抗菌肽BCp12保鮮膜在乳扇貯藏保鮮中的應(yīng)用

楊婷婷，楊 婧，袁子又，趙 瓊，楊 昆，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

近年來，食品安全問題引起人們的廣泛關(guān)注，其中微生物污染可能會(huì)導(dǎo)致食源性疾病，威脅人體健康，因此預(yù)防和控制食品微生物污染尤為重要。乳品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是人們的生活必需品，其中常見的致病菌有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等[1]。乳扇是云南地區(qū)的傳統(tǒng)乳制品，深受人們的喜愛，但目前乳扇主要以小型作坊和手工藝生產(chǎn)為主，易發(fā)生微生物污染，帶來食品安全問題。同時(shí)乳扇是高脂肪、高蛋白食品，貯存期短且容易因氧化變質(zhì)出現(xiàn)發(fā)酸、哈喇味及表面霉變。目前市售乳扇多以真空包裝為主，此方法對(duì)乳扇保鮮具有一定效果，如肖夢(mèng)林等[2]采用真空包裝、巴氏殺菌、涂抹保鮮劑處理乳扇，其中真空包裝的保鮮效果較好；肖蓉等[3]在制作乳扇的鮮乳中加入山梨酸鉀，并將乳扇成品真空包裝，此工藝可使乳扇保鮮期達(dá)到1 年。真空包裝雖然保鮮效果較好，但成本較高，因此，具有對(duì)人體無害、抗菌、綠色環(huán)保及延長(zhǎng)食品貨架期等優(yōu)點(diǎn)的可食性抑菌膜成為了當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]。目前，應(yīng)用最多的天然高分子材料通常是蛋白質(zhì)類、多糖類及復(fù)合類[5]。

與普通保鮮膜相比，天然保鮮膜具有可食、安全等優(yōu)點(diǎn)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。殼聚糖是僅次于纖維素的第二大可再生多糖，屬于天然可再生資源[6-7]，具有抗菌性、生物相容性和無毒性等優(yōu)點(diǎn)，可用于研制食品包裝材料[8-9]，是研究和應(yīng)用最廣泛的可食膜材料之一。此外殼聚糖常與海藻酸鈉、月桂酰精氨酸乙酯復(fù)配后用于食品（如番茄[10]、車?yán)遄覽11]等）保鮮。酪蛋白具有耐熱、可乳化、可食用等特點(diǎn)，因此其可用于制備食品包裝薄膜[12-13]。但由于酪蛋白自身的親水性及不具備抗菌性，其成膜后的性能有待提高。有研究表明，殼聚糖、酪蛋白復(fù)配使用可提高酪蛋白的溶解性及成膜性[14]。抗菌肽是高等真核生物中先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，一般含有100 個(gè)以下氨基酸殘基或有廣譜抑菌活性的小分子多肽，其有抗病毒、抗菌甚至抗癌細(xì)胞等多種活性功能[15-16]。在前期研究中，Zhao Qiong等[17]從檳榔江水牛奶酪蛋白中分離了新型抗菌肽BCp12，該肽序列為YLGYLEQLLRLK，分子質(zhì)量為1508.82 Da，具有低毒性且對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌和鼠傷寒沙門氏菌4 種食源性致病菌的生長(zhǎng)均有抑制作用。此外，李鈺芳[18]、楊昆[19]等研究也發(fā)現(xiàn)BCp12能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)。目前，將抗菌肽、殼聚糖與酪蛋白復(fù)配保鮮膜應(yīng)用于乳扇保鮮的研究鮮有報(bào)道。基于此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化BCp12/殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜制備工藝，研究其機(jī)械性能和抑菌效果，同時(shí)通過微觀結(jié)構(gòu)、分子對(duì)接考察復(fù)合膜的相容性及活性位點(diǎn)，并將其應(yīng)用于乳扇保鮮，為BCp12/殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜在食品保鮮方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)促進(jìn)抗菌肽在食品保鮮方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及病原菌

抗菌肽BCp12（純度＞95%） 安徽國(guó)平藥業(yè)有限公司合成。

金黃色葡萄球菌CICC 10384、大腸桿菌CICC 10003中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心；乳扇 云南省大理州陶記乳扇；酪蛋白酸鈉 北京索萊寶科技有限公司；殼聚糖（食品級(jí)） 河南雙騰實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-400/410色彩色差儀 深圳大略電子儀器有限公司；HD-3A水分活度測(cè)定儀 廈門市弗布斯檢測(cè)設(shè)備有限公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；FlexSEM 1000掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立高新公司；Haloes Calipe抑菌圈測(cè)量?jī)x 西班牙IUL公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜的制備

