南美白對蝦響應急冷與無水暴露雙重脅迫的生理變化特征

劉 澂，吳嘉鑫,2，徐德峰,2,3,*，孫力軍,2，秦小明,2，范秀萍,2

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.大連工業大學 精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034）

近年來隨著消費者對鮮活水產需求的快速增加，保活流通技術成為研究熱點[1-3]。目前鮮活水產品的保活流通以有水方式為主，但較低的裝載密度及對水質清潔度的較高要求使得綜合運輸成本偏高。相比而言，基于生態冰溫誘導休眠的微水或無水保活流通技術則極大降低了運輸過程中鮮活水產品的應激反應，可顯著增加裝載密度，降低單位運輸成本，并通過控制代謝強度來消減溶氧、二氧化碳、氨氮等環境因素對水產動物存活的不利影響[4-6]，因而無水保活運輸相較于有水活體運輸具有更廣闊的市場發展前景。南美白對蝦（Penaeus vannamei）是當今全球最重要的養殖經濟蝦類之一，其無水保活流通具有良好的經濟和社會效益[7]。雖然近年來水產動物無水保活技術研究日漸增多，設備逐漸多樣化[8-10]，但目前對蝦無水保活流通作業缺乏低溫預冷過程，通常是直接將養殖塘中的對蝦捕撈后投放于用冰塊預冷至12～15 ℃的低溫水體中，短時間內使其強迫進入半休眠或休眠狀態，之后短途運輸至特定流通場所，低溫環境下將休眠態對蝦裝入聚乙烯袋，充氧密封后存放在內置冰袋的航空運輸泡沫箱內，經紙箱外包裝后快速運至附近機場，利用航空運輸的速度優勢實現遠距離的快速保活流通。但該作業流程存在初期低溫急冷（acute cold exposure，AC）和中途無水空氣暴露（waterless duration，WD）雙重脅迫（AC＋WD），必然對對蝦個體存活質量造成影響，使得目前南美白對蝦無水保活流通過程中應激性傷殘死亡率高達20%～30%[3,10-11]。因此，迫切需要探明無水保活流通過程中南美白對蝦響應AC＋WD雙重脅迫的生理生化機制，識別關鍵生化標志物和響應途徑，從而靶向控制傷殘死亡率和提升存活質量。

代謝是維持細胞存活的基本方式，其中物質和能量代謝平衡是細胞存活的關鍵，而糖代謝途徑和關鍵酶活力直接決定了細胞能量水平和代謝中間產物的細胞毒性，最終決定細胞存活與否[12-14]。此外，環境脅迫會引起水產動物的應激反應，為維持正常的生理狀態，水產動物會從神經內分泌、生理生化、免疫調節等層面協同調節以適應環境脅迫[4]。長時間低溫無水保活流通對加州鱸魚（Micropterus salmonids）[15]、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）[16]、縊蟶（Sinonovacula constricta）[17]細胞能量代謝的影響已有報道；且研究發現廣溫性魚類暴露于低溫水環境時可調節代謝酶活力并改變代謝途徑，從而使其代謝和生理活動適應環境變化[18]。然而，目前尚不清楚無水保活流通過程中南美白對蝦對AC＋WD雙重脅迫的代謝應答響應規律。此外，肝胰腺作為對蝦重要生理活動執行器官，在物質代謝、環境響應和免疫防護方面發揮重要作用。因此，結合血液和肌肉組織生化指標變化，系統分析肝胰腺在南美白對蝦無水保活流通過程中的生化代謝和組織特征變化，有助于揭示南美白對蝦響應AC＋WD雙重脅迫的生理調節機制，為優化南美白對蝦無水保活運輸管理、提升存活質量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 kg南美白對蝦（個體質量（17.23f 1.12）g、體長（7.56f 0.42）cm）購于廣東省湛江市霞山區水產品批發市場，隨機均分5 份裝于20 L聚乙烯袋中，每袋裝有10 L海水，水體充氧后在1 h內運回廣東海洋大學食品科技學院保活流通實驗室。之后迅速將對蝦置于1 m3新鮮海水（水溫（23f 1）℃、pH（7.69f 0.5））中，于實驗室環境下適應性暫養12 h，增氧泵連續曝氣，不投放餌料，中途清潔海水換水一次。然后隨機挑選無機械性損傷、狀態良好的對蝦進行后續實驗。

