采前噴施胺鮮酯對采后‘巨峰’葡萄果實品質和活性氧代謝的影響

余 鵬，孟祥軒，余義和，楊英軍

（河南科技大學園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471023）

葡萄（Vitis viniferaL.）果實汁多味美，含有大量對人體有益物質，具有較高的營養和藥用價值[1]。隨著人們對水果保健功能的逐漸重視，對葡萄的需求量也日益增加。然而葡萄果實采后活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝旺盛，極易在貯藏期間發生腐爛變質，嚴重影響葡萄的營養和商業價值。據統計，我國每年葡萄在貯藏期的損失量高達葡萄總產量的27%以上，造成巨大的經濟損失[2]。

目前，應用在葡萄上的保鮮方法主要有低溫、高壓靜電處理、熱處理、輻照等物理保鮮方法，具有操作簡單方便等優點，但其投入成本和技術設備要求高，無法大面積推廣；生物保鮮包括涂膜和天然提取物保鮮等方法，此方法雖然有一定的保鮮效果，但具有處理后果實品質不穩定、成本高等缺點；化學保鮮包括臭氧、二氧化氯、二氧化硫、1-甲基環丙烯等處理方法，化學保鮮效果不錯，但完全無毒、經濟實用且廣譜抑菌的理想防腐保鮮劑尚未發現；氣調貯藏的保鮮效果較好，但成本和維護費用高，只適用于大型企業，適用面小[3-4]。因此，有必要對葡萄的新型保鮮技術進行深入研究。

ROS是‘巨峰’葡萄（Vitis viniferaL.hVitis labruscaL.‘Kyoho’）有氧代謝過程中產生的一類氧化能力強、化學性質較活潑的含氧物質，包括g、丙二醛（missile defense agency，MDA）等，主要在線粒體內產生，是植物在有氧代謝過程中電子傳遞至氧分子時產生的活躍并具毒害作用的含氧物質的總稱[5]。ROS清除酶和內源抗氧化物質共同組成ROS清除系統。ROS清除酶主要有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽還原酶（gluathione reductase，GR）等；內源抗氧化物質有還原型抗壞血酸（reduced ascorbic acid，AsA）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）[6-8]。正常情況下，通過及時清除葡萄內產生的ROS，使ROS的產生與清除處于平衡，從而保證果實品質；但采后葡萄體內ROS清除能力下降，ROS的產生與清除失去平衡，導致葡萄體內積累過多的ROS，加速其衰老和變質。

胺鮮酯（diethyl aminoethyl hexanoate，DA-6）是一種新型無毒的植物調節劑，化學式為C12H25NO2，可提高植物過氧化物等活性，具有容易調配、操作方便的優點，同時具有改善果實品質的功能[9-10]。已有研究發現，采前噴施DA-6可以保持龍眼果實果皮細胞膜完整性，提高采后龍眼果實的耐貯性及采后果皮的ROS清除能力[11-12]。此外，在葡萄著色初期噴施30% DA-6和乙烯利復配劑可促進葡萄著色，增加可溶性固形物和VC含量，提高果實品質[13]。目前，通過采前噴施DA-6探索其對采后‘巨峰’葡萄品質和ROS代謝影響的研究尚鮮見報道。

本研究以‘巨峰’葡萄為實驗材料，通過采前噴施不同濃度DA-6，分析了不同質量濃度DA-6對‘巨峰’葡萄果實采后品質和ROS代謝的影響，旨在為提高葡萄采后品質及貯運保鮮提供有效的技術方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘巨峰’葡萄采摘于河南科技大學葡萄試驗基地。挑選大小、顏色、成熟程度相似的葡萄果實。葡萄采收后立即送至實驗室，清水洗凈并晾干后，將葡萄于（0f 1）℃、相對濕度65%～70%條件下貯藏[14]。

