擠壓膨化處理對藜麥營養成分及體外酵解特性的影響

方 芳，何雨芯，趙巨堂，胡夢偉，聶少平，謝明勇，胡婕倫

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，中國-加拿大食品科學與技術聯合實驗室（南昌），江西省生物活性多糖重點實驗室，江西 南昌 330047）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）又稱南美藜、印第安麥、奎藜等，是一種原產于南美的莧科藜亞科藜屬植物，起源于南美洲安第斯山脈地區，種植歷史悠久，被稱為“糧食之母”和“安第斯山的黃金‘谷物’”[1]。藜麥的主要產區位于秘魯、玻利維亞和厄瓜多爾等中高海拔地區[2]，我國藜麥主要種植在青藏高原、云貴高原、西北地區等[3]。藜麥作為一種全營養“偽谷物”，含有優質的蛋白質、比例均衡的氨基酸，因此深受消費者喜愛[4]，此外，藜麥還含有膳食纖維、皂苷、植物甾醇、酚類物質、維生素和礦物質等營養素[5-10]，聯合國糧食和農業組織報告[11]指出藜麥是唯一一種滿足人體基本營養需求的單體植物。

大量研究表明，腸道微生態失衡將會導致一系列代謝疾病[12]，如肥胖、糖尿病、炎癥性腸病等，而腸道菌群在調節腸道微生態方面發揮著無可替代的作用[13]。腸道菌群是人體胃部以及腸道部位中微生物的總稱[14-15]，以厚壁菌門（60%～80%）和擬桿菌門（20%～40%）為主[16]。腸道菌群會隨飲食習慣而改變，并隨時間推移穩定存活于宿主體內[17]。近年來，眾多研究表明藜麥具有抗氧化[18]、預防肥胖[19]、緩解炎癥[20]、調節血糖水平[21]以及改善腸道菌群[22]等作用，而這與藜麥所含的營養成分息息相關，以干質量計算，藜麥中淀粉質量分數約為52%～69%[2]，膳食纖維質量分數約為10%[23]，蛋白質量分數最高可達22.08%[24]，脂肪質量分數約為5.5%～7.8%[25]，其中藜麥膳食纖維可以到達大腸，并作為腸道菌群可利用的碳源影響其生長，提示通過藜麥飲食干預可以調控腸道微生態，從而達到預防疾病的目的。

藜麥的常見加工處理方式有蒸煮、焙烤、擠壓膨化和發酵等[26-27]，其中擠壓膨化技術效率高、連續性強，在我國得到迅速的發展與推廣，并被廣泛應用于雜糧加工行業[28]。當前，關于擠壓膨化加工藜麥的研究主要集中在生產工藝的優化方面，鮮見不同加工方式藜麥營養成分及其對人體腸道菌群影響的報道。目前體外發酵和動物實驗是研究腸道菌群的主要方法，其中體外發酵耗時短、財力物力投入低，并且容易控制實驗參數，實驗重復性高[29]，是初步驗證實驗的最佳選擇。在有效時間內，新鮮人類糞便具有與人體腸道菌群相似的菌群特性，因此，可通過藜麥制品在新鮮人類糞便培養基中的發酵行為來表征其對腸道菌群的影響。此外，在發酵過程中腸道菌群產生的代謝產物，如乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），會對機體產生積極的影響[30]，同時還可以降低結腸內環境pH值，促進部分有益細菌的生長[31]。本研究利用擠壓膨化技術加工藜麥，測定藜麥在加工前后淀粉、膳食纖維、脂肪以及蛋白質含量等，通過體外酵解模型分析藜麥擠壓膨化樣品在人體糞便培養基中的產氣量、pH值、SCFAs濃度以及腸道菌群組成，為藜麥加工產品改善人體腸道菌群研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥 繁峙縣綠山莊糧油加工有限公司；總淀粉、直鏈淀粉、膳食纖維試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；無水乙醇、碳酸鈉、氫氧化鈉、硼酸、亞硝酸鈉（均為分析純） 廣州西隴科學股份有限公司；α-耐熱淀粉酶、胃蛋白酶、胰脂肪酶、沒食子酸、嗎啉乙磺酸、三羥甲基氨基甲烷 美國Sigma-Aldrich公司；豬膽粉 上?？道噬锟萍加邢薰?；蛋白胨、酵母膏粉、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物、膽鹽、VK1、吐溫-80、血紅素、菊粉以及SCFAs（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸）標準品 上海阿拉丁試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4、0.01 mol/L）北京索萊寶科技有限公司；糞便DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