檸檬酸、葡萄糖、氯化鈉、檸檬酸三鈉、乙二胺四乙酸二鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、甲醛、冰醋酸（均為分析純） 廣州化學試劑廠；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、Na＋/K＋-ATPase活力檢測試劑盒以及葡萄糖（glucose，Glu）、乳酸（lactic acid，LD）、糖原（glycogen，Gn）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、蛋白質含量檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Varioskan全自動酶標儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；5810R多功能臺式離心機 艾本德（中國）有限公司；HH-S4數顯恒溫水浴鍋 金壇朗博儀器制造有限公司；LTI-700W低溫恒溫培養箱 上海愛朗儀器有限公司；7002超低溫冰箱 美國熱電公司；S20供氧機寧波塞爾電氣公司；層析柜 上海博迅儀器股份有限公司；塑料周轉箱 東莞市茶山中距塑膠卡板廠。

1.3 方法

1.3.1 對蝦分組與脅迫處理

參照徐德峰等[19]的方法，預先準備3 個塑料周轉箱（490 mmh 345 mmh 285 mm）并連續編號，每箱分別注入20 L新鮮海水，將暫養后挑選的360 尾南美白對蝦隨機分為3 組，每組120 尾。將放入1號箱（24 ℃）中的對蝦作為正常對照（normal control，NC）組。2號和3號箱使用全自動循環冷水機將水溫降至對蝦生態冰溫休眠溫度（12f 1）℃，將其余兩組對蝦分別放入2號和3號箱中進行AC處理誘導休眠，2號箱對蝦在休眠30 min后取出，作為單獨急冷脅迫組（AC組）。觀察3號箱中對蝦活動狀態，至側倒、游泳足擺動無規律、機械刺激無反應后撈出，模擬南美白對蝦無水保活低溫流通環境[20]，分裝于塑料自封袋中（每袋10 尾），鑒于無水環境下機體易發生組織缺氧，故充入純度99.5%的氧氣后密封，然后置于12 ℃層析柜保存，作為AC＋WD雙重脅迫組，取第3、6、9小時，以及9 h后放入自然水溫（25 ℃）復蘇2 h的對蝦樣品，分別記為AC＋WD3h、AC＋WD6h、AC＋WD9h、AC＋WD9h＋R組。以NC和AC組為對照，分別在不同時間點取血淋巴、肝胰腺和肌肉組織，檢測相關代謝生化指標，并進行肝胰腺組織病理分析。

1.3.2 血淋巴、肝胰腺、肌肉組織樣品制備及代謝指標測定

血淋巴的采集：參照彭迪等[20]的方法用1 mL無菌注射器，按照血與抗凝劑體積比1∶1的比例，從對蝦腹血竇中采集血淋巴于1.5 mL離心管中，4 ℃、3000 r/min離心10 min取上清液，立即進行測定或于－80 ℃下凍存。按試劑盒說明書測定血清Glu、LD濃度和PK、PFK、HK、SDH、LDH活力。

肝胰腺組織勻漿液的制備：參照Jia Xuying等[21]的方法，在各時間點將對蝦放于冰盤上迅速解剖取肝胰腺，質量分數0.85%的生理鹽水沖洗后，冰上高速勻漿制備10%組織勻漿液，4 ℃、5000 r/min離心20 min后取上清液，立即進行測定或－80 ℃凍存。嚴格按照試劑盒操作說明檢測肝胰腺中Gn、LD含量和HK、PK、PFK、SDH、LDH、Na＋/K＋-ATPase活力。除Gn含量外，各指標測定結果均以蛋白質量計。

