硒硫互作對白菜芽苗菜硫代葡萄糖苷含量及抗氧化性的影響

趙 爽，周羽琪，楊旭妍，范震宇，李方全，袁太勇，吳 桐，王玉書

（齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

硫代葡萄糖苷（以下簡稱硫苷）是十字花科植物中所特有的一類含硫、氮元素的次生代謝產物，其在植物生長發育、風味形成等過程中發揮著至關重要的作用[1]。根據硫苷前體氨基酸側鏈基團的不同，硫苷可分為脂肪族（蛋氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）、吲哚族（色氨酸）以及芳香族（苯丙氨酸和酪氨酸）三大類，目前在十字花科植物中已發現近200 種硫苷[2-3]。硫苷在黑芥子酶的作用下水解生成異硫氰酸酯，異硫氰酸酯在抑制I型致癌酶產生的同時，還可激活II型脫毒酶抑制化學致癌基因來發揮其抗癌功效[4]。硫苷及其降解產物除了對多種癌癥有一定的預防作用外[5]，還可降低人體心血管疾病的患病風險[6]，并對糖尿病也有一定的預防作用[7]。

硫苷合成過程受溫度、光照、營養元素、激素、逆境脅迫等生長環境因素影響，同時硫苷含量也與硫元素密切相關，外源施加硫元素是提高植物中硫苷含量的有效方法。初婷等[8]通過噴施不同濃度的MgSO4顯著提高了西藍花芽苗菜中硫苷含量。Yang Runqiang等[9]研究發現噴施ZnSO4溶液和K2SO4也同樣可以顯著提高西藍花芽苗菜的硫苷含量。其原因在于SO42－在被植物吸收后，經過還原同化等反應形成半胱氨酸，為硫苷合成提供原料[10]。而當環境中硫元素不足時，植物通過減少次級代謝產物硫苷的合成和增加硫苷降解來滿足初生代謝中對硫元素的需求，從而緩解硫元素缺乏對植物的影響[11]。硒與硫為同主族元素，二者在植物代謝過程中具有協同促進和競爭性抑制關系，然而外源補充硒元素對硫苷的影響尚無一致的結論。有學者證明適當的硒酸鹽處理會增加蘿卜葉片中硫苷的含量[12]。但Tian Ming等[13]研究表明補充硒元素抑制了硫苷合成基因MYB28和MYB34的表達，從而降低了植株中總硫苷含量及吲哚族、脂肪族硫苷含量。硒是人體必需的微量元素，其形成的硒甲基化合物在抗癌、抗氧化等方面效果顯著[14]。

白菜（Brassica rapavar.glabraRegel）口感清甜柔嫩、營養豐富，是世界范圍內廣泛栽培和食用的葉菜類蔬菜。研究發現十字花科蔬菜芽苗菜硫苷含量及活性成分均顯著高于成熟蔬菜[15]。芽苗菜具有種植周期短、種植簡單方便、口味獨特，綠色安全同時營養價值豐富等優點，但目前在我國，十字花科商品芽苗菜主要以蘿卜芽苗菜和西藍花芽苗菜為主，而對白菜芽苗菜的研究鮮有報道。因此本研究以白菜芽苗菜為試材，研究硒、硫及硒硫聯合處理對其硫苷含量和生理生化指標的影響，為開發富硒、高含量硫苷的功能性食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘德高536’白菜種子 山東德高種業有限公司。 沒食子酸、DEAE-Sephadex A-25 北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硫酸酯酶、烯丙基硫苷美國Sigma公司；Folin-酚、甲醇、乙酸鋇 國藥集團上海化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜靜電場軌道阱質譜聯用儀 美國賽默飛世爾公司；Optima 7300 DV電感耦合等離子體質譜儀 美國珀金埃爾默公司；WX-8000密閉微波消解系統 上海屹堯儀器科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子發芽處理

