不同葉位芽葉在工夫紅茶加工過程中理化品質的變化

周靜蕓，黃 瑞，歐陽珂，陸安霞，陳林木，童華榮,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.宜賓學院農林與食品工程學部，四川 宜賓 644000）

茶是世界上最受歡迎的飲料之一，而紅茶則因其獨特的風味和健康作用成為風靡全球的茶類，占全球茶葉消費量78%左右[1]。按照加工工藝的不同，紅茶可以分為小種紅茶、工夫紅茶和紅碎茶。在中國，工夫紅茶更受消費者喜愛[2]。在紅茶加工過程中，茶鮮葉經過萎凋、揉捻（切）、發酵和干燥幾個工序，內含成分發生劇烈變化[3]，形成了紅茶典型的紅湯、紅葉及甜醇的滋味特征[4-5]。萎凋會提高多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力[6]，增加細胞膜的滲透性[7]，揉捻會破壞葉片葉肉細胞，導致液泡細胞液釋放[8]，使得位于細胞液泡中的兒茶素[9]與葉綠體類囊上的PPO結合[10]，發生酶促氧化反應，形成茶黃素和茶紅素等影響紅茶干茶的色澤、茶湯顏色和滋味品質的化學組分[11-12]。在加工過程中葉綠素會降解[13]，但不同成熟度葉片的葉綠素含量不同，葉綠素含量隨著成熟度增加而增加[14]，這可能對工夫紅茶葉底品質有影響[15]。同時，不同成熟度新梢（或葉片）的兒茶素、沒食子酸（gallic acid，GA）等也有很大差異[16]，其對揉捻的響應也不同，從而影響發酵[17]。Selvendran[18]和Harris[19]等觀察了紅茶加工過程中葉片結構的變化，但沒有結合加工過程中品質組分的變化進行研究。本研究通過對工夫紅茶加工過程中不同葉位葉片的微觀結構及不同葉位芽葉的品質組分的變化分析，考察各部分在加工過程中理化品質的動態變化及其品質響應，以期為優質工夫紅茶在原料的選擇、加工工藝及品質評價等方面提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福鼎大白茶（Camellia sinensis(L.) O.Kuntze cv.Fuding Dabaicha）茶樹品種，一芽二葉鮮葉，2021年4月采摘于重慶市大足區。

番紅固綠（植物）染液、電子顯微鏡固定液 武漢賽維爾生物科技有限公司；葉黃素（純度≥98%）、葉綠素b（純度≥90%） 上海源葉生物科技有限公司；葉綠素a（純度≥85%） 上海麥克林生化科技有限公司；脫鎂葉綠素a（純度≥95%）、8 種兒茶素組分及GA均為標準品（純度≥98%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；甲醇、乙腈、無水吡啶、冰乙酸、丙酮（均為色譜純）、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛、乙醇、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、福林-酚、碳酸鈉、乙酸乙酯、正丁醇、草酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純） 成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

RM2016病理切片機、UC7超薄切片機 德國徠卡儀器有限公司；Ultra45°鉆石切片刀 深圳市澤任科技有限公司；HT7800/HT7700透射電子顯微鏡日立（中國）有限公司；Eclipsee 100正置光學顯微鏡 尼康映像儀器銷售（中國）有限公司；UltiMate3000高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；Synergy H1酶標儀 安捷倫科技（中國）有限公司；5810R冷凍離心機 德國艾本德公司；MDF-86V340E(D)超低溫冰箱 安徽中科都菱商用電器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工夫紅茶加工工藝及樣本制備

原料按照傳統工夫紅茶工序加工，具體操作如下：將鮮葉置于晾青架上萎凋至含水量60%～62%（室溫20 ℃、相對濕度68%～70%）→揉捻90 min（不加壓45 min-輕壓20 min-中壓20 min-不加壓5 min）→發酵3 h（發酵箱內溫度30 ℃、相對濕度92%～94%）→干燥（毛火120 ℃、15 min-攤涼回水45 min-足火90 ℃至刺手）。

