采后茶青葉對振動力脅迫的生理響應

郝志龍，林宏政，徐邢燕，李鑫磊，俞曉敏，岳 川，孫 云，金心怡,*

（1.福建農林大學園藝學院，茶學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002；2.浙江商業技師學院，浙江 寧波 315000；3.福建省農業科學院茶葉研究所，福建 福州 350013；4.福建農林大學海峽聯合研究院，園藝植物生物學及代謝組學中心，福建 福州 350002）

烏龍茶獨特的風味品質與其采后特有的加工工藝密切相關，茶梢采摘脫離茶樹母體后仍是有生命活力的個體，隨后的做青工藝伴隨有光照、失水、冷熱、力等各種非生物脅迫，誘導和促進植物多酚、揮發性物質等次生代謝物合成[1]。其中機械搖青是烏龍茶品質形成的關鍵工序之一，機械力脅迫作為植物主要的非生物脅迫因素之一，其生物學效應主要有激素調節機制和信號傳導作用機制等，進而影響植物的光合作用、呼吸作用、活性氧代謝等一系列體內生理生化變化[2]，為烏龍茶或花香紅茶、白茶等特殊品質茶葉風味的最終形成奠定基礎。實際生產中搖青時間主要通過做茶師傅的感官判斷，目前缺乏從青葉生理變化角度判斷的依據。因此，探明青葉響應持續機械脅迫的水分含量、光系統II（photosystem II，PS II）參數、抗氧化酶活性和亞細胞顯微結構等生理變化規律，對指導烏龍茶搖青工藝品質調控具有重要意義。

植物對機械脅迫的生物學效應研究已由宏觀水平逐漸深入到細胞和代謝水平，植物遭受機械脅迫的過程中除了宏觀組織器官破損，生理活動及細胞結構也會發生較大變化。機械損傷會誘導植物受傷和鄰近部位細胞壁發生栓化，形成愈傷組織，誘導細胞壁非木質化修飾，產生特殊的蛋白質和胼胝質來自我保護并適應機械損傷[3-5]。機械損傷會使細胞發生膜脂質過氧化，膜完整性遭到破壞，細胞通透性增加，進而引起組成物質滲出并降解，形成一些小分子信使物質，能夠激活下游調控機制，抵御機械脅迫[6-8]。植物體在遭受機械脅迫時，細胞內氧自由基動態平衡受到影響，產生大量的活性氧，對細胞產生毒性，造成蛋白、膜脂和DNA等損傷，誘導氧化脅迫[9-10]。茶葉加工過程中抗氧化酶活性與品質形成密切相關，茶鮮葉在攤放過程中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性先升高后迅速降低，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性保持升高的趨勢[11]。做青前期適當曬青、搖青能夠提高SOD活性，搖青過度則會抑制SOD活性提高，搖青還會使PPO活性降低，整葉PPO活性在做青過程中呈降低-升高-降低的變化規律[12-15]。搖青力屬于生物力學范疇，搖青力做功能增加青葉內能，適度破損葉細胞，提高青葉能量水平[15]。葉細胞破損可通過酶作用促進內含物轉化，青葉能量提高可為青葉內含物運輸提供動能，促進物質運輸，誘發化學反應，有利于香氣形成[16]。金心怡等[15]研究發現，搖青作用力主要為機械運動力和摩擦力，不同作用力做青效果不同。機械運動力有利于青葉“走水”，機械摩擦力有利于茶多酚酶促氧化，誘發香氣，運動力和摩擦力協調配合才能形成烏龍茶所特有的香高味醇品質。盡管采后果蔬振動脅迫下的生理生化變化研究較多[17-19]，也有研究報道了不同振動做青工藝（包含晾青）對茶葉生理生化品質的影響[14,20-22]，但有關振動力持續處理對青葉生理變化的影響尚不清楚。前期研究發現，振動力搖青具有青葉質點受力均勻、上下跳動高度一致、振動頻率可精細控制等優點，能夠克服滾筒搖青青葉下落高度不同而造成的受力不均勻問題，提高青葉受力均勻性，適用于小批量烏龍茶搖青試驗[22]。本實驗利用前期研發的振動搖青試驗臺為青葉提供更均勻的機械力脅迫，研究青葉對振動力脅迫的生理響應，以明確青葉響應振動力脅迫的水分含量、PS II參數、抗氧化酶活性和亞細胞顯微結構等生理變化規律，為指導烏龍茶搖青工藝品質調控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘鐵觀音’品種中開面三、四葉嫩梢采摘自福建省福清市南湖山茶業有限公司，選取長勢一致的同一片生態茶園，于2017年10月統一采摘。