肌肉組織勻漿液的制備：對蝦剝殼后取第二腹節處肌肉0.5 g，冰上高速組織勻漿制備10%組織勻漿液，4 ℃、5000 r/min離心20 min后取上清液，立即進行測定或－80 ℃凍存。嚴格按照試劑盒操作說明檢測肌肉Gn、ATP含量和Na＋/K＋-ATPase活力。Na＋/K＋-ATPase活力測定結果以蛋白質量計。

1.3.3 肝胰腺組織病理分析

按照本團隊前期實驗方法[22]，對各組對蝦肝胰腺組織進行石蠟組織切片制備及結構觀察。

1.4 數據處理與分析

實驗各指標均平行測定3 次，結果采用平均值±標準偏差表示，采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，采用單因素方差分析進行多重比較，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦糖代謝的影響

以Glu為代表的糖類是生物能量的重要來源，而糖酵解途徑則是所有生物細胞進行糖分解代謝的共有途徑。AC＋WD雙重脅迫后血清Glu濃度顯著高于NC對照組（P＜0.05），隨著雙重脅迫時間的延長，Glu 濃度呈先升高后降低趨勢，AC ＋WD 6 h 組最高，為（26.31 f1.05）mmol/L，復蘇后Glu 濃度為（23.92f 0.59）mmol/L（圖1A）。無氧條件下Glu糖酵解產生的丙酮酸會在LDH催化下產生LD。由圖1B可知，血清、肝胰腺和肌肉組織中LD含量在冷脅迫后均高于NC組，雙重脅迫下南美白對蝦血清和肌肉中LD水平顯著上升（P＜0.05）；9 h時血清、肝胰腺和肌肉組織中LD 水平分別為（7.90 f 0.11）mmol/L、（0.12f 0.03）mmol/g和（0.52f 0.02）mmol/g，明顯高于其他各組，復蘇后血清中LD 含量降至（6.27f 0.32）mmol/L，提示脅迫進程中南美白對蝦組織缺氧逐漸加重。Gn是動物細胞內葡萄糖的儲存形式，能夠滿足細胞應激時對能量的需求。由圖1C可知，AC＋WD雙重脅迫后南美白對蝦肝胰腺和肌肉組織中Gn含量均連續下降，在9 h時肝胰腺和肌肉組織中Gn含量分別降至（4.48f 0.31）mg/g和（1.43f 0.14）mg/g，均顯著低于NC組（P＜0.05），復蘇后肌肉中Gn含量顯著回升至（1.74f 0.10）mg/g（P＜0.05），提示雙重脅迫下Gn分解代謝增強，可能源于應激條件下Gn生成Glu以維持機體能量供給穩定。Glu、LD和Gn水平變化表明AC＋WD雙重脅迫破壞了南美白蝦細胞糖代謝平衡。

圖1 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦血清、肝胰腺和肌肉組織中Glu（A）、LD（B）和Gn（C）水平的影響Fig.1 Effects of combined stress of AC and WD on the concentrations of Glu (A),LD (B) and Gn (C) in hemolymph,hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.2 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦呼吸代謝途徑的影響

SDH作為三羧酸循環中唯一鑲嵌在線粒體內膜上的酶，連接氧化磷酸化和電子轉移，其活性變化影響氧化磷酸化的進行，是有氧呼吸的標志酶[23-24]。由圖2A可以看出，AC＋WD雙重脅迫后AC＋WD3h組血清、肝胰腺和肌肉中SDH活力均較NC組有不同程度的增加，且脅迫3 h后分別為（2.36f 0.13）U/mL、（360.39f 15.48）U/g和（32.90f 0.89）U/g，明顯高于其他組，表明雙重脅迫組初期有氧呼吸較NC組增強，3 h后各組織中SDH活力逐漸下降，血清中SDH活力在9 h降至（1.61f 0.10）U/mL，復蘇后回升且略高于NC 對照組，肝胰腺和肌肉中SDH活力在復蘇后分別降至（277.24f 8.91）U/g和（25.00f 1.36）U/g，均低于NC組。SDH活力變化表明雙重脅迫3 h后細胞開始由有氧代謝轉為無氧代謝。