樣本制備：對每個加工過程中的一芽二葉在制品進行手工篩選及分離，分解為芽、第一葉、第二葉、莖梗（圖1）。對以上分離好的茶樣及一芽二葉在制品立即液氮固樣，冷凍干燥后粉碎過40 目篩密封，置于－80 ℃超低溫冰箱保存備用。

圖1 工夫紅茶加工工藝流程及樣本制備示意圖Fig.1 Flow chart of Congou black tea processing and tea sample preparation

1.3.2 葉片顯微結構觀察

采用常規石蠟切片技術對第一葉和第二葉進行切片取樣。因茶樹葉片較嫩，為防止原料在固定過程中收縮、蒸發以及變硬，采用自制改良的甲醛-乙酸-乙醇固定液（formaldehyde-acetic acid-ethanol fixative，FAA）（5 mL體積分數38%甲醛溶液＋5 mL冰醋酸＋90 mL體積分數50%乙醇溶液＋5 mL甘油）固定24 h。經脫蠟、番紅染色、脫色、固綠染色、中性樹膠封片等一系列操作后，使用正置光學顯微鏡對其觀察和拍照。

1.3.3 葉片超微結構觀察

取第一葉和第二葉葉片主脈兩側組織約1 cm3的小組織塊，放入電子顯微鏡固定液中，用真空泵抽氣直至沉底。4 ℃下固定24 h后對樣本進行漂洗后固定、滲透包埋、浸透包埋、聚合、超薄切片（60～80 mm）、醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對其雙重染色后選擇典型區域觀察、拍照。

1.3.4 酚類化合物含量測定

茶多酚（tea polyphenols，TP）質量分數和兒茶素組分含量測定參照GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，其中TP質量分數測定采用分光光度法，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）含量及GA含量測定采用高效液相色譜法；茶黃素、茶紅素、茶褐素含量測定采用系統分析法。兒茶素類總量（total catechins，TC）、EGCG、EGC、ECG氧化率按下式計算。

式中：m1為鮮葉中酚類化合物含量/（mg/g）；m2為毛茶中酚類化合物含量/（mg/g）。

1.3.5 葉綠素組分測定

參照陳麗等[20]方法采用外標法對同一波長條件下吸收峰的面積進行定量計算。其中，葉綠素a異構體用葉綠素a標準曲線方程定量，葉綠素b異構體用葉綠素b標準曲線方程定量，其他無標準品的葉綠素組分根據脫鎂葉綠素a的標準曲線方程定量，標準曲線方程如表1所示。

1.4 數據統計與分析

利用Excel 2019軟件進行數據整理，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差顯著性分析（以P＜0.05定義為差異顯著），利用Origin 2019b和Adobe Photoshop 2020軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同葉位芽葉的表型結構在加工過程中的動態變化

2.1.1 不同葉位芽葉在加工過程中的色澤變化

圖2展示了工夫紅茶在加工過程中制品的色澤變化情況。在傳統工藝加工過程中，茶樹鮮葉色澤由鮮綠逐漸變紅最后形成烏黑油潤帶金毫的成品茶。揉捻葉中不同葉位芽葉的色澤由綠開始變紅，發酵葉中單芽、第一葉、莖梗紅變均勻，而第二葉和一芽二葉還含有一定的青葉。由此可見，不同葉位芽葉均在揉捻時色澤發生變化，且第二葉的紅變程度弱于其他葉位。

圖2 紅茶加工流程圖及葉底青張表型Fig.2 Flow chart of black tea processing and the phenotype of infused leavse with blue