所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

振動脅迫試驗臺參數：臺面尺寸為1100 mmh 1200 mm，固定振幅為25 mm，功率2.2 kW，振動頻率0～330 r/min，最大加速度20 g，最大負荷100 kg，可定時控制（0～60 min），最大電流5 A，電源220 V。

FE38-Meter電導率儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Imaging-Pam葉綠素熒光成像系統 德國WALZ公司；5430R型臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；LKB Nova超薄切片機 瑞典Bromma公司；UV-1800紫外分光光度計 美國賽默飛科技有限公司；JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉的振動力脅迫處理

采摘鮮葉經適度萎凋（自然萎凋45 min）后分為兩組，一組用于持續振動力處理（V組），另一組均勻攤放在相同環境條件下，不做任何處理作為對照（C組），環境溫度（22.0f 0.4）℃、相對濕度（83.8f 2.0）%。以振動力脅迫時間為因素進行單因素試驗，試驗方案如表1所示，基于前期預試驗結果，設定振動頻率300 r/min使茶葉均勻振動。不同處理樣品取樣編號規則：萎凋葉記為C0；自然攤放5 min青葉記為C5，自然攤放10 min青葉記為C10，以此類推；持續振動力脅迫5 min青葉記為V5，持續振動力脅迫10 min青葉記為V10，以此類推。分析振動力脅迫處理150 min內（0、15、30、60、90、120、150 min）青葉第二葉水分含量變化規律，以及處理30 min內青葉氣味（0、5、15、30 min）、第二葉PS II參數（0、5、10、15、30 min）、活性氧代謝酶活力（0、5、10、15、30 min）及亞細胞結構（0、5、15、30 min）變化規律。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 青葉水分含量測定及青葉氣味評價

參照GB/T 8304-2013《茶水分測定》[23]，采用120 ℃快速烘干法測定青葉水分含量，3 次重復，取平均值。水分含量以干基水分含量表示，按式（1）計算。

式中：m1為試樣烘前質量/g；m2為試樣烘后質量/g。

青葉氣味評價由3 位評茶經驗豐富的評茶師參照茶葉感官審評的香氣描述方法進行判斷，并記錄評語。

1.3.2.2 青葉PS II參數測定

選取5 個處理茶梢放置在暗適應箱中20 min后，將茶梢第二葉放置在Imaging-Pam葉綠素熒光成像系統葉片支架上，測定參數包含PS II實際光合效率Y（II）、非調節性能量耗散的量子產額Y（NO）、光化學猝滅系數qP、電子傳遞速率（electron transfer rate，ETR），每個處理重復5 次。

1.3.2.3 相對電導率測定

取備用樣第二葉用自來水洗凈后用蒸餾水沖洗3 次，用濾紙吸干表面水，將葉片剪成1 cmh 2 cm的長條備用，然后快速稱取鮮樣0.1 g，分別置于裝有10 mL去離子水的試管中，蓋上玻璃塞在室溫下浸泡處理12 h，用電導儀測定浸提液電導率R1/（S/m），然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導率R2/（S/m），按式（2）計算相對電導率。

