辣蓼治療胃潰瘍作用機制的網絡藥理學研究*

朱菲菲 趙雅媚 陳邦培 牛海艷 任守忠△

（1.海南醫(yī)學院，海南 海口 571199；2.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，海南 海口 570102）

胃潰瘍是日常生活中最常見的消化系統(tǒng)疾病，發(fā)病機制主要是致潰瘍因素與防御因素發(fā)生失衡有關［1］。吸煙、飲酒、幽門螺桿菌感染等是導致防御因素失衡的主要原因。目前，市場上治療胃潰瘍最常用的是質子泵抑制藥和抑酸類藥物，療效明顯但復發(fā)率高且不良反應多［2］。研究表明，中醫(yī)藥療法具有提高潰瘍愈合質量，降低不良反應，復發(fā)率低，療效顯著等優(yōu)勢［3］。辣蓼始載于《唐本草》，本品味辛，性溫，具有祛風除濕、散瘀止痛和消腫解毒的功效，除傳統(tǒng)療效外，還具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗?jié)兒捅Ｗo胃黏膜損傷等作用［4］。目前對辣蓼治療胃潰瘍的作用機制研究也有報道，Ayaz等［5］研究發(fā)現，辣蓼甲醇提取物對阿司匹林致大鼠胃潰瘍模型具有抗?jié)兒捅Ｗo胃黏膜的作用。劉洪梅等［6］證實，在乙醇致大鼠胃黏膜損傷前，使用楓蓼發(fā)酵提取液灌胃給藥，能抑制炎癥因子的表達，減輕乙醇對胃黏膜細胞的損傷。但中藥發(fā)揮治療作用是多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)共同調節(jié)機體而產生的結果，這些單一通路研究難以全面闡明中藥多成分-多靶點-多通路的協(xié)同作用機制。目前，網絡藥理學在中藥的分子機制研究中的應用越來越多，通過網絡藥理學構建可視化網絡，進而預測中藥治療疾病的作用機制。基于此，本研究采用網絡藥理學方法，探討辣蓼治療胃潰瘍的活性成分、作用靶點及調控通路，為辣蓼治療胃潰瘍的作用機制提供理論依據和新思路。

1 資料與方法

1.1 辣蓼活性成分及作用靶點的篩選 借助Web of Science、PubMed和中國知網數據庫收集辣蓼的化學成分，采用TCMSP數據庫（https：old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），逐一檢索所有化學成分，篩選活性成分的標準為OB＞30%、DL＞0.18，得到有效成分及其潛在蛋白靶點。將蛋白靶點整理并刪除重復項后，使用UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/），物種為Homo sapiens，將“靶點名稱”校正為“基因名稱”，即得到辣蓼活性成分的作用靶點。

1.2 胃潰瘍作用靶點的篩選 以“Gastric ulcer”為關鍵詞，在GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）、DisGeNet數據庫（https://www.Disgenet.org/）和OMIM數據庫（https://omim.org/）中進行檢索，獲取與胃潰瘍相關的作用靶點。整理并刪除重復作用靶點后，借助Venny2.1軟件將辣蓼活性成分的作用靶點與胃潰瘍相關的作用靶點繪制韋恩圖，取交集獲取辣蓼治療胃潰瘍的潛在作用靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）構建 將“1.2”項下取得的交集靶點導入STRING數據庫（https://cn.string-db.org/）中，物種限定為“Homo sapiens”，將交互分數設為最高置信度0.7，隱藏游離節(jié)點，其余的參數設置保持不變，獲取相互作用關系結果。將結果以“tsv”文件格式導入到Cytoscape3.7.2中，使用Network Analysis工具分析網絡圖的拓撲參數，并以degree值大于中位數的2倍篩選關鍵靶點。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析 將辣蓼-胃潰瘍的交集基因導入DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進行基因本體功能和京都基因與基因組百科全書通路富集分析，以顯著富集（P＜0.01）的生物學過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）的各前10個GO條目制作可視化柱狀圖并分析；以P＜0.01且基因富集程度排名前25位的通路繪制氣泡圖并分析。

1.5 活性成分-靶點-通路網絡構建與分析 為了科學解釋活性成分、靶點和通路的相互關系，將“1.4”項下收集到的與胃潰瘍相關的通路及其對應的靶點，并找出靶點對應的活性成分，用Cytoscape3.7.2軟件構建活性成分-靶點-通路的網絡并采用Network Analysis工具對活性成分、靶點和通路之間的關系進行可視化拓撲學屬性分析。