2.1.2 不同葉位葉片的顯微結構在加工過程中的動態變化

鮮葉中葉肉細胞的細胞核及木質化的細胞壁經番紅固綠染色后呈紅色，細胞質及纖維素的細胞壁呈綠色，柵欄組織、海綿組織及維管束均可明顯區分，且不同葉位葉片間海綿組織細胞間隙、維管束細胞組成結構有一定的差異（圖3A）。其中，第一葉的維管束細胞有序排列呈近圓形，而第二葉呈近橢圓形；海綿細胞形狀多樣，有3～4 層，第一葉海綿細胞排列整齊，而第二葉海綿細胞排列疏松，間隙發達。如圖3B所示，萎凋葉中，葉肉細胞染紅處有少量黃色出現：隨著萎凋時間的增加，細胞失水，細胞質膜與細胞壁發生質壁分離，表明細胞正處于死亡的初期階段。在這一階段，第一葉與第二葉的顯微結構較鮮葉變化顯著，第一葉的維管束細胞形似橢圓，第二葉的維管束細胞排列無序且不成形，已經開始破碎；第一葉的海綿細胞排列整齊，有3～4 層，第二葉海綿細胞排列相對整齊，有3～4 層。由此可知，不同葉位葉片在維管束細胞結構及海綿細胞間隙上存在差異。揉捻葉中，柵欄組織層長柱細胞及海綿組織層薄壁細胞呈紅黃雜色，其中第一葉顏色更深（圖3C～D）。在機械力的作用下，葉肉細胞組織結構遭到破壞，從而發生萎縮變形、質壁分離、細胞破碎。當發酵結束時（圖3E），大多數葉肉細胞已被完全破壞，其中第一葉表現得更明顯，柵欄組織及維管束被徹底破壞并變形，上、下細胞排列松散、扭曲，細胞形狀不規則，整體呈金黃色；第二葉柵欄組織及維管束也被破壞，較第一葉破壞程度輕，整體呈紅黃色。由此可知，揉捻和發酵階段，第一葉的細胞結構破壞程度較第二葉重，這可能是導致第一葉發酵葉的色澤較第二葉紅的原因。

圖3 第一、二葉的顯微結構在工夫紅茶加工過程中的動態變化Fig.3 Microstructure changes of the two leaves during Congou black tea processing

2.1.3 不同葉位葉片的超微結構在加工過程中的動態變化

不同葉位葉片在加工過程中的超微結構形態變化如圖4、5所示。由圖4可知，鮮葉和萎凋葉中不同葉位茶樹葉片細胞超微結構完整且基本相同，葉綠體完整分布在細胞壁周圍，液泡完整。揉捻使茶葉在外力的擠壓下，葉肉細胞結構受損，葉綠體結構被破壞，液泡內液溢出充滿整個細胞，細胞壁內折變形，導致葉片細胞結構發生顯著變化，這種變化持續到發酵結束。由此可知，機械揉捻破壞細胞的完整性，導致液泡細胞膜喪失選擇的能力，從而使液泡內多酚類物質與細胞質內源氧化酶類發生反應。

圖4 第一、二葉的超微結構在工夫紅茶加工過程中的動態變化Fig.4 Ultrastructure changes of the two leaves during Congou black tea processing

圖5反映了葉綠體形狀和結構上的變化，鮮葉中葉綠體結構完整，呈橢圓形，內外膜清晰，基粒片層排列致密且整齊，同時第二葉的葉綠體中清晰可見淀粉粒和嗜鋨顆粒（圖5A），研究表明嗜鋨顆粒和淀粉粒的含量與葉片成熟度有關[21]。萎凋過程中葉綠體呈近圓形的形態變化（圖5B），這可能與萎凋細胞失水有關。揉捻45 min時，葉綠體結構發生一定程度的破損，內外膜模糊或消失，基粒片層排列稀疏紊亂。葉綠體內膜系統被破壞，嗜鋨顆粒大量產生，類胡蘿卜素生成[22]，第二葉的淀粉顆粒缺失（圖5C），且基粒片層排列較第一葉有序。揉捻結束時（圖5D），不同葉位茶樹葉片的葉綠體損傷度幾乎與揉捻45 min時相近，僅第二葉的基粒片層排列較稀疏紊亂。由圖5C1、D2可知，不同葉位茶樹葉片的葉綠體在揉捻時變化最大，結構發生變化，基粒片層排列變稀疏紊亂，而在發酵葉中變化不大（圖5E），差異不明顯。