1.3.2.4 抗氧化酶活力測定

取備用樣第二葉，用打孔器避開主脈取0.05 g左右置于預冷研缽中，加提取液（含50 mmol/L KH2PO4-KOH（pH 7.5）、5 g/100 mL不溶性交聯聚乙烯吡咯烷酮、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.5 g/100 mL曲拉通X-100）2 mL和少量石英砂，在冰浴中研磨成勻漿，冷凍離心機15000hg離心10 min，上清液用于酶活力的測定。抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDAR）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、CAT、脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）活力參照林鄭和等[24]的方法測定。

1.3.2.5 青葉亞細胞結構觀察

參照Du等[25]方法，選取各處理茶梢第二葉，避開主脈，用手術刀快速切成0.5 mmh 1.0 cm條狀，置于體積分數2.5%的戊二醛固定液（以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制）中，于4 ℃固定過夜，進行脫水和包埋處理后，采用LKB Nova超薄切片機切片（厚度約為70～90 nm），并將切片分別置于醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液中染色15 min和漂洗。在JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡下選擇多個視野進行觀察。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2013以及SPSS 21.0軟件分別進行數據處理和單因素方差、Duncan’s test顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 振動力脅迫過程青葉水分含量變化

離體后的茶鮮葉在自然攤放狀態下，隨著時間的延長，水分不斷蒸發，水分含量不斷降低。本研究中青葉水分含量變化如圖1所示，隨著處理時間延長，水分含量逐漸降低，振動力脅迫處理青葉水分含量降低較快，但30 min內與自然攤放處理葉和萎凋葉間差異均不顯著，60 min后顯著低于自然攤放葉和萎凋葉（P＜0.05）。由此可見，振動力持續脅迫60 min及以上能顯著降低青葉的水分含量，說明振動脅迫能加速水分的散失，一定處理時間（60 min）后水分脅迫效果開始凸顯，這可能是振動脅迫使青葉處于運動狀態，葉表面的葉面邊界層容易遭受破壞，更有利于水分的蒸發所致。因此，若要研究單純振動力脅迫效應，則應排除因水分脅迫差異引起的效應，故后續其他生理指標分析時間點選取30 min以內。

圖1 振動力脅迫對青葉水分含量的影響Fig.1 Effect of vibration stress on water contents in tea leaves

2.2 振動力脅迫青葉氣味變化

隨著振動力脅迫時間延長，青葉氣味變化如表2所示。隨著振動力脅迫時間延長，青葉青臭氣明顯增強，萎凋階段產生的清香減弱，而自然攤放保持萎凋的清香，青氣逐漸變弱。

表2 振動力脅迫過程青葉氣味變化Table 2 Changes in smell of tea leaves under vibration stress

2.3 振動力脅迫青葉PS II參數變化

植物葉片PS II參數是反映脅迫程度的重要指標，通過分析青葉PS II參數在振動力脅迫響應過程中的變化，能夠明確青葉的脅迫程度及電子傳遞情況。葉片Y（II）為PS II反應中心實際光合效率，表示線性電子傳遞的量子效率，是PS II反應中心在部分關閉情況下的實際原初光能捕獲效率。由圖2A可知，隨著振動力脅迫時間的延長，Y（II）總體逐漸降低。V5、V10的Y（II）顯著低于自然攤放葉，V10達到最低值（0.0838），表明振動力脅迫使青葉光能捕獲效率降低。Y（NO）為PS II反應中心非調節性能量耗散的量子產額，反映光化學能量轉換、自我保護調節機制和耗散過多光能的強弱。由圖2B可知，隨著振動力脅迫時間的延長，Y（NO）逐漸升高，自然攤放葉相對較穩定，其中V30最大（0.1946），顯著高于自然攤放葉（P＜0.05）。葉片qP為PS II反應中心的光化學猝滅系數，反映PS II反應中心的開放程度及天線色素吸收的光能用于光化學反應電子傳遞的份額。由圖2C可知，隨著處理時間的延長，葉片PS II qP總體逐漸降低。振動力脅迫青葉qP下降幅度較大，V10、V15顯著低于對照處理（P＜0.05），V15最低，為0.2788。葉片PS II ETR為光合電子傳遞速率，由圖2D可知，振動力脅迫青葉ETR呈先降后升的趨勢，自然攤放青葉呈下降趨勢，振動力作用5 min后青葉ETR顯著低于自然攤放葉（P＜0.05），V10的ETR從萎凋葉22.72降低到最低（15.88）。說明短時間（5～10 min）振動力脅迫使ETR顯著降低，光合電子傳遞受阻，但隨著脅迫時間的延長，青葉逐漸適應這種脅迫，ETR又逐漸恢復，呈現上升趨勢。