挑選約1000 粒籽粒飽滿的種子于50 mL蒸餾水中浸泡4 h，將其均勻點播在發芽盤（30 cmh 22 cm）中，盤底加400 mL去離子水，每2 d換1 次水，置于25 ℃光照培養箱中，光照16 h/黑暗8 h。第1天各組均噴施20 mL去離子水，此后每24 h各組分別噴施20 mL不同溶液，設置以下不同處理：噴施去離子水為對照，記作CK；噴施4 mmol/L ZnSO4溶液記作S4；噴施50 μmol/L Na2SeO3溶液記作LSe；噴施100 μmol/L Na2SeO3溶液記作HSe；噴施10 mL 4 mmol/L ZnSO4溶液和10 mL 50 μmol/L Na2SeO3溶液記作LSeS；噴施10 mL 4 mmol/L ZnSO4溶液和10 mL 100 μmol/L Na2SeO3溶液記作HSeS。

分別于處理4 d和6 d進行取樣，洗凈芽苗菜殘留溶液，擦干水分，部分鮮樣用于測定生理指標，其余樣品冷凍干燥后使用高通量研磨儀將葉片粉碎，得到芽苗菜凍干粉末。

1.3.2 形態特征及生長指標測定

從各處理組中隨機選取10 株芽苗菜，擺放整齊后，用相機拍攝記錄形態特征。隨機選取30 株芽苗菜，用游標卡尺測量芽長，并用萬分之一天平稱質量，計算芽苗菜單株平均質量。

1.3.3 總酚含量和DPPH自由基清除能力測定

上海市家庭醫生團隊成員對社區藥學服務的認知、評價和需求調查 ……………………………………… 沈 美等（13）：1841

取各處理組芽苗菜，參照Wang Mengyu等[16]的方法測定芽苗菜總酚含量；參照龔春燕等[17]的方法測定芽苗菜DPPH自由基清除能力。

1.3.4 硫苷組分及含量測定

硫苷組分及含量測定參考Yin Ling等[18]的方法并稍作修改。稱取0.2 g芽苗菜凍干粉末于75 ℃水浴鍋中加熱1 min，加入4 mL提前預熱至75 ℃的70%（體積分數，下同）甲醇溶液和100 μL 5 mmol/L 2-丙烯基硫苷（內標物）溶液，75 ℃水浴10 min，取出冷卻后加入1 mL 0.4 mol/L乙酸鋇溶液，5000 r/min離心10 min，收集上清液，剩余沉淀再用70%甲醇溶液提取2 次，合并3 次提取的上清液并轉移至10 mL容量瓶中定容。取5 mL上述提取液經DEAE-Sephadex A-25陰離子交換柱純化，提取液排干后向柱中加入250 μL 1.2 mg/mL的硫酸酯酶溶液，于室溫下酶解16 h，然后用2 mL去離子水洗脫，所得洗脫液經0.22 μm微孔膜過濾后，采用超高效液相色譜靜電場軌道阱質譜聯用儀（配備Hypersil GOLD? C18色譜柱（50 mmh 2.1 mm，1.9 μm））分析硫苷組分及含量。

液相色譜條件：流動相A為0.1%甲酸-水溶液；流動相B為純甲醇；梯度洗脫程序：0～3 min，2% B；3～20 min，25% B；20～25 min，50% B；25～28 min，2% B；流速0.3 mL/min。

質譜條件：電噴霧正離子源模式；質量范圍105～1000m/z；鞘層氣體流速35 Arb；輔助氣體流速15 Arb；噴霧電壓3.50 kV；毛細管溫度320 ℃；輔助氣體加熱器溫度300 ℃。

1.3.5 硒、硫元素含量測定

硒、硫元素含量測定參考Tian Ming等[13]的方法并稍作修改。稱取0.01 g芽苗菜凍干樣品粉末加入微波消解罐中，加入3 mL質量分數36.5%濃鹽酸和1 mL質量分數68%濃硝酸，旋緊罐蓋，于WX-8000密閉微波消解系統進行消解，消解完成冷卻后，用質量分數3%稀硝酸溶液定容至100 mL，利用Optima 7300 DV電感耦合等離子體質譜儀測定硒、硫元素含量。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 硒硫互作對白菜芽苗菜生理代謝的影響