參考文獻(xiàn)[20]的方法，取3.0 g殼聚糖溶于1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%冰乙酸溶液中，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%甘油，磁力攪拌30 min后制成殼聚糖溶液。接著，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%酪蛋白酸鈉溶液磁力攪拌30 min使其溶解，然后加入殼聚糖溶液混勻并攪拌6 h得到酪蛋白/殼聚糖膜液，隨后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的BCp12溶液，于40 ℃水浴加熱攪拌6 h，然后超聲脫氣30 min，即得到BCp12/殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜液，最后將膜液流延成膜，放入烘箱烘干備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

參照1.3.1節(jié)方法制備酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜，以酪蛋白/殼聚糖比例（質(zhì)量比，下同）、甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)、干燥溫度為單因素，考察每個(gè)單因素對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能（復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率）的影響。分別按照1.3.1節(jié)方法配制20 mg/mL酪蛋白溶液和20 mg/mL殼聚糖溶液，研究不同的酪蛋白/殼聚糖比例（2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5和1∶2）、甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）、干燥溫度（45、50、55、60 ℃和65 ℃）復(fù)合膜機(jī)械性能。測(cè)定每個(gè)單因素時(shí)，其他因素固定為酪蛋白/殼聚糖比例1∶1.5，甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，干燥溫度為55 ℃。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用3因素3水平正交試驗(yàn)確定酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜的最佳工藝，酪蛋白/殼聚糖比例為A因素、甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為B因素、干燥溫度為C因素，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）和1.3.1節(jié)方法制備酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜，并考察復(fù)合膜的機(jī)械性能。

1.3.4 復(fù)合膜機(jī)械性能測(cè)定

參照文獻(xiàn)[21]和GB/T 1040.3-2006《塑料 拉伸性能的測(cè)定 第3部分：薄塑和薄片的試驗(yàn)條件》，利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定復(fù)合膜機(jī)械性能。采用厚度測(cè)量?jī)x在復(fù)合膜上取9 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行厚度測(cè)量，取平均值。抗拉強(qiáng)度按式（1）計(jì)算，斷裂伸長(zhǎng)率按式（2）的計(jì)算。

式中：F為復(fù)合膜斷裂時(shí)的最大張力/N；b為復(fù)合膜寬度/mm；d為復(fù)合膜厚度/mm。

式中：L1為復(fù)合膜斷裂時(shí)的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度/mm；L0為復(fù)合膜的初始長(zhǎng)度/mm。

1.3.5 不同質(zhì)量濃度BCp12復(fù)合膜厚度的測(cè)定

根據(jù)1.3.3節(jié)優(yōu)化后的工藝采用不同質(zhì)量濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）BCp12制備酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜，復(fù)合膜厚度使用螺旋測(cè)微器測(cè)量，每個(gè)樣品任意選取5 個(gè)點(diǎn)，結(jié)果取平均值。選取1.0 mg/mL BCp12復(fù)合膜觀察微觀形態(tài)和FT-IR分析。

1.3.6 復(fù)合膜的微觀形態(tài)觀察

將殼聚糖膜、殼聚糖/BCp12及酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜膜液的凍干粉在金屬樣品臺(tái)上干燥，真空條件下噴金30 s后，將處理好的待測(cè)樣品于掃描電子顯微鏡下觀察，加速電壓7.00 kV。

1.3.7 復(fù)合膜的傅里葉變換紅外光譜分析

取BCp12、殼聚糖/BCp12、酪蛋白/BCp12和酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合物凍干后進(jìn)行FT-IR分析，分辨率4 cm－1，掃描范圍400～4000 cm－1。