圖2 振動力脅迫對青葉PSII參數的影響Fig.2 Effect of vibration stress on PS II parameters in tea leaves

振動力脅迫青葉PS II參數Y（II）和qP呈下降趨勢，ETR呈先降后升的趨勢，5 min和10 min時Y（II）和ETR顯著低于自然攤放葉，Y（NO）呈上升趨勢，30 min時與自然攤放組相比達到顯著差異水平。說明青葉通過降低PS II反應中心的開放比例以及線性電子傳遞的量子效率，使Y（II）降低以減少光合碳同化提供的能量；隨著振動力作用時間延長，Y（NO）升高，PS II反應中心光化學能量轉換和自我保護調節機制逐漸減弱，無法耗散過多的能量，青葉受到傷害加重；振動力脅迫能夠降低青葉PS II反應中心的開放程度，天線色素吸收的光能用于光化學反應電子傳遞的份額減少，qP降低，脅迫加劇，光合電子傳遞受阻，傳遞速率ETR顯著降低，這與郭春芳[26]、柯玉琴[27]等研究茶樹受水分和聚乙二醇重度脅迫時葉綠素熒光參數變化的趨勢一致，說明振動力處理能在較短時間（5～15 min）對采后青葉產生明顯脅迫效應，長時間（30 min）處理產生重度脅迫效應。

2.4 振動力脅迫青葉電導率及活性氧代謝酶活力變化

相對電導率是評估植物葉片細胞膜透性的基本指標，其高低相應代表細胞膜透性大小。如圖3A所示，隨著處理時間的延長，青葉相對電導率呈上升趨勢，振動力脅迫青葉相對電導率升高較快，處理10 min后均顯著高于自然攤放葉（P＜0.05），由萎凋葉的0.3097增加到0.3843，V30達最大值，為0.5242，而C30僅上升至0.3891，與V10相當。這與黃毅彪[14]、劉波[20]等研究所得振動強度越大，葉片相對電導率越高、細胞滲透率越大的結果一致。說明振動力脅迫能夠加劇青葉細胞膜系統損傷，提高其透性，促進膜內可溶物滲出，為形成茶葉品質的生化反應提供條件。

APX、CAT、DHAR、GR和MDAR是植物抗壞血酸-谷胱甘肽（ascorbic acid-glutathione，ASA-GSH）氧化還原途徑的重要酶，對還原型ASA和GSH再生具有重要作用，而ASA和GSH是重要的非酶促抗氧化物質[28]。如圖3B～F所示，除CAT和MDAR外，其他抗氧化酶活力隨著處理時間延長，總體呈上升或先升后降趨勢。振動力脅迫青葉MDAR活力呈波浪式變化（圖3D），V5最高，為0.1664 μmol/（gg s），顯著高于自然攤放葉，V10最低，為0.0739 μmol/（gg s），之后略有升高，但均顯著低于自然攤放葉；APX（圖3B）、DHAR（圖3C）、GR（圖3F）隨著處理時間延長，活力呈先升后降趨勢，APX、GR活力在處理10 min時達到峰值，分別為0.8259、0.0051 μmol/（gg s），顯著高于自然攤放葉（P＜0.05），之后顯著低于自然攤放葉（P＜0.05）；DHAR活力在處理15 min時達到最高值（0.0144 μmol/（gg s）），顯著高于自然攤放葉（P＜0.05），但處理30 min時顯著低于自然攤放葉（P＜0.05）；振動力脅迫青葉CAT活力呈降低-升高-降低的變化趨勢，V10達到另一峰值（0.0600 μmol/（gg s）），V10、V15顯著高于自然攤放葉（P＜0.05），V30顯著低于自然攤放葉（P＜0.05）（圖3E）。說明萎凋后青葉在持續受到振動力脅迫時，短時間（5～15 min）內會通過提高抗氧化酶活性來抵御這種機械脅迫，但隨著脅迫時間的延長，青葉對這種脅迫逐漸適應，相關酶活力又逐漸恢復到較低的水平。