圖5 第一、二葉的葉綠體在工夫紅茶加工過程中的動態變化Fig.5 Morphological changes of the two leaves during Congou black tea processing

2.2 不同葉位芽葉的酚類化合物在加工過程中的含量變化

2.2.1 TP、兒茶素類、GA在加工過程中的含量變化

不同葉位芽葉的TP和兒茶素類在加工過程中呈不同幅度的下降趨勢（圖6），在鮮葉和萎凋葉中下降幅度較小，揉捻葉中下降幅度大，這與揉捻破壞了茶樹葉片細胞結構有關。成品茶中芽、第一葉、第二葉、莖、一芽二葉的TP質量分數較鮮葉分別降低了55.45%、46.36%、53.57%、49.21%、52.52%。第一葉和第二葉TP質量分數在鮮葉、萎凋葉、發酵葉中差異不顯著（P＞0.05），揉捻葉中第一葉TP質量分數較第二葉顯著降低16.92%（P＜0.05）。揉捻葉中，第二葉、一芽二葉的EGC含量差異不顯著（P＞0.05），而第一葉和第二葉的TC、EGCG、EGC、ECG含量均差異顯著（P＜0.05），第一葉含量較第二葉分別低24.14%、53.05%、12.36%、45.17%，這是由于揉捻階段第一葉的結構破壞程度較第二葉嚴重（圖3），多酚類物質與酶的結合更充分，酶促氧化作用更顯著。在發酵葉及成品茶中，第一葉和第二葉的EGC含量和TC含量差異不顯著（P＞0.05），而EGCG含量差異顯著（P＜0.05），發酵葉及成品茶中第一葉EGCG的含量較第二葉分別降低51.51%、26.01%。芽、第一葉、第二葉的EGC含量在成品茶中差異不顯著（P＞0.05）。由圖6F可知，不同葉位芽葉的G A 含量在加工過程中呈先增加后減少又增加的動態變化。由于酯型兒茶素降解生產GA[23]，在揉捻結束前GA含量增加，隨著發酵的進行，GA氧化成鄰醌參與色素的形成[24]，其含量減少。芽、莖梗在加工過程中顯著低于其他葉位（P＜0.05），不同葉位葉片的GA含量在揉捻葉和成品茶中差異顯著（P＜0.05），第二葉含量較第一葉分別提高26.81%、18.63%，這與兒茶素類物質在加工過程參與氧化反應有關。

圖6 不同葉位芽葉茶多酚、兒茶素類、沒食子酸含量在工夫紅茶加工過程中的動態變化Fig.6 Changes in tea polyphenols,gallic acid,and catechin contents in the bud and the two leaves during Congou black tea processing

本研究表明，不同葉位芽葉在工夫紅茶加工過程中多酚類化合物差異變化體現在在制品中，成品茶中第一葉的TP質量分數較第二葉顯著高17.27%（P＜0.05），第二葉的GA和EGCG含量較第一葉分別顯著提高18.63%和35.16%（P＜0.05）。

2.2.2 茶色素在加工過程中的動態變化

紅茶加工過程中品質形成的關鍵是揉捻和發酵工序，通過揉捻，葉片組織結構和葉肉細胞被破壞，位于細胞質中的兒茶素等多酚化合物被PPO、過氧化物酶（peroxidase，POD）氧化，形成茶黃素類、茶紅素類、茶褐素類等關鍵品質成分，從而使產品表現出紅湯紅葉的特征品質。其中，茶黃素類影響茶湯亮度、強度和鮮度，是形成茶湯“金圈”的主要成分，茶紅素類影響茶湯的口感和茶湯顏色[25]，兩者共同構成紅茶滋味鮮、醇，茶湯亮，葉底紅的品質特點。茶褐素類含量與紅茶品質成負相關，易使紅茶茶湯發暗、滋味無收斂性、葉底暗褐，對紅茶品質不利。

