腫瘤標(biāo)志物用于肺癌早期診斷的研究進(jìn)展

樊 煒 馬 玲 閆文慧 張漢東 徐秀花 燕 云

山西省大同市第二人民醫(yī)院腫瘤醫(yī)院 1 檢驗(yàn)科 2 病理科 037000

肺癌是當(dāng)前威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一,患者的5年生存率低于20%,因此需要迫切找到肺癌早期篩查的診斷標(biāo)志物以提高整體生存率。近年,肺癌早期診斷的新技術(shù)不斷涌現(xiàn),為肺癌的早發(fā)現(xiàn)創(chuàng)造了條件。本文對早期肺癌的診斷標(biāo)志物研究進(jìn)展進(jìn)行了文獻(xiàn)綜述。

1 血清腫瘤標(biāo)志物

血清腫瘤標(biāo)志物指特征性存在于惡性腫瘤細(xì)胞,或由惡性腫瘤細(xì)胞異常產(chǎn)生的物質(zhì),或是宿主對腫瘤的刺激反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì),并能反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展,監(jiān)測腫瘤對治療反應(yīng)的一類物質(zhì),存在于腫瘤患者的組織、體液和排泄物中,能用免疫學(xué)、生物學(xué)及化學(xué)的方法檢測到。盡管從目前來看,傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物在診斷肺癌的敏感性和特異性較低,但一直作為肺癌篩查的輔助手段廣泛的存在。

2 其他蛋白類腫瘤標(biāo)志物

2.1 腫瘤相關(guān)自身抗體 腫瘤相關(guān)自身抗體的產(chǎn)生主要是由于腫瘤自身抗原通過過表達(dá)、突變、折疊錯誤、不適當(dāng)降解、異常表達(dá)、翻譯后修飾改變、異位表達(dá)引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生。尤其在癌癥發(fā)生的早期,血清中自身抗體的表達(dá)量高,以及由于抗原—抗體反應(yīng)的高特異性及敏感性,便于腫瘤的早期診斷。第20屆世界肺癌大會(World Conference on Lung Cancer)[1]介紹了一項(xiàng)研究成果:肺癌自身抗體聯(lián)合CT掃描能提高診斷率并降低肺癌病死率。臨床目前應(yīng)用于肺癌相關(guān)自身抗體的常見篩查組合為Sox2、PGP9.5、MAGE-A1、CAGE、GAGE7、GBU4-5、P537種抗原誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體組合。Huang等[2]通過上述7種自身抗體評估診斷效果,發(fā)現(xiàn)7種自身抗體在肺鱗癌患者中具有更好的診斷價值,且7種自身抗體的組合較單一自身抗體在早期肺癌中的檢測更可靠。

2.2 熱休克蛋白 熱休克蛋白(Heat shock proteins)是在細(xì)胞中廣泛表達(dá)的分子伴侶的成員,在蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Hsp90是一種進(jìn)化上保守的分子伴侶,在各種應(yīng)激相關(guān)蛋白中最常見,包括誘導(dǎo)型Hsp90α和組成型Hsp90β兩個亞型。據(jù)報道,與正常健康對照組相比,肺癌患者血漿中Hsp90α水平較高,且表達(dá)水平與癌癥的分型、分期相關(guān)[3-4]。

2.3 胸苷激酶 胸苷激酶(TK)催化脫氧胸苷在三磷酸腺苷(ATP)存在下轉(zhuǎn)化為單磷酸胸苷(TMP),是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物。TK有兩種同工酶:細(xì)胞質(zhì)中的TK1依賴細(xì)胞周期,線粒體中的TK2不依賴細(xì)胞周期。TK1的濃度和活性在細(xì)胞周期的G1期晚期增加,在S期晚期/G2期早期達(dá)到峰值,在有絲分裂期水平趨于下降。TK1作為多種惡性腫瘤的“通用”標(biāo)記物,在肺腺癌患者中過表達(dá),從而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移,TK1在肺腺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄過度表達(dá)部分是由MAP激酶途徑以轉(zhuǎn)錄因子MAZ依賴的方式驅(qū)動的[5]。TK1作為一種單一的診斷增殖性腫瘤生物標(biāo)記物,并非疾病的重要指標(biāo),因此建議將其與其他腫瘤標(biāo)記物結(jié)合使用。TK1聯(lián)合CEA、CYFRA21-1和NSE對肺癌的診斷價值顯著高于單獨(dú)使用各生物標(biāo)志物, 且TK1濃度與TNM分期顯著相關(guān)[6]。

