰箱保存。逆轉錄合成cDNA，以其為模板，GAPDH管家基因作為內參，然后進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正向引物及反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，補足RNase-Free ddH2O至總體積20 μL。反應條件：95 ℃預變性45 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次。循環結束后以2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達水平。PCR引物序列和產物長度見表1。

表1 PCR引物序列和產物長度

1.2.9Western blot[13]檢測Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達水平

取對數生長期的星形膠質細胞，按1.2.2方法分組及處理，每組分別設立3個復孔。培養結束，收集經胰蛋白酶消化后的各組細胞，超聲細胞破碎儀冰上粉碎后4 ℃離心，取上清液即獲得細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白樣品，根據蛋白濃度調整上樣量。蛋白樣品95 ℃沸水高溫變性后，加至10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠加樣孔內，60 V恒壓濃縮膠電泳，75 V、90 min恒壓分離膠電泳，250 mA 3 h恒定電流進行轉膜，TBST洗膜后室溫下以5%脫脂奶粉中搖床上封閉1 h，取膜加入Nrf2、NQO-1、HO-1一抗稀釋液與內參GAPDH抗體稀釋液(稀釋度分別為1∶1 000、1∶800、1∶1 000、1∶2 000)，4 ℃孵育過夜；次日以TBST溶液清洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(HRP)二抗(稀釋度為1∶3 000)，室溫下搖床孵育1 h；以TBST洗膜3次，每次10 min，避光，采用ECL顯色后凝膠成像系統曝光顯影定影成像。采用Image J軟件分析，以目的蛋白/內參蛋白灰度值之間的比值表示相關蛋白的表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 β-細辛醚對OGD/R誘導的星形膠質細胞存活率和凋亡率的影響

與對照組比較，模型組、ML385組、β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組細胞存活率明顯下降，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組細胞存活率明顯升高，細胞凋亡率明顯下降，ML385組則相反(P<0.05)。與ML385組比較，β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組細胞存活率明顯升高，細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，見表2、圖1。

圖1 各組星形膠質細胞Annexin V/7-AAD雙染法細胞凋亡圖

表2 各組腦組織星形膠質細胞存活率及凋亡率比較

2.2 β-細辛醚對OGD/R誘導的星形膠質細胞氧化應激水平的影響

與對照組比較，模型組、ML385組及β-細辛醚+ML385組LDH漏出率、MDA、ROS熒光強度明顯升高，SOD、GSH-Px水平明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組LDH漏出率、MDA、ROS熒光強度明顯下降，SOD、GSH-Px水平明顯升高，而ML385組上述指標則相反(P<0.05)。與ML385組比較，β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組LDH漏出率、MDA、ROS熒光強度明顯下降，SOD、GSH-Px水平明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組腦組織星形膠質細胞氧化應激水平比較

2.3 β-細辛醚對OGD/R誘導的星形膠質細胞炎癥因子水平的影響

與對照組比較，模型組、ML385組、β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組NF-κB p65、IL-1β、IL-18水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組NF-κB p65、IL-1β、IL-18水平明顯下降(P<0.05)，而ML385組上述指標則相反(P<0.05)。與ML385組比較，β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組NF-κB p65、IL-1β、IL-18水平明顯下降(P<0.05)，見表4。

表4 各組腦組織星形膠質細胞炎癥因子水平比較

2.4 β-細辛醚對OGD/R誘導的星形膠質細胞中Nrf2和HO-1 mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組、ML385組及β-細辛醚+ML385組Nrf2、HO-1 mRNA表達明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組Nrf2、HO-1 mRNA表達明顯升高，而ML385組上述指標則相反(P<0.05)。與ML385組比較，β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組的Nrf2、HO-1 mRNA表達明顯升高(P<0.05)，見表5。

表5 各組腦組織星形膠質細胞Nrf2和HO-1 mRNA表達水平的檢測結果

2.5 β-細辛醚對OGD/R誘導的星形膠質細胞Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組、ML385組及β-細辛醚+ML385組Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白表達明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，ML385組、β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白表達明顯升高，而ML385組上述指標則相反(P<0.05)。與ML385組比較，β-細辛醚組及β-細辛醚+ML385組Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白表達明顯升高(P<0.05)，見表6、圖2。