氮藍四唑、甲硫氨酸、核黃素、對氨基苯磺酸二硫代硝基苯甲酸、硫代巴比妥酸、鄰菲羅啉、α-萘胺鄭州慧耕達生物科技有限公司；過氧化氫、抗壞血酸、三氯乙酸、鹽酸羥胺、三氯化鐵、乙醇、磷酸、乙二胺四乙酸、磷酸二氫鈉、石英沙、碳酸鈣 河南寶格生物技術有限公司；硫酸 北京化工廠。

1.2 儀器與設備

FHM-5果實硬度計、PAL-1型數顯糖度計 點將（上海）科技股份有限公司；PAL-ACID1數顯酸度計ATAGO（愛拓）中國分公司；VELOCITY 18R高速離心機 天美儀拓實驗室設備（上海）有限公司；UV-4802紫外分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Cubis II電子天平 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

本實驗分別使用質量濃度0（對照）、10、30、50、70 mg/L DA-6在葡萄轉色期噴施于果實表面，每種處理選取6 穗，一共30 穗。采集貯藏0、20、30、40、50、60 d的葡萄果實進行實驗。每個處理設置3 次重復。

1.3.2 品質指標的測定

在各個階段實驗前對果實稱質量并記錄，按公式（1）計算質量損失率。

果實硬度測定：使用FHM-5果實硬度計測定果實赤道線3 個點的硬度，單位為N。

總可溶性固形物（total soluble solids，TSS）質量分數測定：參照田雪婷[15]的方法，采用PAL-1型數顯糖度計測定果汁中TSS質量分數。

可滴定酸（titratable acid，TA）質量分數測定：參考陳楚英等[16]的方法，采用數顯酸度計測定TA質量分數。

1.3.3 ROS清除酶活力的測定

選取質量濃度0 mg/L DA-6處理的果實作為對照組，質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實為處理組。

酶液提取：兩個處理組中各取一顆果實，去皮、梗、籽后，液氮研磨后轉移到研缽中，加入適量磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L、pH 7.0）并在冰浴中研磨，充分混勻后定容，在4 ℃、15000hg下離心20 min，轉移上清液并用磷酸鹽緩沖液定容至20 mL，取上清液作為活性氧清除酶提取液。

參照Han Cong等[17]的方法測定SOD活力，單位為U/gmf；參照Shadmani等[18]的方法測定CAT活力，單位為U/gmf；參照曹建康等[19]的方法測定APX活力，單位為U/gmf；根據Solarbio試劑盒（BC1160）說明書測定GR活力。

1.3.4 內源抗氧化物含量測定

選取質量濃度0 mg/L DA-6處理的果實作為對照組，質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實為處理組。稱取1 g葡萄鮮果樣品，參考Arakawa等[20]的方法進行AsA含量測定，單位為nmol/gmf，計算如公式（2）所示；稱取5 g葡萄凍果樣品，參考曹建康等[19]的方法進行GSH含量測定，單位為nmol/gmf，計算如公式（3）所示。

式中：V1為樣品總體積/mL；n為A s A 物質的量/nmol；V2為吸取樣品體積/mL；m為樣品質量/g。

式中：n為GSH物質的量/nmol；V1為提取液總體積/mL；V2為吸取樣品體積/mL；m為樣品質量/g。

選取質量濃度0 mg/L DA-6處理的果實作為對照組，質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實為處理組。稱取5 g葡萄鮮果樣品，參考曹建康等[19]的方法測定·產生速率，單位為nmol/（ming gmf），計算如公式（4）所示。

式中：n為·物質的量/nmol；V1為提取液總體積/mL；V2為吸取樣品體積/mL；t為樣品反應時間/min；m為樣品質量/g。

稱取1 g葡萄鮮果樣品，參考曹建康等[19]的方法測定MDA含量，單位為μmol/gmf，計算如公式（5）所示。

式中：n為MDA物質的量/μmol；V1為樣品總體積/mL；V2為測定樣品體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.6 DPPH自由基清除率和總還原能力的測定