1.3.8 分子對(duì)接

使用AutoDock vina 1.1.2軟件通過分子對(duì)接法分析殼聚糖、酪蛋白和BCp12的結(jié)合方式[22]。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中下載酪蛋白、BCp12的晶體結(jié)構(gòu)，從PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載殼聚糖的3D結(jié)構(gòu)（SDF格式），用ChemBio3D Ultra 14.0軟件繪制殼聚糖、酪蛋白和BCp12的結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫處理。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中得到CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3酪蛋白4 種蛋白的X射線晶體結(jié)構(gòu)，保存為pdbqt格式。然后將酪蛋白、殼聚糖的小分子導(dǎo)入AutodockTools-1.5.6軟件包進(jìn)行加氫處理并計(jì)算晶體結(jié)構(gòu)和最低能量，其將設(shè)置成對(duì)接的相互作用位點(diǎn)，利用AutoDockTools 1.5.6軟件包生成對(duì)接輸入文件。挑選出結(jié)合能最低的復(fù)合物為最有利的結(jié)合方式，并采用Pymol 2.3.0軟件將對(duì)接結(jié)果可視化。

1.3.9 BCp12復(fù)合膜液及復(fù)合膜的抑菌實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[23]的方法，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，無菌生理鹽水稀釋至106個(gè)/mL備用。取0.15 mL菌液涂布在LB瓊脂固體培養(yǎng)基上，然后用打孔器在每個(gè)平板的打5 個(gè)孔并編號(hào)1～5，每孔加入25 μL不同溶液或膜液：在1號(hào)孔（左上角）加入20 mg/mL酪蛋白溶液，在2號(hào)孔（右上角）加入酪蛋白/殼聚糖比例1∶1.5、甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的復(fù)合膜液，在3號(hào)孔（左下角）加入1.0 mg/mL BCp12/酪蛋白/殼聚糖膜液，在4號(hào)孔（右下角）加入20 mg/mL殼聚糖溶液，在5號(hào)孔（中心）加入無菌去離子水，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察不同膜液或溶液的抑菌效果并拍照。類似地，在打孔后的LB瓊脂板中每孔加入25 μL含不同質(zhì)量濃度（0（對(duì)照）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）BCp12的BCp12/殼聚糖/酪蛋白膜液；將1.3.5節(jié)制備的含不同質(zhì)量濃度（0（對(duì)照）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）BCp12的復(fù)合膜裁成直徑1 cm的圓形，貼在打孔后的LB瓊脂板上。將其置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18 h，以不含BCp12的膜液和復(fù)合膜作為空白組，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。觀察并統(tǒng)計(jì)抑菌圈的直徑，評(píng)價(jià)抗菌效果。

1.3.10 復(fù)合膜對(duì)乳扇的保鮮作用

1.3.10.1 乳扇的處理

將乳扇樣品在無菌條件下剪成6 cmh 1.5 cm的長(zhǎng)方形（質(zhì)量為1 g），覆蓋復(fù)合膜（邊長(zhǎng)8 cm正方形）后分為對(duì)照組、1組（殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜）、2組（殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜＋1 mg/mL Nisin）、3組（殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜＋1 mg/mL BCp12）4 個(gè)組，對(duì)照組不做任何處理。將普通薄膜剪成邊長(zhǎng)5 cm的正方形，將已覆有復(fù)合膜的乳扇用普通膜覆蓋避免污染，置于4 ℃冰箱貯藏60 d。

1.3.10.2 感官評(píng)定

挑選10位評(píng)價(jià)人員組成評(píng)定小組按照表2對(duì)不同貯藏時(shí)間（0、10、20、30、40、50、60 d）的乳扇色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分，最終結(jié)果取3 個(gè)項(xiàng)目的平均分。

表2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory assessment of milk fan

1.3.10.3 過氧化值的測(cè)定

參考GB 5009.227-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》測(cè)定不同貯藏時(shí)間（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d）乳扇的過氧化值。

1.3.10.4 色澤的測(cè)定

采用色彩色差儀測(cè)定各不同貯藏時(shí)間（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d）乳扇的L*值（亮度）、b*值（黃度），每組隨機(jī)采點(diǎn)測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.10.5 菌落總數(shù)的測(cè)定

參考GB 4789.21016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定不同貯藏時(shí)間（7、21、35、49、63 d）乳扇的菌落總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design-Expert 10軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果分析，采用SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行Duncan多重比較，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜機(jī)械性能的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酪蛋白/殼聚糖比例對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響