Varioskan Flash全波長多功能酶標儀、NanoDrop超微量分光光度計 美國Thermo公司；DSH-50A-1水分測定儀 上海佑科儀器儀表有限公司；KN680全自動凱氏定氮儀 濟南阿爾瓦儀器有限公司；DFM-1000C高速打粉機 溫嶺市林大機械有限公司；XL-70雙螺桿擠壓膨化機 濟南希朗機械有限公司；YXQ-100SII高壓滅菌鍋 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；FE-28臺式pH計 梅特勒-托利多國際貿易有限公司；VOSHINCOS-100 B數顯恒溫搖床 無錫沃信儀器有限公司；厭氧手套箱 美國COY公司；7890B氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；ND200-24A氮氣吹掃儀 上海左樂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥擠壓膨化樣品的制備

藜麥籽?！鬯椤^0.150 mm篩→調節水分質量分數約為22%→喂料→擠壓膨化（膨化溫度140 ℃、螺桿轉速200 r/min）→粉碎后過孔徑0.150 mm篩。

1.3.2 基本營養成分分析

采用水分測定儀測定水分含量；灰分含量測定參考GB 5009.4-2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》；蛋白質含量參照全自動凱氏定氮儀說明書進行測定；總淀粉、直鏈淀粉、膳食纖維含量參照相應試劑盒說明書進行測定；脂肪含量采用GB/T 5009.6-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法測定。

1.3.3 體外模擬消化

體外模擬消化參考課題組前期的研究方法[32]，配制口腔模擬消化液（simulated stomatic fluid，SSF）、胃模擬消化液（simulated gastric fluid，SGF）和小腸模擬消化液（simulated intestinal fluid，SIF），用1 mol/L鹽酸或1 mol/L NaOH溶液調節pH值（下同）。準確稱取0.455 g藜麥擠壓膨化樣品置于錐形瓶中，加入4.545 mL蒸餾水復溶[33]，混勻。向混合樣品中加入等體積SSF，調節體系pH 7，將離心管置于搖床（黑暗、180 r/min、37 ℃，下同）中振蕩孵育2 min。將模擬口腔消化后的樣品取出，迅速加入等體積SGF，調節體系pH 3，繼續置于搖床中孵育2 h。取出模擬胃部消化物后，立刻加入等體積SIF，調節體系pH 7，繼續置于搖床中孵育2 h，然后將裝有樣品的錐形瓶置于95 ℃水浴鍋中加熱5 min，得到藜麥擠壓膨化樣品體外消化產物，凍干后常溫保存于干燥器中。

1.3.4 體外酵解實驗

1.3.4.1 培養基配制

根據課題組前期研究方法[34]配制基礎培養基。分別將1.3.3節藜麥體外消化后樣品、菊粉、去離子水以質量分數0.5%添加到基礎培養基中，混勻后調節體系pH 6.0，分別記為QUI組、陽性對照（AC）組和空白對照（CK）組培養基。分別取5 mL各組培養基加入Hungate厭氧管中，使用氮氣吹掃儀排盡空氣，然后用高壓滅菌鍋滅菌（121 ℃、15 min），滅菌完成轉移至厭氧培養箱中。

1.3.4.2 擠壓膨化藜麥體外酵解

招募身體健康、無胃腸道病史、具有良好的飲食習慣且3 個月內未服用抗生素等藥物及含有益生菌的食品或藥品的志愿者。分別收集6 名志愿者（年齡在22～26 歲，3 名女性和3 名男性）的新鮮糞便：在約定時間內同時采集6 名志愿者糞便，采集后立即將糞便轉移至厭氧手套箱，按照25 g/100 mL加入含有0.1%（質量分數）L-半胱氨酸鹽酸的磷酸鹽緩沖液稀釋，渦旋均勻后靜置5 min，將上清液經4 層無菌紗布過濾，得糞便濾液，等體積混合6 名志愿者的糞便濾液。

厭氧環境（5%（體積分數，后同）H2、5% CO2、90% N2）下用1 mL注射器將0.1 mL混合糞便濾液加入Hungate厭氧管中（糞便從收集到接種的間隔時間不應超過2 h），置于37 ℃的黑暗厭氧環境下振蕩（180 r/min）培養，在0、6、12、24、48 h分別取出厭氧管，將發酵液迅速轉移至無菌EP管中，隨后立即凍存于－80 ℃冰箱。每組每個時間點設置3 個平行。