由圖7A可知，不同葉位芽葉在加工過程中茶黃素含量呈先增后減的動態變化趨勢，芽、第一葉、第二葉、莖、一芽二葉在揉捻階段茶黃素質量分數達到最大值，分別為0.74%、0.96%、0.94%、1.21%、1.02%。其中，第一葉、第二葉、一芽二葉的揉捻葉中茶黃素質量分數差異不顯著（P＞0.05），較萎凋葉分別高5.13、7.06、9.94 倍。成品茶中第一葉、第二葉、一芽二葉茶黃素質量分數差異不顯著（P＞0.05），較萎凋葉分別高2.99、4.04、6.10 倍。芽、第一葉、莖、一芽二葉茶紅素含量在揉捻時達到最大值（圖7B），分別為4.95%、6.38%、7.05%、7.14%，揉捻后質量分數趨于穩定。成品茶中第一葉與一芽二葉茶紅素質量分數差異不顯著（P＞0.05），但第一葉與第二葉差異顯著（P＜0.05），第一葉較第二葉高27.62%，較一芽二葉高10.59%。由圖7C可知，不同葉位的茶褐素含量均在揉捻階段增加迅速，后期過程中緩慢增加，這同樣與揉捻破壞細胞完整性有關。第一葉與第二葉、一芽二葉成品茶褐素質量分數差異顯著（P＜0.05），其中第一葉成品茶茶褐素質量分數較第二葉高10.35%，較一芽二葉高13.32%。這是因為第一葉茶紅素含量高于第二葉、一芽二葉，在酶促氧化反應中生成了更多的茶褐素。

圖7 不同葉位葉片的茶黃素（A）、茶紅素（B）、茶褐素（C）在工夫紅茶加工過程中的動態變化Fig.7 Dynamic changes in theaflavins (A),thearubigins (B) and theabrownines (C) contents in the bud and the two leaves during Congou black tea processing

茶葉發酵指多酚類化合物被酶類物質氧化的過程，目前對紅茶發酵程度的判定以時間、溫度、色澤、香氣、生化指標為標準[26]，本研究以酚類化合物的氧化率來判定不同葉位芽葉的發酵程度。由表2可知，第一葉和第二葉中TC、EGCG、EGC、ECG的氧化率差異不顯著（P＞0.05）。Muthumani等[27]研究表明，紅茶加工中兒茶素組分氧化率依次為EGC＞EGCG＞ECG，而本研究3 種兒茶素組分的氧化率比較中，不同葉位均是EGCG的氧化率最大，且第一葉和第二葉的氧化率順序（EGCG＞ECG＞EGC）一致，Jiang Yongwen等[28]的研究也證實EGCG在發酵中消耗量最高。

表2 不同葉位葉片在工夫紅茶加工過程中的氧化率比較Table 2 Comparison of oxidation degrees of the one bud and two leaves at different leaf positions during Congou black tea processing

2.3 葉綠素組分在工夫紅茶加工過程中的動態變化

不同葉位芽葉的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素類總量在加工過程中均下降，且在干燥階段呈快速下降的動態變化（圖8A～C）。其中，第一葉成品茶葉綠素a、葉綠素b、總量較鮮葉分別減少了95.81%、86.69%、55.90%，第二葉成品茶葉綠素a、葉綠素b、總量較鮮葉分別減少了96.38%、91.52%、67.26%，一芽二葉成品茶葉綠素a、葉綠素b、總量較鮮葉分別減少了93.63%、80.36%、49.15%。脫鎂葉綠素a、脫鎂脫葉綠醇基葉綠素的含量在整個加工過程中呈上升趨勢（圖8D、E），揉捻結束后含量增加明顯。這是由于揉捻葉中的細胞受損，pH值降低，使呈綠色的葉綠素發生脫鎂反應生成黑色或褐色產物[29]。第一葉和第二葉成品茶的脫鎂葉綠素a和脫鎂脫葉綠醇基葉綠素分別較鮮葉高102.03%、434.34%和135.07%、372.04%，第二葉的脫鎂葉綠素a和脫鎂脫葉綠醇基葉綠素較第一葉分別高29.73%和44.17%。由圖8F可知，在工夫紅茶加工過程中，葉綠素a?、葉綠素b?、原焦脫鎂葉綠酸a僅在干燥階段檢測出來，第一葉和第二葉的含量均差異顯著（P＜0.05），第二葉的含量較第一葉分別高3.77%、15.47%、12.43%。當葉綠素被破壞時，工夫紅茶色澤由黑色的脫鎂葉綠素、墨綠色的脫鎂脫葉綠醇基葉綠素、殘留的綠色葉綠素影響。由圖8可知，不同葉位葉片的葉綠素組分無論在整個加工過程中如何變化，第二葉含量始終顯著高于第一葉（P＜0.05），即成熟度較高的第二葉比第一葉更易在色澤上呈現綠色或暗綠色。