由圖1可知，隨著殼聚糖含量的增加，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度先增大后減小，當(dāng)酪蛋白與殼聚糖的比例為1∶1時(shí)，拉伸強(qiáng)度達(dá)到最大值。殼聚糖上的游離氨基和羥基與酪蛋白分子之間存在氫鍵作用，當(dāng)用磁力攪拌器充分混合時(shí)，二者可在分子水平上產(chǎn)生物理交聯(lián)，所以復(fù)合膜的強(qiáng)度較好[24-25]。酪蛋白與殼聚糖的比例為1∶1.5時(shí)斷裂伸長(zhǎng)率最大，但隨殼聚糖比例的增加而降低。這可能是殼聚糖濃度過大，二者相容性變差，導(dǎo)致復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均下降。殼聚糖本身是親水分子會(huì)與其他成膜分子形成氫鍵作用力，親水效應(yīng)增強(qiáng)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備復(fù)合膜選擇酪蛋白/殼聚糖比例為1∶1.5。

圖1 酪蛋白/殼聚糖比例對(duì)復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度（A）和斷裂伸長(zhǎng)率（A）的影響Fig.1 Effect of casein/chitosan ratio on tensile strength (A) and elongation at break (B) of composite films

2.1.2 甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響

甘油可以作為增加復(fù)合膜相容性和可塑性的增塑劑，對(duì)提高其力學(xué)性能有重要影響[26]。如圖2所示，隨著甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，拉伸強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，而斷裂伸長(zhǎng)率呈上升趨勢(shì)。拉伸強(qiáng)度下降是由于甘油過多進(jìn)入膜分子內(nèi)部，破壞了原來的分子結(jié)構(gòu)，增大了分子鏈的間隙，導(dǎo)致膜分子致密性下降。而甘油可使酪蛋白和殼聚糖分子之間產(chǎn)生氫鍵作用并軟化高聚物的剛性結(jié)構(gòu)，使得高聚物鏈段的流動(dòng)性增加，斷裂伸長(zhǎng)率增加。這與張一妹[27]和曾麗萍等[28]的研究結(jié)果一致。此外，甘油分子在基材中不易揮發(fā)，甘油過多會(huì)使復(fù)合膜表面的甘油溢出，影響感官品質(zhì)。甘油本身為親水物質(zhì)，易進(jìn)入分子內(nèi)部與成膜分子間形成新的氫鍵結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步使膜的流動(dòng)性和保水性增加[29]。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備復(fù)合膜選擇甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%。

圖2 甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度（A）和斷裂伸長(zhǎng)率（B）的影響Fig.2 Effect of glycerol concentration on tensile strength (A) and elongation at break (B) of composite films

2.1.3 干燥溫度對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響

從圖3可以看出，拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率隨著干燥溫度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，拉伸強(qiáng)度受溫度影響較明顯，斷裂伸長(zhǎng)率在55 ℃以下變化緩慢，干燥溫度高于55 ℃時(shí)迅速下降。當(dāng)干燥溫度上升時(shí)，溶劑蒸發(fā)留下的孔穴過多，造成復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)缺陷和裂縫，故其拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率差，而低溫條件下形成的復(fù)合膜結(jié)構(gòu)更致密、性能較好，該結(jié)果與方健[30]的研究結(jié)果相似。在此溫度下，水分蒸發(fā)速率較適中，殼聚糖分子在膜基質(zhì)形成過程中可以有序排列，致密性較高，持水性也較好[25]。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備復(fù)合膜選擇55 ℃為最佳干燥溫度。

圖3 干燥溫度對(duì)復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度（A）和斷裂伸長(zhǎng)率（B）的影響Fig.3 Effect of drying temperature on tensile strength (A) and elongation at break (B) of composite films

2.2 酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜機(jī)械性能的正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

如表3所示，通過極差分析可知，以拉伸強(qiáng)度為考察指標(biāo)，影響復(fù)合膜機(jī)械性能的主次順序?yàn)镃＞A＞B，即干燥溫度對(duì)復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度影響最大，甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響最小。以斷裂伸長(zhǎng)率為考察指標(biāo)，影響復(fù)合膜機(jī)械性能的主次順序?yàn)锳＞C＞B，即酪蛋白/殼聚糖比例對(duì)復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率影響最大，甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響最小。9 個(gè)正交試驗(yàn)條件中的最佳工藝組合為A2B1C2，由極差分析得到的最佳工藝組合為A2B3C2和A1B1C2。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