1.3.4.3 發酵液中pH值的測定

采用臺式pH計測定發酵液的pH值。

1.3.4.4 發酵液中產氣量的測定

將一次性注射器活塞推至0刻度處，將注射器針尖刺入厭氧管內，注射器活塞在厭氧管內氣壓作用下自由移動，活塞指示體積的變化量即為產氣量，單位為mL。

1.3.4.5 SCFAs濃度的測定

采用氣相色譜法[35]測定發酵液中SCFAs濃度。取發酵液12000hg、4 ℃離心10 min，取0.5 mL上清液分別加入1.2 mL無水乙醇、1 mL正己烷和0.1 mL質量分數98%濃硫酸酯化萃取SCFAs，置于60 ℃搖床（250 r/min）中振蕩，充分反應 1 h后靜置分層，取有機相（上層溶液）經0.22 μm有機濾膜過濾，采用氣相色譜測定SCFAs濃度。

氣相色譜條件：7890 B氣相色譜儀配備19091J-413 HP-5色譜柱（0.32 mmh 30 m，0.25 μm）；載氣為N2；分流比為1∶40；火焰離子化檢測器；升溫程序為30 ℃、3.5 min，5 ℃/min升至40 ℃，15 ℃/min升至180 ℃，保持10 min；進樣量為1 μL；進樣口溫度200 ℃。

1.3.4.6 腸道菌群組成的鑒定

將1.3.4.2節凍存于－80 ℃下發酵48 h所得的樣品進行腸道菌群分析。采用糞便DNA提取試劑盒提取DNA，采用NanoDrop 2000對DNA樣本進行質量分析。利用引物515F（5’-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rRNA的V4區進行PCR擴增，并用2%（質量分數）的瓊脂糖凝膠進行電泳，對目標條帶進行切膠回收，采用DNA回收試劑盒回收純化DNA，采用2100生物分析儀系統（高靈敏度DNA芯片）檢測文庫質量。最后通過Illumina MiSeq平臺對獲得的DNA片段進行配對末端測序，將得到的數據通過QIIME軟件進行物種鑒定分析[36]，利用派森諾基因云網站（https://www.genescloud.cn）對腸道菌群進行α-多樣性分析、β-多樣性分析及主成分分析（principal component analysis，PCA），并繪制腸道菌群門、屬相對豐度柱狀圖。

1.4 數據處理與分析

實驗設置以3 次重復，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析，采用獨立樣本t檢驗和Tukey檢驗進行顯著性分析，P＜0.05則認為差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 擠壓膨化處理前后藜麥基本營養成分含量

如表1所示，與未處理的藜麥相比，擠壓膨化后的藜麥灰分、總淀粉以及蛋白質含量并無顯著性差異（P＞0.05），與李敏等[37]的研究結果一致。相比未處理的藜麥，擠壓膨化后藜麥中直鏈淀粉含量顯著下降（P＜0.05），同時脂肪含量也顯著降低（P＜0.05），這可能是由于脂肪酸在高溫加熱的過程中發生氧化和氫化作用，與直鏈淀粉形成復合物，最終導致含量下降[38]。與未加工藜麥相比，加工后藜麥的總膳食纖維含量顯著下降（P＜0.05），值得注意的是，不可溶性膳食纖維含量顯著下降的同時可溶性膳食纖維含量顯著上升。相似地，燕麥、大豆、玉米經過擠壓膨化后，可溶性膳食纖維含量均顯著上升[39-40]，該現象出現的原因可能是擠壓膨化的加熱過程使不可溶性膳食纖維裂解，轉化為可溶性成分[41]。

表1 擠壓膨化處理前后藜麥的基本營養成分含量Table 1 Nutritional components of quinoa before and after extrusion treatment

2.2 體外酵解過程中pH值、產氣量的變化

pH值從一定程度上可以反映發酵培養基中碳水化合物的消耗程度以及SCFAs的產生情況[42]。從圖1A可以看出，CK和AC組pH值在發酵0～12 h明顯下降，并在12 h時pH值最低（分別為6.78、4.18），而QUI組在發酵6 h時pH值（5.48）最低。之后，各組pH值均呈現上升趨勢，在發酵24～48 h時達到穩定并持續至酵解結束。研究表明，pH值上升的情況可能是由于腸道微生物利用二氧化碳產生甲烷，或培養基中的蛋白質分解產生NH3，NH3與酸反應生成NH4＋[43]。體外酵解到達48 h時，pH值依次為CK組（7.18）＞QUI組（5.99）＞AC組（4.78），各組pH值相較于初始值均有所下降。