圖3 振動力脅迫對青葉電導率與抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of vibration stress on relative conductivity and antioxidant enzyme activities in tea leaves

本研究中APX、DHAR、GR活性隨著處理時間延長呈先升后降趨勢，APX活性直接影響ASA的含量，其活性提高標志著青葉清除活性氧能力增強，本研究結果與周子維等[29]研究搖青機械力使APX活性升高的結果一致。GR主要在NADPH作用下催化氧化型谷胱甘肽還原為GSH，GR活性提高能維持機械脅迫青葉中較高水平的GSH，有利于細胞保持氧化還原勢，有研究認為GR活性提高與脅迫環境下植物茉莉酸的積累有關[30]。MDAR和DHAR是調控植物體內ASA氧化還原態的關鍵酶，其活性提高有利于植物體內ASA代謝清除過剩的活性氧自由基，保護植物細胞免受氧化損傷[31-32]。振動力脅迫短時間（5 min）內青葉CAT活性變化趨勢與西瓜遭受硼脅迫后CAT活性降低的趨勢相似[30]，因CAT對脅迫的響應更加敏感，較長時間（10～30 min）脅迫使其活性升高后再降低。振動力脅迫短時間（5～15 min）內青葉中ASA-GSH氧化還原途徑的重要酶活性總體高于自然攤放葉，表明青葉清除活性氧能力增強，振動力脅迫短時間內青葉通過提高MDAR（5 min）和DHAR（5～15 min）活性以維持ASA再生，協同提高APX和CAT活性從而抵御機械脅迫產生的活性氧對葉細胞的損傷，這與前人研究發現烏龍茶機械搖青后，青葉抗氧化酶活性升高的結果[33]一致。

2.5 青葉亞顯微結構變化

對30 min內振動力脅迫青葉進行亞細胞結構觀察，結果如圖4所示，各處理葉片細胞整體結構無明顯變化。能觀察到C0葉綠體、類囊體片層結構，葉綠體緊貼細胞壁（圖4A），細胞壁、細胞膜和液泡完整。隨著處理時間延長，細胞間隙增大，尤其是V30細胞間隙明顯變大，且細胞排列發生紊亂。如圖4C所示，通過放大倍數觀察葉綠體變化，可以發現C0和C5的葉綠體片層結構排列緊密而清晰，淀粉粒大而多，能觀察到嗜鋨顆粒（也稱脂質球）。V5的葉綠體和淀粉粒移向細胞中央，淀粉粒數量明顯增加，葉綠體、類囊體緊密而清晰的片層結構開始出現松散（圖4A）；之后淀粉粒數量隨著處理時間的延長逐漸減少，粒徑逐漸變小，葉綠體、類囊體逐漸收縮，緊密而清晰的層狀結構進一步遭到破壞，開始松散、變形；V15的葉綠體外膜模糊不清，部分片層結構模糊（圖4B），V30的葉綠體、類囊體嚴重收縮，部分片層結構已經瓦解，排列紊亂（圖4C）；V5、V15中嗜鋨顆粒數量明顯增加，V15甚至出現聚集現象（圖4C），但V30的嗜鋨顆粒數量明顯減少，有的幾乎消失（圖4C）。