2 結果

2.1 辣蓼活性成分及作用靶點 從TCMSP數據庫及文獻中共篩選出辣蓼活性成分13種，包括黃酮類、生物堿類和酚類等，這些物質均具有良好的生物活性。此外，經文獻挖掘，趙維中等［7-8］發(fā)現金絲桃苷通過抗氧化和促進一氧化氮（NO）水平恢復對乙醇致小鼠胃黏膜損傷起到的保護作用和蘆丁對應激性胃黏膜損傷保護作用的機制可能與其抗氧化作用、鈣離子拮抗和改善GMBF有關。槲皮苷對NO、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達具有抑制作用［9］。基于此，將這3個成分一并納入研究。最終，篩選出活性成分共有16種，并獲得183個相關作用靶點，見表1。

表1 辣蓼主要活性成分

2.2 辣蓼治療胃潰瘍的靶點預測 以“Gastric ulcer”為關鍵詞，在GeneCards數據庫中，以Relevance score＞1為條件篩選得到4 227個靶點，DisGeNet數據庫中得到136個靶點，OMIM數據庫中得到81個靶點。將以上3個數據庫的靶點合并整理去重后，最終獲得4 361個與胃潰瘍相關的作用靶點。將辣蓼活性成分的作用靶點與胃潰瘍的作用靶點進行匹配映射取交集，最終獲得152個共同作用靶點，提示辣蓼可能通過這152個共同靶點發(fā)揮治療胃潰瘍的作用。見圖1。

圖1 辣蓼與胃潰瘍的韋恩圖

2.3 PPI 辣蓼和胃潰瘍交集靶點構建的PPI網絡中，共有143個節(jié)點和1 009條邊；其中，節(jié)點表示靶點，邊表示靶點之間的相互作用關系。在蛋白互作網絡圖中，以大于degree值中位數2倍以上即degree＞22的靶點作為關鍵靶點，degree表示靶點與其他靶點連接的線的數目，degree越大，則節(jié)點越大且顏色越深，說明該靶點在網絡圖中越重要。經拓撲分析可知，辣蓼治療胃潰瘍的關鍵靶點共有Akt1、TNF、TP53、IL-6、白細胞介素-1β（IL-1β）、EGFR、CASP3、RELA、VEGFA、MAPK1等29個。見圖2。

圖2 辣蓼與胃潰瘍共同靶點的PPI網絡

2.4 GO功能富集分析 借助DAVID數據庫對共同靶點進行GO功能富集分析，根據P＜0.01，共篩選得到472個GO條目。其中，共同靶點在生物過程（BP）富集了363個GO條目，主要涉及膠質細胞凋亡過程、RNA聚合酶Ⅱ啟動子對缺氧反應的正調控、對L-抗壞血酸的反應、DNA片段凋亡的正調控等過程；與細胞組成（CC）相關的條目有36個，主要涉及血小板α粒腔、膜筏、小窩、突觸前膜的組成部分等方面；與分子功能（MF）相關的條目有73個，主要涉及G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、雌激素2-羥化酶活性、一氧化氮合酶調節(jié)活性、藥物結合等方面。詳見圖3。

圖3 辣蓼治療胃潰瘍的GO功能富集圖

2.5 KEGG通路富集分析 采用DAVID數據庫對共同靶點進行分析，并得到共同靶點參與的通路有147條，以顯著富集即generation從大到小進行排序并選取前25條繪制氣泡圖，詳見圖4。通過查閱文獻及分析圖4可知，PI3K/Akt、低氧誘導因子-1（HIF-1）、TNF、白細胞介素-17（IL-17）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species等通路與胃潰瘍密切相關［10-14］，提示辣蓼有可能通過調控這幾個通路來治療胃潰瘍。