由R值可知，拉伸強(qiáng)度中C干燥溫度的影響更為顯著，因此選擇拉伸強(qiáng)度中C因素的較優(yōu)水平為55 ℃；斷裂伸長(zhǎng)率指標(biāo)中A的影響最顯著，因此選擇斷裂伸長(zhǎng)率中A因素的較優(yōu)水平為1∶1.5。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果如表4、5所示，通過F值可知，各因素對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響順序?yàn)槔业鞍?殼聚糖比例＞干燥溫度＞甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即酪蛋白/殼聚糖比例對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響最大，甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響最小。綜合考慮得出最優(yōu)成膜工藝為A2B2C2，即酪蛋白/殼聚糖比例1∶1.5、甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、干燥溫度55 ℃，以此條件制備的復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度為（14.86f 0.35）MPa、斷裂伸長(zhǎng)率為（142.25f 0.11）%，以此工藝進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)中復(fù)合膜的制備。

表4 拉伸強(qiáng)度方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for tensile strength

表5 斷裂伸長(zhǎng)率方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance for elongation at break

2.3 不同質(zhì)量濃度BCp12復(fù)合膜的厚度

由圖4可知，酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜厚度隨BCp12質(zhì)量濃度的增加而增加，其范圍為12～54 μm。這可能是由于提高抗菌肽質(zhì)量濃度加強(qiáng)了分子間的緊密連接。BCp12質(zhì)量濃度越高，膜液中固形物含量越多，復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)越緊密，成膜厚度逐漸增加。因此，復(fù)合膜的機(jī)械性能隨BCp12質(zhì)量濃度增大而逐漸增大。后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備復(fù)合膜選擇抗菌肽質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

圖4 抗菌肽BCp12質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合膜厚度的影響Fig.4 Effect of antimicrobial peptide BCp12 concentration on thickness of casein-chitosan composite films

2.4 SEM觀察結(jié)果

復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率和水蒸氣透過系數(shù)是由組成膜的大分子決定的。這些大分子成膜時(shí)是否均勻或完全溶解將直接影響可食膜的性質(zhì)。由圖5A可知，殼聚糖膜表面光滑致密平整，表明膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，這與曾少甫等[31]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖膜表面質(zhì)地光滑和結(jié)構(gòu)緊湊的結(jié)果一致。加入抗菌肽BCp12后，殼聚糖膜表面開始出現(xiàn)孔隙（圖5B），這可能是由于BCp12進(jìn)入殼聚糖內(nèi)部，冷凍干燥成膜粉后生成的小孔。由圖5C可見蛋白質(zhì)顆粒且表面較粗糙，膜中出現(xiàn)孔隙和區(qū)塊的現(xiàn)象，說明BCp12可能負(fù)載在復(fù)合膜上[32]。結(jié)合抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率分析結(jié)果可知，添加抗菌肽可能會(huì)使復(fù)合膜內(nèi)部出現(xiàn)孔隙[33]，導(dǎo)致復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Mohajer等[34]的研究結(jié)果類似，說明BCp12可與酪蛋白、殼聚糖混合使用，3 種物質(zhì)具有良好的相容性。主要是由于分子鏈間形成氫鍵相互作用，一定程度上增加了水分子的透過性并形成了致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[35]。

2.5 FT-IR分析結(jié)果

由圖6A、B可知，BCp12在1656.86 cm－1處特征吸收峰對(duì)應(yīng)酰胺I帶C＝O伸縮振動(dòng)，1440.60 cm－1處特征吸收對(duì)應(yīng)酰胺II帶，1314.96 cm－1處特征吸收峰對(duì)應(yīng)酰胺III帶，1182.63 cm－1處特征吸收峰對(duì)應(yīng)C-O伸縮振動(dòng)；而殼聚糖/BCp12在1630.05 cm－1處的吸收峰對(duì)應(yīng)酰胺I帶C＝O的伸縮振動(dòng)，1455.10 cm－1處特征吸收峰對(duì)應(yīng)酰胺II帶，1320.93 cm－1處特征吸收峰對(duì)應(yīng)酰胺III帶，1157.75 cm－1處特征吸收峰對(duì)應(yīng)C-O伸縮振動(dòng)[36]。根據(jù)沈亞麗[37]的研究，殼聚糖在1436 cm－1處特征吸收峰對(duì)應(yīng)O-H和N-H的伸縮振動(dòng)，1642 cm－1處特征吸收峰對(duì)應(yīng)酰胺I帶C＝O的伸縮振動(dòng)。而殼聚糖/BCp12的FT-IR圖中缺少了1602 cm－1附近的特征吸收峰，使其峰面積變寬并向低波數(shù)移動(dòng)，說明殼聚糖/BCp12內(nèi)存在氫鍵作用。

