基于鐵死亡理論的骨質疏松癥發病機制的探討*

畢煦昆 趙建棟 郭成龍

1 甘肅中醫藥大學,甘肅省蘭州市 730000; 2 甘肅中醫藥大學附屬醫院

細胞死亡曾經被分為兩個類別:調節性細胞死亡和意外細胞死亡,在正常的生存條件下,調節性細胞死亡也被稱為程序性細胞死亡(Programmed cell death,PCD),它包括凋亡、壞死、自噬等途徑,并涵蓋多種信號級聯反應[1]。近些年來人們發現了一種新型的調節性細胞死亡方式,并命名為鐵死亡(Ferroptosis) ,它是一種由鐵離子介導的引起鐵依賴性活性氧類(Reactive oxygen species,ROS)的累積,損耗細胞膜聯蛋白,引起細胞死亡的過程。而細胞鐵死亡的過程中往往伴隨鐵超載伴隨ROS 的大量堆積,導致骨量的大量流失,骨的微觀形態的改變。骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種與骨代謝平衡失衡密切相關的代謝性骨科疾患,其主要特征表現在骨量的下降、骨穩態的失衡、骨結構疏松、脆性增加等,其病因包括性別、年齡、遺傳、營養狀況、細胞因子及激素水平異常等[2]。 本文初步通過鐵死亡理論探討骨質疏松的發病機制,旨在為未來骨質疏松癥的藥物研發及診治提供一定的思路和方法。

1 鐵死亡理論摘要

1.1 鐵死亡概念 鐵死亡是一種鐵依賴性的細胞程序性死亡方式,該方式區別于細胞壞死、細胞凋亡、細胞自噬[3]。在闡明鐵死亡的具體機制和相關信號通路之前,曾有部分研究者已經在實驗中發現了該細胞死亡方式,但未予以重視,或將其歸結于其他細胞凋亡方式。2003年,Dolma等[4]在研究殺死腫瘤細胞的藥物過程中發現了可以殺死RAS致癌蛋白及 small T 轉染的細胞的小分子化合物,并命名為伊拉斯汀(erastin),而erastin在整個細胞的凋亡過程中并未激活和裂解半胱氨酸蛋白酶(Caspase),也沒有導致細胞核及染色質的改變,所以進一步推測可能是一種新型的細胞凋亡方式。后續有許多研究者包括Yang等[5]均在類似實驗過程中發現這一小分子化合物erastin,這一化合物可以通過抑制胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白系統(Cystine/glutamate antiporter,system Xc-)來誘導某種鐵依賴型的細胞死亡,具體的機制是該系統能減少胱氨酸依賴的還原型谷胱甘肽(GSH)的合成,破壞細胞氧化還原穩態,引起大量過氧化物的累積,從而導致細胞死亡,并證明了 erastin 抑制會胱氨酸的吸收。2012年, Dixon等[6]證明,基于致癌蛋白ras選擇性致死小分子erastin介導所引發了一種非細胞壞死凋亡,這種凋亡機制十分獨特并且依賴于細胞內的鐵,而非其他化合物,在生物化學和遺傳學上與細胞凋亡、壞死和自噬不同,并在對腫瘤細胞凋亡的研究中發現了鐵死亡抑制劑 (Ferrostatin-1),并將該機制命名為鐵死亡。

1.2 鐵死亡的基本特征 鐵死亡的生物學特征是通過影響胱氨酸吸收、減少谷胱甘肽合成、產生花生四烯酸等其他分子來抑制胱氨酸谷氨酸轉運受體(System XC-系統)和谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的活性從而導致脂質過氧化物的大量蓄積,誘導細胞死亡[7]。鐵死亡的形態學特征:細胞鐵死亡主要表現為細胞變小、變圓、細胞間分離;細胞膜的皺縮、細胞脂膜的起泡;線粒體皺縮、線粒體嵴的消退、線粒體外膜破裂及線粒體膜密度增高等[8]。鐵死亡的分子生物學特征:鐵死亡是一種普遍的、動態的細胞死亡形式,Gpx4有望產生實質性的細胞保護作用。GPX4酶在脂質過氧化中起到了十分重要的作用,主要體現在它可以使過氧化物的過氧化鍵還原為氫鍵,使過氧化物的活性喪失。GPX4酶的活性主要體現靶點有:System Xc-體系(負責將GSH的合成原料半胱氨酸轉運至胞內的體系)、谷氨酸—半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽s-轉移酶、ND脫氫酶、(半胱氨酸)消耗等[9]。