2.1.1 白菜芽苗菜形態特征及芽長、單株平均質量

不同處理下芽苗菜生長4 d和6 d的外觀形態如圖1所示，芽苗菜經4 mmol/L ZnSO4溶液處理后其生長狀態相較于對照組受到了明顯的抑制，而50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理促進芽苗菜的生長，50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液聯合4 mmol/L的ZnSO4溶液處理緩解了4 mmol/L的ZnSO4溶液處理對芽苗菜生長的抑制作用。

圖1 不同處理對白菜芽苗菜外觀形態的影響Fig.1 Effects of different treatments on morphology of Chinese cabbage sprouts

如圖2所示，在白菜發芽期間，芽苗菜的芽長及單株平均質量都隨著發芽時間的延長而增加。4 mmol/L的ZnSO4溶液處理后芽苗菜芽長和單株平均質量均顯著低于對照組（P＜0.05），50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理下芽苗菜的芽長和單株平均質量均最高，且均顯著高于相同發芽時間的對照組（P＜0.05）；發芽6 d時，100 μmol/L Na2SeO3溶液處理的芽苗菜芽長及單株平均質量與對照組相比未表現出明顯變化。4 mmol/L的ZnSO4溶液分別聯合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理下芽苗菜的芽長和單株平均質量雖然都顯著低于相同發芽時間的對照組，但均高于4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組，說明Na2SeO3溶液處理會緩解4 mmol/L的ZnSO4溶液處理對芽苗菜生長的抑制作用。

圖2 不同處理對白菜芽苗菜芽長（A）和單株平均質量（B）的影響Fig.2 Effects of different treatments on sprout length (A) and average mass (B) of Chinese cabbage sprouts

2.1.2 白菜芽苗菜總酚含量

如圖3所示，在芽苗菜發芽期間，總酚含量隨著發芽時間的延長而降低，發芽6 d時的總酚含量顯著低于發芽4 d時的總酚含量（P＜0.05）。在發芽4 d時，4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組總酚含量顯著高于對照組，說明4 mmol/L的ZnSO4溶液處理對芽苗菜總酚合成具有一定促進作用；而50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理下芽苗菜總酚含量均低于對照組，分別降低了5.33%和7.13%，其中100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組總酚含量顯著低于對照組（P＜0.05）；4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50 μmol/L和100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組總酚含量分別高于對照組12.87%和6.28%。在發芽6 d時，4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組總酚含量顯著高于其他處理組（P＜0.05），其他處理組之間總體無顯著性差異。

圖3 不同處理對白菜芽苗菜總酚含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on the content of total phenolics in Chinese cabbage sprouts

2.1.3 白菜芽苗菜DPPH自由基清除能力

如圖4所示，在芽苗菜發芽期間DPPH自由基清除能力隨著發芽時間的延長而降低，各組發芽6 d時的DPPH自由基清除能力顯著低于發芽4 d（P＜0.05），同時與對照組相比，在發芽6 d時50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組DPPH自由基清除能力顯著降低（P＜0.05），其他處理組之間總體無顯著性差異（P＞0.05）。4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組發芽4 d時芽苗菜的DPPH自由基清除能力顯著高于對照組（P＜0.05）；4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組芽苗菜DPPH自由基清除能力均顯著高于對照（P＜0.05），而4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合100 μmol/L Na2SeO3溶液處理組芽苗菜DPPH自由基清除能力略高于相同發芽時間的對照組，但并未達到顯著水平（P＞0.05）。

圖4 不同處理對白菜芽苗菜DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effects of different treatments on DPPH radical scavenging capacity of Chinese cabbage sprouts

2.1.4 白菜芽苗菜硒元素和硫元素含量

由圖5A可知，在芽苗菜發芽期間，除對照組和4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組外，各處理組硒元素含量均隨著發芽時間的延長顯著升高（P＜0.05）。在發芽4 d或6 d時，無論是50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組還是4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組，芽苗菜硒元素含量均顯著高于對照組及4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組（P＜0.05），且硒元素含量依次為100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組＞4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組＞50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組＞4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組＞對照組或4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組，隨著施用Na2SeO3溶液濃度的升高，芽苗菜中硒元素含量也明顯升高，說明Na2SeO3溶液作為富硒食品營養強化劑，其施用濃度與芽苗菜中硒元素含量成正比。如圖5B所示，芽苗菜中硫元素含量除4 mmol/L ZnSO4溶液聯合100 μmol/L Na2SeO3溶液處理組在發芽6 d時顯著升高外，其余各處理組間硫元素含量沒有明顯的變化，說明硒與硫的施用并不會引起芽苗菜中硫元素含量的變化。