3 循環(huán)核酸

3.1 循環(huán)腫瘤DNA 循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)是指進(jìn)入血液循環(huán)中壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的DNA,隨著腫瘤負(fù)荷的增加而升高,是一種特征性的腫瘤生物標(biāo)記物。1977年Leon等[7]發(fā)現(xiàn),腫瘤患者的血漿游離DNA水平要明顯高于健康人群。1994年Sorenson等[8]從胰腺癌患者的血液中檢測到KRAS基因突變,并且血液中檢測到的突變與腫瘤組織中的突變相一致,證實(shí)血液中的突變基來源于腫瘤,由此發(fā)現(xiàn)了ctDNA可以作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物。近來研究發(fā)現(xiàn),通過定性和定量分析ctDNA突變等信息,能夠反映腫瘤的遺傳改變以及腫瘤負(fù)荷,監(jiān)測血液微小腫瘤病灶[9-10]。

3.2 DNA甲基化 DNA甲基化是表觀遺傳修飾機(jī)制之一,對基因表達(dá)具有重要影響。異常的甲基化會使DNA的轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生異常,進(jìn)而與腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。因此,對DNA甲基化進(jìn)行檢測,可為早期肺癌的診斷提供重要幫助。目前研究表明,雙基因或多基因甲基化聯(lián)合檢測比單基因甲基化檢測具有更高的敏感性和特異性。2020年世界肺癌大會發(fā)表的一項(xiàng)肺癌早篩的研究結(jié)果[11]顯示:基于血液的非侵入性ctDNA甲基化檢測可以早期檢測和鑒別肺癌,且具有很高的敏感性和特異性。研究者從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)項(xiàng)目中挖掘了人類甲基化450K芯片的可用數(shù)據(jù)用于最初生物標(biāo)志物的篩選,最終構(gòu)建了10-甲基化標(biāo)志物模型,它的總體敏感性為73%,特異性為90%,顯示了基于血液檢測的早期肺癌篩查的潛力,而且該研究也證實(shí)了對肺癌分型具有良好的準(zhǔn)確性。

3.3 微核糖核酸 微核糖核酸(MicroRNA,miRNA) 是一組由內(nèi)源基因編碼的長度為20～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。它是一種分布廣泛的小調(diào)控RNA基因。目前,多種miRNA被證實(shí)可以作為肺癌診斷的潛在分子標(biāo)記物。Li等[12]報道,血清miR-25在NSCLC患者中顯著升高,且與NSCLC分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Zhao等報道[13],血清miR-205-5p是一種新的、有價值的肺癌診斷生物標(biāo)志物, 通過負(fù)性調(diào)節(jié)新靶點(diǎn)TP53INP1促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,進(jìn)而影響P21、RB1和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。Yang等[14]報道,血清miR-146b、miR-205、miR-29c、miR-30b和miR-337在NSCLC患者中顯著上調(diào),且多個miRNAs聯(lián)合檢測的敏感度和特異度均高于單一miRNA檢測,對早期肺癌的檢測準(zhǔn)確率更高。

3.4 長鏈非編碼RNA 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200bp的核糖核酸,其長度在200～1 000 000bp不等,定位于細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞基質(zhì)內(nèi),在真核細(xì)胞內(nèi)被普遍轉(zhuǎn)錄,但不具有或很少具有蛋白編碼功能。目前,多種lncRNA被證實(shí)可以作為肺癌診斷的潛在分子標(biāo)記物。與其他基于血液的腫瘤標(biāo)記物類似,lncRNA在肺癌診斷中的敏感性和特異性有待提高,現(xiàn)在多選用多個分子標(biāo)記物聯(lián)合檢測,以提高診斷性能。例如,GAS5和SOX2OT作為2種lncRNA應(yīng)用于NSCLC患者的診斷,GAS5在NSCLC患者表達(dá)下調(diào),而SOX2OT表達(dá)顯著上升,兩者聯(lián)合檢測的敏感度和特異度均高于單個lncRNA檢測,對早期肺癌的檢測準(zhǔn)確率更高[15]。

3.5 核酸適配體 指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponentail enrichment,SELEX),是指應(yīng)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸庫,并結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)體外擴(kuò)增技術(shù),經(jīng)過幾輪或數(shù)十輪的篩選而獲得的核酸適配體。核酸適配體具有高親和力、易修飾、低成本、易于合成和低免疫原性等優(yōu)勢,可以針對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、組織、生長因子進(jìn)行癌癥生物標(biāo)志物的研究[16]。Vidic等[17]使用A549細(xì)胞作為陽性靶細(xì)胞,經(jīng)7個SELEX周期后,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析和分選,從中選出了能與CD90陽性表達(dá)的A549細(xì)胞結(jié)合的適配子(CD90為已報道的干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)記物),該研究為檢測有腫瘤干細(xì)胞樣特征的循環(huán)肺癌細(xì)胞提供了一種新的技術(shù)手段。除了在上述細(xì)胞系中的應(yīng)用外,該技術(shù)已運(yùn)用于臨床實(shí)際中,Zamay 等[18]將過度表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的原發(fā)性肺癌細(xì)胞作為靶點(diǎn),利用抗體競爭性置換的方法,即高濃度的EpCAM特異性抗體替換與靶細(xì)胞結(jié)合的適配體,得到與靶細(xì)胞有良好親和力的適配體,所得到的適配體已成功應(yīng)用于肺癌患者外周血臨床樣本中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離和檢測。