選取質量濃度0 mg/L DA-6處理的果實作為對照組，以質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實為處理組。參考Floegel等[21]的方法測定DPPH自由基清除率，稱取1 g葡萄鮮果樣品進行實驗，DPPH自由基清除率單位為%，計算如公式（6）所示。參考Chen Chen等[22]的方法測定總還原能力，稱取1 g葡萄鮮果樣品進行實驗，總還原能力單位為g/kg。

1.4 數據處理與分析

以上實驗均進行3 次，數據用平均值±標準差表示。利用Excel 2019軟件作圖，采用SPSS 26軟件對各組數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實品質的影響

隨著貯藏時間的延長，各個處理組的果實質量損失不斷加劇。由表1可知，在貯藏20、30 d時，質量濃度30、50、70 mg/L DA-6處理的果實質量損失率顯著低于其他處理組（P＜0.05）；貯藏40 d時，質量濃度50 mg/L DA-6處理果實的質量損失率顯著低于質量濃度0、10、70 mg/L DA-6處理果實（P＜0.05）；貯藏50、60 d時，質量濃度50 mg/L DA-6處理果實的質量損失率顯著低于其他處理組（P＜0.05）。貯藏20 d時，各處理組之間果實硬度均無顯著性變化（P＞0.05）；貯藏30 d起，質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實硬度明顯高于其他處理組。

表1 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實質量損失率、硬度、TSS、TA質量分數的影響Table 1 Effect of preharvest spray of DA-6 on mass loss percentage,hardness,total soluble solid content and titratable acidity of ‘Kyoho’grapes during postharvest storage

貯藏20、30 d時，各處理組間TSS質量分數均無顯著性差異（P＞0.05）；貯藏40 d時，質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實TSS質量分數高于其他處理，且與質量濃度0、10、30 mg/L DA-6處理組具有顯著性差異（P＜0.05）；貯藏50、60 d時，質量濃度10、30、50、70 mg/L DA-6處理的果實TSS質量分數均明顯高于對照組。在整個葡萄貯藏期間，各處理間果實TA質量分數均無顯著性差異（P＞0.05）。上述結果表明采前噴施DA-6可有效維持果實的貯藏品質，其中質量濃度50 mg/L DA-6處理效果最佳，故選擇質量濃度50 mg/L DA-6進行后續實驗。

2.2 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實抗氧化酶的影響

由圖1A可知，在貯藏期間對照組和處理組的SOD活力均呈現先升高后下降的趨勢，且貯藏30 d后對照組果實SOD活力顯著低于質量濃度50 mg/L DA-6處理果實（P＜0.05）；貯藏0～40 d，質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實SOD活力呈上升趨勢，在40 d時SOD達到最高值后開始下降。與SOD活力變化趨勢相似，CAT活力在貯藏階段同樣呈現先升高后下降的趨勢（圖1B）。其中，處理組果實CAT活力在貯藏40 d達到峰值后開始下降，對照組則從貯藏20 d開始持續下降，且始終低于處理組CAT活力。由圖1C可知，處理組與對照組葡萄的APX活力在葡萄貯藏階段大體上呈現先下降后上升的趨勢，且質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實APX活力一直高于對照組。由圖1D可知，處理組與對照組GR活力變化趨勢保持一致，均在貯藏40 d前呈上升趨勢，40 d后開始下降；貯藏30 d后質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實GR活力顯著高于對照組（P＜0.05）。結果表明，采前噴施DA-6可顯著提高采后果實SOD、CAT、APX、GR活力。

圖1 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實SOD（A）、CAT（B）、APX（C）、GR（D）活力的影響Fig.1 Effect of preharvest spray of DA-6 on activities of SOD (A),CAT (B),APX (C) and GR (D) in ‘Kyoho’ grape fruit during postharvest storage