LDH是細胞內糖酵解和無氧呼吸的關鍵酶，能夠促進丙酮酸向乳酸轉化，常被用作反映細胞無氧代謝的重要指標[25]。由圖2B可以看出，血清中LDH活力變化趨勢與SDH活力類似，在雙重脅迫3 h后LDH活力達到最高，為（53.06f 2.11）U/L，顯著高于其他組（P＜0.05），而肝胰腺和肌肉中LDH活力在脅迫進程中呈持續上升趨勢，且雙重脅迫9 h時LDH活力分別增至（0.43f 0.02）×103U/g和（5.21 f 0.20）×103U/g，顯著高于其他組（P＜0.05），復蘇后LDH活力降至NC組水平，進一步表明南美白對蝦無水保活過程中細胞由有氧呼吸逐漸轉變為無氧呼吸，復蘇后又轉為有氧呼吸。

圖2 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦血清、肝胰腺和肌肉組織SDH（A）和LDH（B）活力的影響Fig.2 Effects of combined stress of AC and WD on the activities of SDH (A) and LDH (B) in hemolymph,hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.3 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦糖酵解進程的影響

HK、PFK和PK為糖酵解途徑的限速酶，其活力變化反映了糖酵解的速率，其中在糖酵解的第一個限速步驟中，HK將Glu轉化為葡萄糖-6-磷酸。由圖3A可以看出，HK活力在脅迫期間整體呈先升高后降低趨勢，血清、肝胰腺和肌肉中HK活力均在3 h達到最高值，分別為（14.29f 1.21）U/mL、（2.14f 0.12）×103U/g和（0.52 f 0.07）×103U/g，顯著高于其他組（P＜0.05），之后開始下降，且在9 h肝胰腺和肌肉中分別降至（1.52f 0.08）×103U/g和（0.39f 0.03）×103U/g，復蘇后肝胰腺和肌肉中HK活力回升至NC組水平，表明糖酵解在前3 h較強，之后糖酵解速率下降。

PFK是一種變構酶，其催化效率較低，糖酵解速率嚴格依賴該酶的活力水平，且H＋濃度對該酶有抑制作用，因此乳酸積累可反饋抑制PFK活力，同時PFK活力也受高濃度ATP抑制[24-26]。由圖3B可知，血清和肌肉中PFK活力在AC＋WD雙重脅迫3 h時分別增至（101.54f 3.91）U/L和（86.50f 2.41）U/g，高于其他組，之后逐漸下降，9 h時分別降至（81.08f 7.22）U/L和（43.55f 3.10）U/g，復蘇后回升至NC組水平；肝胰腺中PFK活力也呈類似變化趨勢，說明糖酵解途徑受到抑制。

PK在ATP合成過程中起決定作用，因此在細胞能量代謝過程中發揮重要作用[27]。由圖3C可知，PK活力在脅迫進程中均呈先升高后降低趨勢，但AC組血清和肝胰腺中PK活力最高，分別為（6.45f 0.32）U/L和（12374.04f 0.89）U/g，而肌肉中PK活力為AC＋WD3h組最高，之后各組織中PK活力逐漸下降，9 h時血清、肝胰腺和肌肉PK活力均達到最低點，復蘇后均回升至接近NC組水平。HK、PFK和PK活力變化綜合反映了AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦糖酵解進程產生顯著影響，尤其是在脅迫后期顯著抑制了糖酵解的進行。

圖3 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦血清、肝胰腺和肌肉組織中HK（A）、PFK（B）和PK（C）活力的影響Fig.3 Effects of combined stress of AC and WD on the activities of HK (A),PFK (B) and PK (C) in hemolymph,hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.4 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦能量水平的影響