圖5 不同處理對白菜芽苗菜硒元素（A）和硫元素（B）含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on the contents of total Se (A)and S (B) in Chinese cabbage sprouts

2.2 硒硫互作對白菜芽苗菜硫苷組成的影響

2.2.1 白菜芽苗菜硫苷組分鑒定結果

硫苷極性較強，且不同硫苷單體在結構上只有側鏈R基團的微小區別。在正電離子噴霧的碰撞下，已經過硫酸酯酶作用形成的脫硫硫苷失去1分子葡萄糖（m/z162.1），形成特征碎片離子[M-G＋H]＋，同時還易與H＋、Na＋、K＋結合形成[M＋H]＋、[M＋Na]＋及[M＋K]＋離子，因此可通過特征離子計算脫硫硫苷的相對分子質量，進而對硫苷分子進行定性。如表1所示，在白菜芽苗菜中共檢測出11 種硫苷成分，分別為脂肪族（6 種）、吲哚族（4 種）、芳香族（1 種）硫苷，并且不同處理組中的硫苷組分相同。

表1 白菜芽苗菜硫苷組分鑒定結果Table 1 Glucosinolates identified in Chinese cabbage sprouts

2.2.2 白菜芽苗菜的硫苷含量

由圖6可知，隨發芽時間的延長，各組的硫苷含量大體呈增加趨勢。發芽4 d時，與對照組相比，不同溶液處理顯著提高了芽苗菜5MOSP和4OH的含量（P＜0.05）。與對照組相比，在芽苗菜發芽4 d和6 d時，4 mmol/L的ZnSO4溶液處理總體上提高了各組分硫苷含量；與對照組相比，50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理顯著提高了發芽期間（4 d和6 d時）GER含量和發芽4 d時NAS含量（P＜0.05），而發芽4 d時GBC含量無顯著變化（P＞0.05）；與對照組相比，相同發芽時間50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組PRO、GAP、GRA、GBN、NEO含量均顯著降低（P＜0.05），而4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理緩解了單獨噴施50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液對硫苷合成的抑制作用。

圖6 不同處理對白菜芽苗菜各組分硫苷含量的影響Fig.6 Effects of different treatments on the contents of individual glucosinolates in Chinese cabbage sprouts

2.2.3 不同處理白菜芽苗菜芳香族、脂肪族、吲哚族硫苷及總硫苷含量

發芽6 d時白菜芽苗菜不同類型硫苷含量如表2所示。與對照組相比，4 mmol/L的ZnSO4溶液處理可以顯著提高脂肪族、吲哚族、芳香族硫苷及總硫苷含量（P＜0.05）；100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理對芳香族硫苷含量無顯著影響（P＞0.05）；50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理均顯著降低了脂肪族、吲哚族硫苷及總硫苷含量（P＜0.05）；相對而言，4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理會緩解50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液對硫苷合成的抑制作用，其總硫苷含量甚至高于4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組，其中4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50 μmol/L Na2SeO3溶液處理組發芽6 d時總硫苷含量最高，比對照增加約50%，為50 μmol/L Na2SeO3溶液處理組芽苗菜發芽6 d時的2.75 倍。此外，由表2可知，芽苗菜中硫苷主要以脂肪族硫苷為主，約占總硫苷含量的95%。

表2 不同處理對發芽6 d時白菜芽苗菜硫苷含量的影響Table 2 Effects of different treatments on the contents of glucosinolates in Chinese cabbage sprouts on the sixth day of sprouting