2.3 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實AsA含量和GSH含量的影響

果實內AsA含量與GSH含量越高，代表果實遭受ROS侵害越輕，抗氧化效果越好。由圖2A可知，貯藏期間處理組和對照組的AsA含量變化趨勢一致。在貯藏前期（0～20 d），對照組和處理組的AsA含量和GSH含量無顯著性差異（P＞0.05）；貯藏30 d后，質量濃度50 mg/L DA-6處理果實的AsA含量顯著高于對照組（P＜0.05）。同樣，在貯藏30、40、60 d時，質量濃度50 mg/L DA-6處理果實的GSH含量顯著高于對照組（P＜0.05），總體保持下降趨勢（圖2B）。這表明采前噴施DA-6顯著提高了采后葡萄果實AsA含量和GSH含量。

圖2 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實AsA含量（A）和GSH含量（B）的影響Fig.2 Effect of preharvest spray of DA-6 on ASA (A) and GSH (B)contents in ‘Kyoho’ grape fruit during postharvest storage

2.4 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實g產生速率和MDA含量的影響

圖3 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實g 產生速率（A）和MDA含量（B）的影響Fig.3 Effect of preharvest spray of DA-6 on superoxide anion production rate (A) and MDA content (B) of ‘Kyoho’ grape fruits during postharvest storage

2.5 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實DPPH自由基清除率和總還原能力的影響

葡萄果實中DPPH自由基清除率和總還原能力是評估果實的抗氧化能力的重要指標，越高表明抗氧化能力越好。由圖4A可知，處理組和對照組的DPPH自由基清除率隨著貯藏時間的延長呈現持續下降的趨勢。在貯藏期前期（0～30 d），對照組和處理組之間的DPPH自由基清除率沒有顯著性差異（P＞0.05）；貯藏30 d后，質量濃度50 mg/L DA-6處理組果實DPPH自由基清除率顯著高于對照組（P＜0.05）。由圖4B可知，處理組和對照組的總還原能力變化趨勢大體一致。在貯藏20、30 d時，與對照組相比，質量濃度50 mg/L DA-6處理的果實總還原能力顯著高于對照組（P＜0.05）。結果表明，采前噴施DA-6可有效提升果實DPPH自由基清除率和總還原能力，提高果實抗氧化能力。

圖4 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實DPPH自由基清除率（A）和總還原能力（B）的影響Fig.4 Effect of preharvest spray of DA-6 on DPPH radical scavenging capacity (A) and total reducing power (B) of ‘Kyoho’ grape fruit during postharvest storage

3 討論

采后果實貯藏時間長短與果實ROS代謝相關[23]。本研究通過在‘巨峰’葡萄轉色期噴施不同質量濃度的DA-6，測定果實品質（ROS代謝強度的生理指標），探究DA-6對葡萄貯藏期品質和ROS代謝的影響。結果發現，噴施不同質量濃度DA-6均可有效提高葡萄品質，延長葡萄的貯藏期，其中質量濃度50 mg/L DA-6處理效果最佳，可明顯降低葡萄果實的質量損失率，保持果實硬度、TSS質量分數，從而提高了果實的品質；此外，通過分析與ROS代謝相關指標變化，包括SOD活力、CAT活力、APX活力、GR活力、AsA含量、GSH含量、·產生速率、MDA含量、DPPH自由基清除率和總還原能力，表明質量濃度50 mg/L DA-6處理對果實中ROS代謝產生明顯影響。

葡萄果實的耐貯性與果實品質有關，隨著貯藏時間的延長，果實內水分和營養物質也都發生了變化。在本研究中，與對照組相比，轉色期噴施DA-6的葡萄果實能夠在貯藏期保持較好的品質，其中質量濃度50 mg/L DA-6處理組果實的保鮮效果最佳（表1）。這與林毅雄等[11-12]研究結果一致，對龍眼果實采前噴施DA-6同樣可得到提高果實貯藏品質的效果，增強果實的耐貯性，不同的是質量濃度10 mg/L DA-6處理對龍眼采后保鮮效果最佳，而本研究中質量濃度50 mg/L DA-6處理對‘巨峰’葡萄采后保鮮效果最顯著。