1.3 鐵死亡機制

1.3.1 GSH消耗導致的GPX4失活:GPX4可以保護細胞膜免受脂質過氧化物的破壞。在 Ras 選擇性致死化合物3(Ras-selective lethal compound 3,RSL3)誘導細胞鐵死亡的過程中,RSL3與谷胱甘肽(Glutathione,GSH)依賴性酶—谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione per-oxidase,GPX)4的靶點相互結合,激活GPX4并催化 GSH 依賴的高反應性脂質氫過氧化物還原為非反應性脂質醇,削弱脂質過氧化的能力,保護細胞免受膜脂質過氧化作用[10]。那么由于各種理化原因導致的GSH消耗就會引起GPX4的失活,從而誘導鐵死亡。

1.3.2 鐵離子的攝入與還原:Ferroptosis 是鐵離子誘導的細胞死亡,向細胞中輸入大量的Fe2+,并且保證鐵離子不被氧化,通過芬頓(Fenton)反應Fe2+可啟動脂質體過氧化,有研究發現鐵螯合劑DFO、CPX 等會減少鐵死亡形式的發生率[11]。有關鐵螯合劑的研究發現,其主要作用機制可能與含鐵的酶活性有關,因為許多酶以鐵離子為分子基礎,如果細胞攝入的鐵離子不能盡快與相關配體或者受體相結合,就會介導fenton反應生成有代謝毒性的ROS大分子化合物,攻擊細胞膜,從而使得細胞破裂死亡。然而,Fe2+不僅會通過氧化還原反應引起細胞鐵死亡,它還會引起其他類型的細胞死亡,如細胞凋亡、壞死、自噬等[12]。

2 鐵死亡相關信號通路

2.1 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)4 信號通路 在Che-Lin Hu等[13]的研究中發現:GSH和GPx4一起有效地減少了有毒的氫過氧化物的含量,而過氧化物(ROS)的大量堆積正是引起鐵死亡的原因。抗腫瘤藥物 erastin 誘導細胞鐵死亡與 GSH-Px4 也存在一定關系,研究表明 erastin的主要作用機制在于抑制 SystemXc-,阻礙機體 GSH 的合成,間接影響GSH-Px4的活性,導致細胞鐵死亡。谷胱甘肽過氧化物酶通路進一步受到SystemXc-的調控,它是由SLC7A11和SLC3A2的異二聚體組成的氨基酸反轉運蛋白,對GSH合成至關重要。可以直接使用抑制SystemXc-功能的化合物伊拉斯汀(erastin),誘導鐵死亡。

2.2 p53/SAT1/ALOX15信號通路 已知調控 p53 基因可誘導內皮細胞和腫瘤細胞的ferroptosis進程,通過抑制p53基因可以使GSH和GPx4發揮生物學活性,抑制ROS的累積,從而保護細胞生存。p53調節多種細胞功能,如代謝調節、活性氧(ROS)應激反應和鐵鉤反應,這些新出現的功能現在被認為在p53介導的腫瘤抑制中發揮關鍵作用。在Jiang L等[14]的研究當中發現SAT1是p53代謝靶基因,可以被內源性和外源性p53誘導;SAT1參與調節p53介導的ROS反應和鐵死亡,關于鐵細胞凋亡是如何被調控的,p53的其他靶點在ROS誘導的鐵細胞凋亡中起著什么樣的作用,目前還不得而知。因此對于p53基因及其相關信號通路的研究有助于進一步闡明有關鐵死亡的機制,有望為臨床診治骨質疏松癥提供新的思路和方法。

3 骨質疏松癥與骨穩態

骨骼的生長發育與新陳代謝維持在一個動態的水平中,與機械刺激以及激素波動密切相關。在生物體內骨組織通過骨髓間質細胞、骨細胞、成骨細胞之間的協同作用,共同發揮調節骨穩態的作用;骨重塑在微骨折的修復、骨的生物力學的穩定性以及抵抗機械損傷和維持骨量方面都有極其重要的意義[15]。人類骨髓間充質干細胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)是具有多向分化潛能的組織干細胞,可分化為骨、脂肪、心肌等細胞,并在多種疾病的治療中發揮作用[16]。各種理化因素的作用或者暴力的刺激,使得骨髓間質細胞向成骨細胞的轉化減少,骨細胞數量下降,骨質變得疏松,骨穩態受到破壞,從而引起骨質疏松。近些年以來骨質疏松的患病率大幅增加,成為人類面臨的一大疾病[17]。