由圖6C、D可知，酪蛋白/BCp12在1642.15 cm－1處吸收峰對(duì)應(yīng)的是酰胺I帶C＝O的伸縮振動(dòng)，1446.56 cm－1處吸收峰對(duì)應(yīng)酰胺II帶，1314.63 cm－1處吸收峰對(duì)應(yīng)酰胺III帶，1172.06 cm－1處吸收峰對(duì)應(yīng)C-O伸縮振動(dòng)。根據(jù)沈亞麗[37]的研究，殼聚糖在N-H彎曲振動(dòng)吸收峰為1602 cm－1，BCp12/酪蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的吸收峰為1545.67 cm－1，由于膜內(nèi)的氨基發(fā)生質(zhì)子化，形成了NH，說明添加BCp12使該吸收峰向低波數(shù)方向移動(dòng)。酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合物中C-O伸縮振動(dòng)峰向低波數(shù)方向移動(dòng)且峰強(qiáng)度提升，這是由于基團(tuán)間形成了氫鍵，使伸縮振動(dòng)向低波數(shù)移動(dòng)。Huang Guoqing等[38]利用FT-IR研究大豆分離蛋白和殼聚糖復(fù)合使用也得到類似的結(jié)論。

圖6 BCp12、殼聚糖/BCp12、酪蛋白/BCp12和酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜的FT-IRFig.6 FT-IR spectra of BCp12,BCp12/chitosan,BCp12/casein and BCp12/chitosan/casein composite films

與BCp12/酪蛋白膜相比，BCp12/酪蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的特征峰幾乎均向低波數(shù)偏移，但未超過BCp12/殼聚糖的特征峰波數(shù)。研究表明，若兩種水性高分子相容性較好，分子間氫鍵相互作用會(huì)加強(qiáng)，表現(xiàn)為羧基振動(dòng)峰向低波數(shù)方向偏移[39]，形成分子內(nèi)氫鍵會(huì)使吸收強(qiáng)度增加并變寬。因此，可得到BCp12/酪蛋白/殼聚糖復(fù)合膜內(nèi)部存在較強(qiáng)的氫鍵作用，膜成分中會(huì)引入更多親水性基團(tuán)，使之具有良好的相容性且保水性和吸水性增強(qiáng)，這與張立挺等[40]的研究結(jié)果類似。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接在結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用，通過計(jì)算機(jī)模擬等方法可以預(yù)測(cè)主要蛋白與活性物質(zhì)間的結(jié)合位點(diǎn)及作用方式[41]。由圖7可知，CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3酪蛋白均能較好地對(duì)接于BCp12的活性中心位點(diǎn)，其中，CSN1S1酪蛋白的殘基Q112、Y109、K118與BCp12的殘基Y1、Y4、Q7、K12之間通過—NH2、—C＝O、—OH形成5 個(gè)氫鍵，最低結(jié)合能為－26.4 kJ/mol。與CSN1S1酪蛋白相比，CSN1S2酪蛋白的殘基E66、A62與BCp12的殘基L2、G3、Y4之間存在3 個(gè)氫鍵且長(zhǎng)度為3.0 ?。并且CSN2酪蛋白的殘基Q138、K128與BCp12殘基的L8、L9之間存在2 個(gè)氫鍵且結(jié)合能為－127.6 kJ/mol。而CSN3酪蛋白殘基的G20、P115與BCp12殘基的Y1、Y4之間存在2 個(gè)氫鍵且結(jié)合能為－94.5 kJ/mol。表明4 種酪蛋白殘基均能與BCp12殘基形成氫鍵相互作用，在分子的吸引中起重要作用，并且容易引起成膜分子間的聚集，使膜中引入更多親水性氨基酸殘基，膜的吸水性增強(qiáng)[42]。有研究表明抗菌肽HHRRFSLY可殺死大腸桿菌、破壞細(xì)胞膜和蛋白構(gòu)象，這可能與細(xì)胞的外膜選擇性滲透有關(guān)[43]。因此，可以推測(cè)BCp12的殘基Y4和酪蛋白之間通過—NH2形成氫鍵作用引起復(fù)合膜成分的聚集，使其具有低結(jié)合能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、保水性和抗菌性。