圖4 振動力脅迫對青葉亞顯微結構的影響Fig.4 Effect of vibrating stress on subcellular structure in tea leaves

植物葉片亞細胞顯微結構變化與受脅迫程度關系密切，振動力脅迫青葉細胞整體結構無明顯變化，但隨著處理時間延長，細胞間隙增大，在30 min時明顯變大，細胞排列發生紊亂。振動力脅迫使淀粉粒數量先增后減，粒徑逐漸減小，嗜鋨顆粒數量明顯增加，V15出現聚集現象，V30中嗜鋨顆粒數量又明顯減少；葉綠體、類囊體緊密而清晰的片層結構逐漸松散、變形、收縮、紊亂、瓦解。淀粉粒是植物中最普遍的碳水化合物貯藏物質，有研究表明高鹽脅迫使植物細胞通過葉綠體內淀粉粒數量和體積的變化，從而緩解能量短缺，保證細胞正常的生命活動[34]。綜上，短時間（5 min）振動力脅迫使葉綠體內淀粉粒數量增加，以此緩解機械脅迫后的細胞能量短缺，提高葉片抗性，維持正常的生命活動。嚴學成等[35]研究發現葉綠體結構中含有較多嗜鋨顆粒的品種所制茶葉香氣更高，嗜鋨顆粒中含有大量類脂物質，這是植物受到較重脅迫時類囊體降解以及脂質聚集所致，其通常在衰老的葉綠體中大量產生。適度的振動力脅迫（5～15 min）能夠促使青葉類囊體降解、葉綠體衰老以及降解產物脂質聚集，從而導致綠體內嗜鋨顆粒數量和體積明顯增加，這些結構變化表明青葉細胞衰老加速，淀粉和嗜鋨顆粒的聚集為烏龍茶加工過程中以淀粉水解和脂類物質降解為主的品質形成提供了物質基礎。較長時間（30 min）振動力脅迫使葉綠體片層結構紊亂，接近瓦解，這與武傳蘭[36]、吳凱[37]等研究鹽脅迫對植物細胞超微結構的影響結果相似。結合葉綠素熒光參數變化說明振動力脅迫對采后青葉脅迫明顯，能夠加速青葉葉綠體結構的瓦解和葉細胞衰老。

3 結論

振動力脅迫30 min內青葉水分含量與自然攤放葉和萎凋葉無顯著差異，60 min時顯著低于自然攤放葉和萎凋葉。隨著振動力作用時間延長，青臭氣變濃，清香減退。振動力脅迫10 min后青葉相對電導率顯著高于自然攤放葉，5 min和10 min時PS II Y（II）和ETR顯著低于自然攤放葉。隨著振動力脅迫時間的延長，葉綠體和類囊體緊密而清晰的片層結構逐漸松散、變形、收縮、紊亂、瓦解，5 min時淀粉粒數量明顯增加，15 min時嗜鋨顆粒數量明顯增多，并出現聚集。青葉抗氧化酶APX、DHAR、GR和MDAR活性在處理5～10 min總體高于自然攤放葉。振動力脅迫作為烏龍茶加工過程中的一種搖青力形式，一定時間（30 min以內）對青葉水分含量影響不顯著，但會造成青氣變濃，加劇青葉細胞膜系統損傷，使其透性提高，促進膜內可溶物滲出，使相對電導率顯著升高，類囊體降解，葉綠體嚴重受損，青葉PS II系統被破壞，提高活性氧代謝酶活性從而抵御機械脅迫對葉細胞的損傷，為烏龍茶品質形成的生化反應提供條件。綜上，一定時間的振動力脅迫（5～15 min）能夠對烏龍茶產生較強的脅迫效應，并啟動抗氧化酶系以抵御振動力脅迫帶來的傷害，加速青葉葉綠體結構的瓦解和葉細胞衰老，為烏龍茶搖青工藝后的物質代謝提供基礎。本實驗可為生產上烏龍茶搖青時間的調控提供參考依據。