當果實品質下降時，自由基代謝平衡系統被破壞，ROS大量積累，引起膜脂過氧化，ROS主要包括·OH、·、單線態氧（singlet oxygen，1O2）、H2O2等[24]。MDA是膜脂過氧化的最終產物，其含量直接反映了果實的品質。植物體內的抗氧化系統包含酶類和非酶類，可通過清除或轉化ROS平衡細胞體內ROS含量。SOD、CAT、APX和GR是植物體內主要的ROS清除酶，其活力與ROS清除效率成正比。SOD將·歧化為H2O2和O2，H2O2再經CAT和APX催化生成無害的H2O和O2，隨著·含量增長的減緩，MDA也隨之增長，從而延長葡萄果實的保質期。羅楊等[25]研究表明SOD、APX、CAT活力上升，加快ROS清除反應，延緩采后新鮮木耳的衰老；Sun Junzheng等[23]研究表明SOD、APX、CAT、GR等ROS清除酶活力與·和MDA含量成反比，影響果實采后品質。同樣，本研究表明采前噴施質量濃度50 mg/L DA-6顯著提高了采后‘巨峰’葡萄果實中ROS清除酶活力，遏制了ROS的積累，延緩了果實的衰老，延長了果實的貨架期。

AsA和GSH是非酶促防御系統中的重要抗氧化劑[26-27]，保障AsA-GSH循環系統的正常運作，加速H2O2分解。已有研究發現通過提高SOD、CAT、APX活力和GR活力可以促進AsA和GSH的再生，從而延緩獼猴桃果實衰老[28]。本研究中，質量濃度50 mg/L DA-6處理組的葡萄果實AsA含量和GSH含量高于對照組，維持采后果實ROS清除能力，以提高果實的耐貯性。千春錄等[29]的研究表明，較高的AsA含量和GSH含量可以有效減輕獼猴桃果實發氧化；林藝芬[30]的研究也同樣表明AsA和GSH可以及時清除龍眼果皮中積累的ROS，維持果皮細胞膜結構完整，從而抑制采后品質發生劣變。

DPPH自由基清除率和總還原能力是評估果實抗氧化能力的重要指標[31]。已有研究發現較高的DPPH自由基清除率和總還原能力能有效減少ROS的產生和積累[32]。本研究中質量濃度50 mg/L DA-6處理組的葡萄果實DPPH自由基清除率和總還原能力均高于對照組，有效緩解了膜脂過氧化，保持了葡萄果實品質，提高了葡萄果實的耐貯性。郭欣等[32]研究也同樣表明較高的DPPH自由基清除率和總還原能力可以延緩西番蓮果實衰老；Lin Yifen等[33]研究表明，較高的DPPH自由基清除率和總還原能力可以延緩果皮褐變與病害的發生。

4 結論

本研究結果表明，噴施質量濃度10、30、50、70 mg/L的DA-6處理可有效維持貯藏期‘巨峰’葡萄外觀品質，其中質量濃度50 mg/L DA-6處理效果最好；進一步研究發現，質量濃度50 mg/L DA-6處理相較于對照組顯著提升采后果實中SOD、CAT、APX、GR活力，維持果實內ROS清除能力；提高AsA含量和GSH含量，增強果實的抗氧化效果；提升DPPH自由基清除率和總還原能力，增強果實的抗氧化能力；降低·產生速率和MDA含量，控制果實的氧化速率。以此平衡‘巨峰’葡萄果實中ROS代謝，增強果實抗氧化能力，降低果實氧化速率，提高果實耐貯性，延緩果實衰老。本研究為葡萄貯藏保鮮提供了一種易操作且高效的方法。