圖8 不同葉位芽葉的葉綠素組分在工夫紅茶加工過程中的動態變化Fig.8 Dynamic changes in chlorophyll components of the one bud and two leaves at different leaf positions during Congou black tea processing

3 結論

本研究從加工工藝和加工原料兩個方面探究工夫紅茶加工過程中不同葉位葉片結構變化、不同葉位芽葉酚類化合物和葉綠素組分的含量變化及其品質響應，以期為加工優質工夫紅茶在原料的選擇、加工工藝方面提供一定的理論依據。并希望通過此研究結果闡明實際加工過程中以一芽二、三葉為鮮葉原料的工夫紅茶出現葉底青張的原因，以期為優質紅茶的加工及品質評價提供一定的指導。

工夫紅茶具有“紅湯紅葉”的品質特征[30]，但以一芽二、三葉為原料制成的工夫紅茶多存在色澤枯暗，湯色欠紅，葉底青張、花雜等現象[31]。“青張”是茶葉感官審評葉底的術語，表示夾雜青色葉片。本研究表明，不同葉位芽葉在工夫紅茶加工過程中色澤會逐漸由綠變紅，經干燥可制成烏黑油潤帶金毫的成品茶，但第二葉的紅變程度弱于其他部位。分析發現第一、二葉在揉捻時液泡及葉綠體均被破壞，表明不同葉位葉片的發酵是同階段同步進行的；鮮葉中PPO和POD活力以莖梗部位含量最高，其他部位會隨著葉片的成熟度而降低[32-33]。此外，茶色素的形成不僅與酶活力有關[34]，還與底物的含量有關[35]。本研究中，第二葉鮮葉的TC、EGCG、ECG含量均顯著低于第二葉（P＜0.05），EC、EGC含量顯著高于第一葉（P＜0.05）。第二葉的兒茶素氧化與第一葉和芽同步，且氧化率也沒有顯著性差異（P＞0.05），說明在加工過程中揉捻和發酵工藝對第二葉有同樣的效率。

葉綠素組分分析結果顯示，加工過程中不同葉位芽葉的葉綠素a、葉綠素b含量以及葉綠素類總量均下降，脫鎂葉綠素、脫鎂脫葉綠醇基葉綠素含量均上升，與Li Jia等[36]的研究結果一致。加工過程中第二葉的葉綠素組分含量均顯著高于第一葉（P＜0.05），這使得第二葉葉底色澤較第一葉更綠。由此可以推測，葉底青張現象與葉片中脂溶性色素的葉綠素含量有關，與不同葉位葉片的發酵程度無關，即葉底青張受原料的成熟度影響。

本研究表明揉捻工藝也是影響工夫紅茶色澤及品質成分的重要工序。目前的傳統加工工藝對一芽二、三葉原料加工優質工夫紅茶有效，該結果可為加工優質工夫紅茶提高茶樹鮮葉的利用率提供一定的理論依據。此外，葉綠素及其降解產物對紅茶滋味、湯色、香氣無重要貢獻[30]。因此，對一芽二、三葉制得的工夫紅茶品質評價時，建議不應對其葉底青張現象扣分。