3 討論

硫苷是十字花科植物中特有的一類重要的含氮、硫元素的次生代謝產物及抗氧化物[19]。硫元素作為植物生長過程中所必需的營養元素，是合成蛋氨酸的主要原料，同時蛋氨酸又是硫苷合成的前體氨基酸之一，所以十字花科作物對于硫的需求尤其敏感[20]。因此，許多學者試圖通過外源施加硫肥來提高十字花科植物中硫苷含量。在本研究中發現發芽6 d后，與對照組相比，4 mmol/L的ZnSO4溶液處理也可以顯著提高脂肪族、吲哚族、芳香族硫苷及總硫苷含量。硫元素和硒元素是同主族元素，二者代謝途徑相似，外源硒強化可能會影響含硫代謝產物的形成和降解。Tian Ming[13]和Avila[21]等研究證明外源硒強化會顯著降低成熟西蘭花中硫苷含量，而對西蘭花芽苗菜中的硫苷含量沒有影響。但在本研究中發現50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理會顯著降低白菜芽苗菜中脂肪族、吲哚族硫苷及總硫苷含量。硒處理雖然能夠抑制硫苷的合成，但對硫元素含量無明顯影響，推測硒并不是通過抑制硫的吸收而阻礙硫苷的合成。本研究在白菜中檢測到11 種硫苷組分，硒、硫和硒硫聯合處理對硫苷物質種類沒有影響，其中檢測出的GRA在白菜類蔬菜中鮮有發現。另外本研究發現白菜中硫苷主要以GAP和GBN為主，約占總硫苷含量的44%和48%，這與Lee[22]、Wei Jia[23]等研究大白菜和小白菜硫苷組成的結果相似，而且這些物質對白菜類蔬菜風味形成具有重要影響[24]。

硫苷能夠起到抗癌作用的主要原因是其降解產物異硫氰酸酯具有一定的抗腫瘤活性[25]。GBC、NAS以及GRA產生的異硫氰酸酯為吲哚-3-甲醇、苯乙基異硫氰酸酯以及蘿卜硫素，它們對乳腺癌及宮頸癌有一定的抑制作用[26-28]。因此，開發高GBC、NAS、GRA含量的蔬菜具有一定意義。本研究中4 mmol/L的ZnSO4溶液處理可以顯著提高GBC和NAS含量，而GRA含量提高尚未達到顯著水平。硒處理顯著降低GRA和GBC含量，而4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理可以緩解50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理的抑制作用，因此硒硫互作處理可以獲得高硫苷富硒芽苗菜產品。同時本研究結果表明發芽6 d時大部分處理組硫苷含量明顯高于4 d時硫苷含量，這和Bellostas等[29]在研究卷心菜和花椰菜時得出發芽7 d時總硫苷含量較4 d顯著增加的結果相一致，但卻與韓宇等[30]的研究結果相反，推測可能與研究對象物種和品種不同有關。但考慮到并不是所有的硫苷都對人體有積極作用，例如PRO降解產物噁唑烷硫酮就會對人體產生一定的毒害作用[31]，基于本研究結果選擇發芽6 d時的白菜芽苗菜更具有營養價值。總酚是植物中重要的抗氧化物質，對自由基具有一定的清除能力。本研究中4 mmol/L的ZnSO4溶液處理顯著提高了芽苗菜的總酚含量，這是由于4 mmol/L的ZnSO4溶液抑制芽苗菜生長從而促使總酚累積，相應地DPPH自由基清除能力也顯著提高。相反，50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理會降低芽苗菜中總酚含量，導致DPPH自由基清除能力下降，此結果與田明[32]的研究結果相似。本研究可為培育富硒又具有較高含量活性物質的十字花科蔬菜芽苗菜提供一定的參考。

4 結論

本研究結果表明，4 mmol/L的ZnSO4溶液處理對白菜芽苗菜造成生長脅迫，單獨施用Na2SeO3溶液可增加芽長和芽苗菜單株平均質量，而50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液聯合4 mmol/L的ZnSO4溶液處理可以有效緩解4 mmol/L的ZnSO4溶液對白菜芽苗菜生長發育的抑制作用。4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理后，白菜芽苗菜硒元素含量、總抗氧化能力及硫苷含量均有所提高，其中以4 mmol/L的ZnSO4溶液聯合50 μmol/L Na2SeO3溶液處理效果最好。大體上各組發芽6 d時的芽苗菜硒元素含量和總硫苷含量明顯高于發芽4 d時的芽苗菜。本研究結果可為具有高營養價值和保健功能芽苗菜的開發利用提供參考。