圖7 CSN1S1酪蛋白-殼聚糖（A）、CSN1S2酪蛋白-殼聚糖（B）、CSN2酪蛋白-殼聚糖（C）和CSN3-酪蛋白-殼聚糖（D）的分子對(duì)接結(jié)果Fig.7 Molecular docking diagrams of CSN1S1 casein-chitosan (A),CSN1S2 casein-chitosan (B),CSN2-casein-chitosan (C) and CSN3-casein-chitosan (D)

2.7 不同質(zhì)量濃度BCp12復(fù)合膜液及復(fù)合膜的抑菌效果

不同質(zhì)量濃度的BCp12復(fù)合膜液及復(fù)合膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果如圖8和表6、7所示。由表6和表7可知，BCp12質(zhì)量濃度對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌性影響較大，對(duì)大腸桿菌影響較小。隨著BCp12質(zhì)量濃度的增加，復(fù)合膜液及復(fù)合膜的抑菌圈逐漸增大。BCp12質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的復(fù)合膜液及復(fù)合膜對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，且對(duì)2 種菌的抑菌性差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)BCp12質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，復(fù)合膜液和復(fù)合膜對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（8.10f 0.06）mm和（7.21f 0.03）mm，且抑菌效果最好（P＜0.05），而大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為（7.05f 0.01）mm和（6.04f 0.06）mm。這與趙瓊等[44]用MIC法研究BCp12對(duì)2 種致病菌的抑制效果基本一致。董晶等[45]研究抗菌肽-殼聚糖復(fù)合抗菌膜對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同一條件下，BCp12復(fù)合膜液和復(fù)合膜對(duì)2 種菌的抑菌效果不一致，結(jié)果表明復(fù)合膜液的抑菌效果更佳，可能是由于膜液中BCp12與酪蛋白、殼聚糖大分子之間具有較好的相容性。實(shí)際生產(chǎn)中乳扇的食源性致病菌中金黃色葡萄球菌較多，故選取1.0 mg/mL BCp12復(fù)合膜分析其對(duì)乳扇的保鮮作用。

表6 不同質(zhì)量濃度的BCp12復(fù)合膜液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果Table 6 Antimicrobial effect of composite film-forming solutions with different concentrations of BCp12 on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

表7 不同質(zhì)量濃度的BCp12復(fù)合膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果Table 7 Antimicrobial effect of composite films with different concentrations of BCp12 on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

圖8 各組復(fù)合膜液對(duì)金黃色葡萄球菌（A）和大腸桿菌（B）的抑菌效果Fig.8 Antimicrobial effect of composite film-forming solutions on Staphylococcus aureus (A) and Escherichia coli (B)

2.8 復(fù)合膜對(duì)乳扇的保鮮效果

2.8.1 感官評(píng)價(jià)

各組乳扇的感官得分在貯藏期內(nèi)都有所下降，其中對(duì)照組的感官得分下降較快（圖9）。這可能是4 ℃下不能完全抑制微生物生長(zhǎng)，且微生物分解的速率足以使乳扇品質(zhì)下降。1組、2組和3組貯藏60 d的感官得分差異較小，較貯藏初期明顯下降，這是由于乳扇自身的乳酸菌生長(zhǎng)代謝、蛋白和脂肪降解使乳扇的酸味、腐敗味及酒味加重。根據(jù)Pinho等[46]對(duì)干酪風(fēng)味的研究結(jié)果，干酪的風(fēng)味強(qiáng)度隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加。根據(jù)對(duì)Gouda干酪貯藏研究結(jié)果[47]推測(cè)蛋白質(zhì)和脂肪的降解使乳扇微觀結(jié)構(gòu)中的孔隙增大和持水性下降，將導(dǎo)致乳扇質(zhì)地變硬。同時(shí)，1、2、3組的保鮮效果更好，其可能是殼聚糖、酪蛋白、Nisin和BCp12復(fù)合膜可以抑制微生物的生長(zhǎng)及蛋白和脂肪的分解，從而延長(zhǎng)乳扇的貨架期。

圖9 乳扇貯藏期間的感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.9 Sensory evaluation radar chart of milk fan during storage