4 循環(huán)腫瘤細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cell,CTC)最初是由澳大利亞籍的醫(yī)生在1869年提出,是指原發(fā)腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞脫落后進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞,存在于腫瘤的各個時期。一項(xiàng)前瞻性研究[19],通過ISET過濾富集技術(shù)檢測168名慢性阻塞性肺氣腫患者血液中的CTCs,并對CTC陽性的患者(共5名)進(jìn)行CT掃描并跟蹤隨訪1～4年,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這5名CTC陽性的患者確定有肺結(jié)節(jié),隨后行手術(shù)切除、病理檢查確診為早期肺癌,提示CTC可以用作肺癌早期篩查的潛在生物標(biāo)記物。由于CTC在血液中罕見,因此該項(xiàng)檢測首先面臨的問題就是CTC的富集分離。隨著CTC分離技術(shù)的逐步優(yōu)化成熟,CTC攜帶的信息可以從多個層面進(jìn)行研究:CTC是否存在、CTC計數(shù)、形態(tài)和免疫細(xì)胞化學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析[20]。

5 肺癌遺傳易感性

肺癌的發(fā)生與遺傳因素存在一定的相關(guān)性,遺傳多態(tài)性促成了肺癌易感的差異性。遺傳多態(tài)性主要涉及基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)造成的高頻低外顯突變和關(guān)鍵基因突變引起的低頻高外顯突變[21]。

SNP主要指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在,平均每300個堿基對中就有1個,估計其總數(shù)可達(dá)300萬個甚至更多。SNP基因發(fā)生頻率較高,但是對肺癌遺傳易感風(fēng)險的影響相對較小。如錯配切除修復(fù)基因(Excision repair cross-complementing, ERCC)1/2是與肺癌遺傳易感性有關(guān)的常見基因。有研究發(fā)現(xiàn)[22],ERCC1基因C8092A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與肺癌遺傳易感性有關(guān),與CC基因型相比,CA基因型人群患肺癌的風(fēng)險較低。

關(guān)鍵基因突變引起的低頻高外顯突變,其等位基因在群體中變異頻率<1%,與家族遺傳性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示[23],肺癌中腫瘤抑制基因CDKN2A的 p.Arg112dup突變攜帶者預(yù)期相對危險度(Relative risk, RR)為15.6,其一級親屬RR 為9,二級親屬為2.8。可見,低頻高外顯基因突變對肺癌遺傳易感性的影響遠(yuǎn)大于高頻低外顯基因變異。

基于對肺癌遺傳易感性的深入研究,使得對于肺癌的篩查由已發(fā)生肺癌的早期監(jiān)測提前到肺癌可能發(fā)生的預(yù)測,尤其對于家族性肺癌易感基因突變者,建議其直系親屬進(jìn)行相關(guān)基因的監(jiān)測,方便后續(xù)的干預(yù),降低直系親屬的肺癌死亡風(fēng)險。

6 展望

由于肺癌患者發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期,盡管隨著治療方法的不斷改進(jìn),但5年生存率仍較低。因此,如何早期發(fā)現(xiàn)肺癌,一直是肺癌研究的重中之重。肺癌從發(fā)生、發(fā)展到死亡是長期演變的過程,這為肺癌的早期發(fā)現(xiàn)提供了機(jī)會。科學(xué)家一直致力于腫瘤標(biāo)記物的研究,從分子、蛋白、細(xì)胞等多水平拓展著腫瘤標(biāo)志物的研究范圍,但目前還未發(fā)現(xiàn)相關(guān)腫瘤標(biāo)志物能獨(dú)立完成早期肺癌的篩查,隨著研究的不斷深入與發(fā)展,還會出現(xiàn)更多的新的評價指標(biāo),通過多指標(biāo)的聯(lián)合檢測,配合其他診斷技術(shù)仍然是早期肺癌篩查的重要研究手段。

進(jìn)一步,科學(xué)家已經(jīng)開始從個體、群體的遺傳背景上發(fā)現(xiàn)肺癌的遺傳易感基因,使得肺癌從發(fā)現(xiàn)向肺癌發(fā)生的可能性預(yù)測前進(jìn)了一步,隨著基因組技術(shù)的進(jìn)步,全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genomewide association study, GWAS)的開展,更多的易感區(qū)域及易感位點(diǎn)將被發(fā)現(xiàn),這將為肺癌的發(fā)生提供更全面、更精準(zhǔn)的預(yù)測。