表6 各組腦組織星形膠質細胞相關蛋白表達水平

圖2 各組星形膠質細胞Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白表達的電泳圖

3 討 論

近年來，缺血性腦卒中的發生率持續上升。缺血性腦卒中血流恢復會加重損傷并引起CIRI。CIRI的發生與線粒體能量代謝紊亂、興奮性氨基酸毒性、離子平衡失衡、氧化應激、炎性反應、細胞凋亡和血腦屏障破壞等有關[14]。因此，預防和治療CIRI是缺血性腦卒中治療的重點。腦缺血再灌注引起腦損傷，這與腦內的氧自由基密切相關。腦缺血再灌注誘導的LDH釋放和MDA積累可以直接反映腦缺血的嚴重程度和脂質過氧化的程度。SOD和GSH-px是強大的自由基清除因子，可以減少腦缺血再灌注誘導的氧化應激。Nrf2通路是近年來抗氧化研究的重點[15]。Nrf2通路通過上調一系列內源性保護基因顯示出抗氧化作用[16]。HO-1和NQO-1是抵抗氧化應激的兩種主要蛋白質[17]。HO-1催化膽綠素、膽紅素和鐵蛋白的形成，從而表現出抗氧化活性。NQO-1通過阻止ROS的產生發揮抗氧化應激作用[18]。急性腦缺血再灌注可觸發神經炎癥，激活先天免疫反應，進而引發一系列炎癥級聯反應和氧化應激,而炎性反應被認為是CIRI的一個重要的病理生理過程，氧化應激是CIRI的重要發病機制，含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)炎癥小體參與炎癥級聯調控，ROS可誘導NLRP3激活,啟動NLRP3/半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)焦亡信號通路，促進通路下游炎性因子凋亡相關點樣蛋白(ASC)、caspase-1、IL-1β和IL-18的分泌，在CIRI的發生、發展中扮演了關鍵的角色[19-22]。

β-細辛醚是中藥石菖蒲的主要有效成分，具有較強的抗炎效果，藥效易透過血腦屏障起到腦保護作用[23]。本研究發現,與對照組比較，模型組OGD/R細胞中抗氧化因子Nrf2、HO-1、NQO-1表達和SOD、GSH-Px活性明顯下降，氧化應激因子ROS、LDH、MDA和促炎因子NF-κB p65、IL-1β、IL-18水平升高，而β-細辛醚可不同程度地降低OGD/R模型細胞中上述氧化應激因子和炎癥因子指標的水平，增加抗氧化因子，說明Nrf2通路在CIRI星形膠質細胞中失活，β-細辛醚重新激活了Nrf2通路并促進了抗氧化因子的表達及活性增加，并降低了氧化應激因子和促炎因子的水平。此外，β-細辛醚通過減少OGD/R誘導的氧化應激來抑制星形膠質細胞的凋亡，提高細胞的存活率，說明β-細辛醚可能通過激活Nrf2通路減輕OGD/R星形膠質細胞氧化應激反應和炎性反應的程度起到神經保護作用。

ML385是一種新型的、特異的Nrf2抑制劑，其能抑制Nrf2的下游靶基因的表達。本研究也發現，與對照組比較，ML385加劇了OGD/R誘導的星形膠質細胞的凋亡率，減少細胞存活率，抑制了Nrf2、HO-1和NQO-1表達，降低了SOD、GSH-Px活性并增加了ROS、LDH、MDA、NF-κB p65、IL-1β、IL-18的水平，而β-細辛醚干預后上述指標得到不同程度的改善。這些結果表明Nrf2被抑制后抗氧化因子明顯減少，炎癥因子明顯增加，細胞凋亡加重，Nrf2在CIRI中發揮重要作用，而通過β-細辛醚的干預可明顯改善氧化應激和炎性反應，對OGD/R誘導的星形膠質細胞具有保護作用。

綜上所述，β-細辛醚可能通過激活Nrf2通路，清除ROS進而進一步激活Nrf2/HO-1信號通路，緩解OGD/R誘導的星形膠質細胞氧化應激和炎癥損傷，減輕神經細胞的凋亡，從而發揮對大腦星形膠質細胞損傷的保護作用，這可能是β-細辛醚發揮抗CIRI藥效的物質基礎。