Na＋/K＋-ATPase亦稱鈉鉀泵，通過消耗ATP維持細胞內外滲透壓，同時可驅動細胞中糖和氨基酸的運送以調節細胞體積[7,12,27]。由圖4A可知，AC脅迫后，肝胰腺和肌肉中Na＋/K＋-ATPase活力較NC組顯著增加（P＜0.05），分別為（1629.28f 71.31）U/g和（1082.21f 62.89）U/g，而在AC＋WD脅迫進程中肝胰腺和肌肉Na＋/K＋-ATPase活力均呈下降趨勢，AC ＋WD 9 h 組下降至（1111.80f 64.87）U/g和（750.19f 38.39）U/g，復蘇后回升至接近NC組水平，可能是由于初期的急冷脅迫刺激Na＋/K＋-ATPase表達，而在AC＋WD的低溫環境下酶活力明顯受到抑制。此外，如圖4B所示，肌肉中ATP含量在AC＋WD脅迫后較NC組逐漸下降，AC＋WD9h組降至最低（4.02f 0.21）μmol/g，顯著低于其他組（P＜0.05），復蘇后雖顯著回升至（4.88f 0.31）μmol/g，但仍顯著低于NC組（P＜0.05），提示脅迫進程中因細胞膜滲透性改變而內穩態失衡，為維持內環境平衡，細胞通過增加ATP消耗來加快細胞內物質輸送，以維持細胞內的滲透壓平衡。

圖4 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦肝胰腺和肌肉組織中Na＋/K＋-ATPase活力（A）和肌肉ATP含量（B）的影響Fig.4 Effects of combined stress of AC and WD on Na+/K+-ATPase activity (A) and ATP content (B) in hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.5 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦肝胰腺組織病理結構的影響

甲殼動物的肝胰腺中含分泌細胞（B細胞）、吸收細胞（F細胞）、儲存細胞（R細胞）和胚細胞（E細胞），成年商品對蝦肝胰腺中以B細胞和R細胞為主，且環境應激會對細胞比例造成影響[28-29]。由圖5可以看出，NC組對蝦肝胰腺肝小管輪廓清晰，其中細胞形態正常且分布均勻，管腔形狀規則，轉運泡整體數量不多且在細胞內分布較為均勻；AC組管腔形態仍較為規則，但體積略有增大，基膜收縮，表明急冷脅迫對細胞組織有輕微損傷。AC＋WD脅迫3 h時空泡數量相較于NC組明顯增加，B細胞數量減少，肝小管形狀的空泡擠壓性變形加重；AC＋WD脅迫6 h時空泡數量明顯減少，但體積變大，且管腔體積進一步加大；AC＋WD脅迫9 h時大空泡數量增多，管腔被明顯擠壓變形，且管腔中細胞數量明顯減少，破碎細胞組織數量增多，提示細胞發生了明顯降解或凋亡。復蘇組（AC＋WD9h＋R）中管腔仍有明顯破損，但較AC＋WD6h和AC＋WD9h組明顯減輕，空泡體積減小但數量明顯增加，與AC＋WD3h組的組織形態特征類似，表明細胞損傷得到一定程度的修復。

圖5 AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦肝胰腺病理結構的影響Fig.5 Effects of combined stress of AC and WD on the histopathology of the hepatopancreas tissue of Penaeus vannamei

3 結論

本實驗通過模擬南美白對蝦無水保活流通作業，探究12 ℃ AC＋WD雙重脅迫對南美白對蝦代謝和組織結構的影響，發現脅迫進程中伴隨著SDH和LDH活力的變化，細胞呼吸由有氧呼吸轉變為無氧呼吸，能量獲取方式發生改變，同時糖酵解過程的限速酶HK、PFK和PK活力在AC＋WD雙重脅迫3 h后整體下降，使能量發生明顯虧損，進而導致血糖和乳酸積累，以及糖原含量持續下降，最終使細胞內代謝穩態失衡，為維持和恢復細胞代謝平衡，機體能量消耗增加，進一步使ATP含量持續下降，最終因能量虧損而誘導組織損傷。