4 鐵死亡與骨質疏松

骨質疏松癥(OP)是由于多種原因導致的以骨密度及骨強度的下降、骨微觀結構的破壞、脆性增加,容易引起骨折及并發疼痛為特征的全身骨骼系統疾病[18],目前有一些研究證明,細胞內的大量Fe2+的蓄積會導致芬頓反應的發生,介導ROS的大量蓄積,使得鐵依賴的細胞膜發生過氧化反應而破裂導致細胞死亡[19]。骨質疏松的機制關鍵在于骨穩態的失衡,OP的發病原因還與機體代謝異常、基因多態性、微循環障礙等因素密切相關。而鐵死亡的特點是細胞死亡需要(脂質過氧化物)ROS積累,鐵過載以及MEK活性是脂質過氧化物生成的條件。

4.1 ROS的累積 在骨質疏松癥的發病過程中,涉及了成骨細胞及破骨細胞的鐵死亡進程,其中包含大量脂質過氧化物(ROS)累積。ROS主要來源于線粒體,是正常細胞內線粒體通過電子轉移的方式代謝產生的副產物,主要包括羥基、過氧化氫等。正常情況下,機體可以通過抗氧化酶(如 GSH、GPX)清除ROS以維持體內過氧化物的平衡,但同時Fe2+也會促使大量的ROS形成,即Fe2+通過芬頓(Fenton)反應誘導ROS 形成[20]。形成的過量ROS 會破壞細胞膜穩定性,使細胞膜破裂導致細胞死亡。

4.2 鐵超載 鐵離子是體內最常見的微量元素之一,對維持人體正常生理活動有著重要的意義,機體內存在著鐵穩態,即鐵離子不斷被吸收、利用、儲存、循環,并處于一個動態平衡的狀態,這對于維持細胞的正常新陳代謝至關重要。鐵在人體內發揮極其重要的生物學功能,是生物體必需的元素,它參與了DNA及RNA的修復、維持細胞生長和增殖、細胞分化、細胞休眠與恢復等生命代謝活動,但是鐵超載也會危害人體的細胞和組織。有研究表明,鐵超載可以刺激成骨細胞的自噬與凋亡,其具體機制可能與二價金屬離子轉運體1有關[21]。在有關鐵超載抑制成骨細胞增殖的研究中發現,高鐵刺激可以通過激活成骨細胞ASK1-p38信號通抑制成骨細胞的功能,誘導其鐵死亡,該機制可能與ASK1抑制硫氧還蛋白的構象轉變有關[22-23]。因此,適量鐵的攝取可以促進細胞的增殖,但鐵超載會抑制細胞的生長發育和分裂,甚至誘導細胞凋亡。

4.3 酶促脂質過氧化 鐵死亡發生的另一條主要途徑是酶促脂質過氧化,在這一過程中起著至關重要的作用的是脂氧合酶,它能誘導多不飽和脂肪酸脫氫生成磷脂氫過氧化物;而在 Fe2+的催化作用下,磷脂氫過氧化物會分解成烷氧基自由基 (RO-),從而攻擊其他多聚不飽和脂肪酸引發脂質過氧化的連鎖效應。另一方面,磷脂氫過氧化物在相關酶的催化下會分解成4-羥基壬烯醛和丙二醛,這幾種小分子化合物會通過交聯反應破壞膜蛋白的穩定性,增加細胞膜的通透性,誘導細胞鐵死亡[24]。在Sokoya T等[25]人的研究中,發現一種鞘磷脂合酶SMS2通過破壞跨雙層鞘磷脂不對稱性,導致成骨細胞無法維持非隨機脂質分布的能力,引發了細胞鐵死亡。可見,在引發骨細胞鐵凋亡的進程中,相關脂代謝的酶也起著十分重要的作用

5 問題與展望

鐵死亡是近年來才發現的一種新型細胞死亡方式,目前針對鐵死亡的機制尚未完全闡明,有關ROS累積導致膜蛋白轉運抑制的相關信號通路還未研究明確,鐵超載對于細胞的毒性以及相關酶活性的分子機制仍有待進一步研究。基于鐵死亡理論探討骨質疏松的發病機制主要集中于ROS的累積、鐵離子的超載及酶促脂質過氧化反應,但具體不同細胞之間的鐵代謝和信號通路之間是否存在差異仍不明確。對于相關鐵死亡的基因研究,明確了部分的凋亡機制,隨著科技的發展以及相關理論的不斷完善,對于鐵死亡機制以及相關基因靶點的發掘,會對未來骨質疏松癥的診治和抗骨質疏松癥藥物的研發有著更為深入的指導意義。