腸道菌群能利用碳水化合物、蛋白質、多酚等物質酵解產生二氧化碳，氫氣、硫化氫和甲烷等氣體，產氣量一定程度上可以反映菌群的代謝情況。由圖1B可知，各組的產氣量在0～48 h體外發酵期間一直保持上升，QUI組和AC組在0～12 h產氣量大幅增加，產氣速率也最快，表明在該階段腸道微生物代謝旺盛，這可能是由于藜麥擠壓膨化樣品和菊粉含有大量的不可消化淀粉（抗性淀粉、膳食纖維、低聚糖等）[44-45]，在酵解前期淀粉類物質的發酵速率比其他物質更快[46]。隨著發酵時間的延長，產氣量仍在不斷增加但氣體產生速率在逐漸下降，可能是菌群發酵后期主要消耗二氧化碳產生甲烷氣體，或菌群發酵利用蛋白質所產生的氨氣與酸性氣體發生反應，從而導致產氣速率下降[43]。在發酵48 h時各組產氣量最高，依次為AC組（4.57 mL）＞QUI組（3.63 mL）＞CK組（3.03 mL）。

圖1 體外發酵過程中pH值（A）、產氣量（B）的變化Fig.1 Changes in pH (A) and gas production (B) during in vitro fermentation

2.3 體外酵解過程中SCFAs的產生情況

如圖2A所示，各組總SCFAs濃度隨時間的延長持續上升，其中QUI組在發酵24 h后基本保持穩定。AC組和QUI組在0～6 h內SCFAs產生速率最快，而CK組直至發酵12 h后SCFAs產生速率才有所降低，這與2.2節產氣量以及pH值的變化趨勢相印證。發酵48 h時，總SCFAs濃度依次為：AC組（49.70 mmol/L）＞QUI組（37.08 mmol/L）＞CK組（23.78 mmol/L）。AC組和CK組乙酸濃度呈增加趨勢（圖2B），QUI組在發酵24～48 h期間基本保持不變。發酵48 h時，AC組、QUI組和CK組乙酸濃度分別為27.06、18.68、12.11 mmol/L。如圖2C所示，QUI組產丙酸情況與AC組相近，在48 h時兩組丙酸濃度無顯著性差異（P＞0.05），而CK組顯著低于其余兩組（P＜0.05）。從圖2D可以看出，QUI組發酵期間產丁酸濃度明顯低于AC組，同時明顯高于CK組。各組戊酸濃度隨發酵時間延長而持續增加（圖2E），AC組增長速率幾乎不變并且發酵48 h后顯著高于其他兩組（P＜0.05），QUI組和CK組在發酵24 h后速率降低。如圖2F、G所示，發酵前期（0～6 h）各組均產生較少的異丁酸、異戊酸，約在6 h后各組異丁酸、異戊酸濃度出現明顯的增長趨勢，QUI組產異丁酸、異戊酸能力均最強，其次是CK組，AC組最弱。此外，發酵48 h后QUI組不同SCFAs濃度均高于CK組。

圖2 體外發酵過程中SCFAs濃度的變化Fig.2 Changes in the concentrations of SCFAs during in vitro fermentation

作為主要的SCFAs，乙酸、丙酸、丁酸發揮的功能各異。研究表明，乙酸能被大腦、心臟和外周組織氧化利用，是宿主吸收利用能量的主要來源；丁酸作為結腸上皮細胞的重要能量來源，具有抗炎特性并能預防、抑制癌癥的發生，同時還可以促進細胞分泌胰島素；丙酸能抑制內源性膽固醇的合成[47-50]。各組酵解樣品產生SCFAs的情況表明，QUI組的產酸能力總體介于CK和AC組之間，且由發酵48 h后SCFAs濃度分析結果可知乙酸產量＞丙酸產量＞丁酸產量，這與前期研究結果[51]一致，表明藜麥擠壓膨化樣品能一定程度影響腸道菌群代謝物的產生，在腸道和肝臟代謝中發揮重要作用，調節宿主的健康。