圖4 辣蓼治療胃潰瘍的KEGG通路富集分析

2.6 中藥調控網絡分析 基于“2.5”項下與胃潰瘍最相關的6條通路構建“活性成分-靶點-通路”網絡，見圖5。圖中藍色表示活性成分，綠色表示通路，粉色表示靶點；圖中共有91個節(jié)點（包括9個成分，6個通路，76個靶點）和310條邊；度值越大，節(jié)點就越大，表明該成分、靶點或者通路在治療胃潰瘍中就越重要。圖中顯示，槲皮素、蘆丁、黃芩苷等度值排名靠前，可知這些成分有可能是治療胃潰瘍的主要活性成分；RELA、MAPK1、EGFR、IL-6、TNF、IL-6、IL-1β等靶點連接較多的活性成分和通路且與PPI網絡分析得出的核心靶點幾乎一致。由此可知，辣蓼的活性成分可能通過這些關鍵靶點來調控PI3K/Akt、HIF-1、TNF、IL-17、MAPK、Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species等通路達到治療胃潰瘍的效果。

圖5 “成分-靶點-通路”網絡

3 討 論

本研究經過TCMSP數據庫篩選得到16種活性成分，度值排名靠前的包括蘆丁、槲皮素、黃芩苷等。研究表明，槲皮素通過降低胃黏膜細胞中活性氧的表達，進而減少胃黏膜細胞損傷［15］。蘆丁據報道可減輕乙酸燒灼造成的大鼠胃潰瘍組織損傷［8］。羅桂香等［16］證實黃芩苷通過抑制血清中TNF-α的表達，降低胃黏膜炎癥反應，從而發(fā)揮保護作用。由成分-靶點-通路圖篩選出槲皮素、蘆丁、黃芩苷等是辣蓼治療胃潰瘍的關鍵成分，與上述文獻報道基本一致。

在KEGG富集分析中，與辣蓼治療胃潰瘍最相關的通路有PI3K/Akt、HIF-1、TNF、IL-17、MAPK、Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species等通路。PI3K/Akt信號通路是細胞內重要的信號轉導途徑，主要參與細胞增殖、分化，抑制細胞凋亡等方面。被上游通路激活后的PI3K將PIP2磷酸化為PIP3，促使PDK1與Akt結合并使其活化，活化后的Akt一方面通過對下游靶蛋白BAD磷酸化，使其與Bcl-2或Bcl-XL解離，從而保持Bcl-2或Bcl-XL抑制細胞凋亡的作用；另一方面，活化的Akt通過磷酸化P21/waf1/cip1蛋白加速細胞從G1期進入S期進行細胞增殖；激活的PI3K/Akt信號通路通過促進細胞增殖，抑制細胞凋亡以達到修復胃黏膜損傷的作用［10］。TNF和IL-17信號通路均與炎癥反應有關，TNF-α是炎癥反應的主要調節(jié)因子，主要參與炎癥反應和免疫性疾病，TNF-α與其受體結合，觸發(fā)一系列炎癥因子的釋放，如IL-17、IL-8、IL-1β等，炎性細胞因子對胃黏膜的浸潤，導致胃潰瘍的形成及難以愈合且反復發(fā)作［17］。MAPK信號通路主要由4個部分組成：細胞外信號調節(jié)激酶、p38絲裂原活化蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、細胞外信號調節(jié)激酶5。其中，p38MAPK被炎癥因子、紫外線輻射、缺氧等誘導因素激活后，會促使各種促炎因子如TNF-α、IL-1的表達［18］。有研究表明，頭花蓼可通過抑制p38MAPK信號通路的磷酸化，阻斷其重要靶點，進而達到抗幽門螺桿菌胃炎的作用［14］。活性氧是細胞代謝的產物，其濃度高低決定了細胞內部的氧化-抗氧化環(huán)境是否有利于細胞正常的生命活動。有研究表明，炎癥有益于活性氧和氮物質的持續(xù)產生進而形成致瘤性微環(huán)境，使細胞異常增殖［19］。此外，活性氧還可通過低價金屬離子的介導，使DNA的結構和完整性遭到破壞，異常基因的持續(xù)積累并最終導致癌變［20］。Dahee Yeo等［21］研究證實，毛蒿水提物通過抑制促炎因子的產生和維持細胞內氧化-抗氧化環(huán)境的動態(tài)平衡，從而對HCl/乙醇誘導的胃損傷產生胃保護作用。

本研究通過網絡藥理學的方法篩選出辣蓼治療胃潰瘍的16種活性成分，經過蛋白互作網絡和成分-靶點-通路網絡可知，活性成分作用于多個靶點對多個通路起調控作用以達到治療胃潰瘍的目的。但由于數據庫資源的不完整性，使得預測結果具有一定的局限性，因此，后期將會通過實驗驗證辣蓼治療胃潰瘍的作用機制。