2.8.2 過氧化值的變化

從圖10 可知，對(duì)照組在第20 天時(shí)過氧化值為1.61 mmol/kg，BCp12組在第40天時(shí)過氧化值為1.68 mmol/kg，上升趨勢(shì)比較緩慢。BCp12組在60 d內(nèi)過氧化值變化不明顯，說明BCp12起到較好的抗氧化作用。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，乳扇中過氧化值逐漸增加，產(chǎn)生令人不悅的氣味，其中對(duì)照組的過氧化值均高于實(shí)驗(yàn)組。這與蘇科巧等[48]研究結(jié)果類似，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組乳扇氧化程度較慢，表明不同復(fù)合膜具有一定的抗氧化作用。

圖10 乳扇貯藏期間過氧化值的變化Fig.10 Variation in peroxide value during storage of milk fan

2.8.3 色澤的變化

由圖11可知，4 個(gè)處理組的L*值均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，這是由于脂肪被分解產(chǎn)生游離脂肪酸，蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下產(chǎn)生氨基酸和小分子肽，與高鵬飛[49]的研究結(jié)果一致，由于這些油脂蛋白成分的變化會(huì)影響光的反射，從而使L*值不斷降低。貯藏期間b*值逐漸升高，可能是由于蛋白質(zhì)變得松軟和坍塌，從而使松散的蛋白骨架無法包埋游離脂肪導(dǎo)致脂肪析出，這與田洋等[50]的研究結(jié)果一致，乳扇中的蛋白質(zhì)和脂肪在微生物和內(nèi)源酶的作用下發(fā)生降解，b*值增加。由此可知，BCp12能抑制乳扇中微生物生長(zhǎng)并降低蛋白質(zhì)水解及油脂析出，使乳扇保持一定的亮度和黃度。

圖11 乳扇貯藏期間色差L*和b*值的變化Fig.11 Changes in color parameters during storage of milk fan

2.8.4 菌落總數(shù)的變化

如表8所示，對(duì)照組在前49 d內(nèi)菌落總數(shù)上升，而后呈下降趨勢(shì)，可能是乳扇中酵母菌或乳酸菌大量產(chǎn)酸使pH值下降，不耐酸的細(xì)菌大量死亡而造成的。1組、2組和3組都含有殼聚糖且具有抑菌活性，能通過阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)或穿過細(xì)菌表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)紊亂，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。2組和3組乳扇貯藏期間菌落總數(shù)較1組和對(duì)照組少（P＜0.05），說明添加BCp12和Nisin能有效抑制微生物繁殖，從而達(dá)到較好的抑菌效果。

表8 乳扇貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Table 8 Changes in total bacterial count in milk fan during storage

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過正交試驗(yàn)確定了復(fù)合膜的最佳工藝：酪蛋白/殼聚糖比例1∶1.5、甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、干燥溫度55 ℃；抑菌性方面，添加BCp12可顯著提高其抑菌效果，當(dāng)抗菌肽質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，復(fù)合膜液和復(fù)合膜的金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別為（8.10f 0.06）、（7.05f 0.01）mm，大腸桿菌抑菌圈直徑分別為（7.21f 0.03）、（6.04f 0.06）mm，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳；微觀結(jié)構(gòu)上，SEM和FT-IR結(jié)果表明復(fù)合膜有較好的相容性且未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，分子對(duì)接結(jié)果表明BCp12的殘基Y4與酪蛋白、殼聚糖之間存在較強(qiáng)的氫鍵作用，酪蛋白、殼聚糖、BCp12之間會(huì)引入更多親水基團(tuán)，使膜的保水性和持水性增加；將復(fù)合膜應(yīng)用于乳扇保鮮，結(jié)果表明BCp12復(fù)合膜保鮮乳扇相較于對(duì)照組過氧化值變化較慢，說明BCp12膜的抗氧化效果較好，經(jīng)4 ℃貯藏后保質(zhì)期可達(dá)60 d，且復(fù)合膜對(duì)乳扇貯藏期間微生物的生長(zhǎng)繁殖具有抑制作用。綜上，將BCp12復(fù)合膜用于乳扇保鮮能延長(zhǎng)乳扇保質(zhì)期，這一研究結(jié)果可為復(fù)合膜用于乳扇保鮮技術(shù)的研究提供理論依據(jù)。