2.4 體外發酵液腸道菌群的多樣性分析結果

在α-多樣性分析中，常采用Chao 1指數和Shannon指數表征菌群多樣性，Chao 1指數越大，菌群豐度越高；Shannon指數越大，則表明菌群多樣性越高。從圖3A、B可以看出，各組Chao 1指數依次為CK（440.48）＞QUI（368.91）＞AC（365.50）；各組Shannon指數依次為QUI（5.41）＞AC（4.92）＞CK（4.87）；相較于CK組，QUI組腸道微生物豐度顯著降低但多樣性顯著提高。在β-多樣性分析中，PCA可以表征不同菌群結構組成的差異性，樣本之間距離越遠說明菌群結構差異越大。從圖3C中可以看出，3 組發酵液中腸道菌群結構差異性較大，其中AC組與CK組差異性最大，而QUI組與AC組之間的菌群差異性小于與CK組的差異性，說明藜麥擠壓膨化樣品培養發酵會對腸道菌群結構產生一定程度的影響。

圖3 體外發酵48 h腸道菌群的多樣性分析結果Fig.3 Diversity analysis of gut microbiota after 48 h of in vitro fermentation

2.5 體外發酵液腸道菌群微生物組成分析結果

體外發酵結束后，QUI組、AC組和CK組腸道菌群在門、屬水平的微生物組成如圖4A、B所示。3 組樣本中相對豐度較高的4 個菌門的分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）及放線菌門（Actinobacteria）。其中，與CK組相比，AC組和QUI組擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門相對豐度明顯增加，變形菌門明顯減少，這種變化趨勢對于宿主健康有一定的積極意義，因為變形菌門中包括大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等病原菌，降低該菌門的菌能對腸道健康具有一定的積極意義。擬桿菌門和厚壁菌門豐度的增加可能與藜麥擠壓膨化樣品中的膳食纖維含量變化有關[52]。研究表明，厚壁菌門能通過非致病性途徑刺激機體免疫功能，促進宿主對食物中維生素、礦物質等營養成分的吸收與合成；擬桿菌門主要促進上皮細胞的發育和營養吸收[53]；放線菌是抗生素、酶抑制劑、免疫調節劑等多種化合物的次級代謝產物[54]。

如圖5所示，在科、屬水平上，相較于CK組，QUI組能顯著降低菌群中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）及瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的相對豐度（P＜0.05），同時顯著增加普雷沃氏菌（Prevotella）、巨單胞菌（Megamonas）、巨球形菌（Megasphaera）、考拉桿菌（Phascolarctobacterium）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）和擬桿菌（Bacteroides）相對豐度（P＜0.05）。據報道，普雷沃氏菌數量的增加與高膳食纖維飲食有關，并且該菌屬能有效抑制氨、胺和吲哚等腫瘤誘導因子的產生[55]。巨單胞菌經研究證明與非淀粉多糖的降解有關，在預防肥胖方面發揮重要作用[56]，該菌屬可能是亞洲人群的特征菌屬[57]。巨球形菌相對豐度的增加可能與藜麥擠壓膨化樣品中所含的非消化性淀粉有關[58]，考拉桿菌能增強胃腸道機能、降低炎癥水平[59]。雙歧桿菌能幫助宿主吸收營養，增強免疫力，如治療腹瀉、便秘、腸易激綜合征等腸道疾病[60]，擬桿菌作為人體重要的共生菌，在人體消化食物以及獲取營養和能量方面起關鍵作用[61]。而腸桿菌科和瘤胃菌科則被大量實驗證明與腫瘤、炎癥等疾病正相關[62-63]。

圖5 體外發酵48 h后幾種主要科、屬菌群的相對豐度Fig.5 Relative abundance of several major families and genera after 48 h of in vitro fermentation

3 結論

本實驗比較擠壓膨化處理前后藜麥的基本營養成分含量的變化，并通過體外酵解實驗發掘藜麥擠壓膨化后樣品的酵解特性。結果表明，擠壓膨化加工后，藜麥灰分、總淀粉以及蛋白質含量并無顯著變化（P＞0.05），其直鏈淀粉、脂肪以及總膳食纖維含量、不可溶性膳食纖維含量顯著下降（P＜0.05），且可溶性膳食纖維含量顯著增加（P＜0.05）。藜麥擠壓膨化制品在體外酵解中能一定程度上增加糞便腸道菌群的多樣性，顯著上調普雷沃氏菌、巨單胞菌、巨球形菌、考拉桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌的相對豐度（P＜0.05），并顯著下調瘤胃菌科和腸桿菌科的相對豐度（P＜0.05）。此外，擠壓膨化處理藜麥酵解48 h后不同SCFAs濃度均高于CK組。本研究結果可為藜麥擠壓膨化制品及其調節腸道功能相關產品的開發提供一定的理論依據。