魚腥草對葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠潰瘍性結腸炎的緩解及保護作用

鄧代霞，李鳳蘭，李潮云，付 平，吳天祥,2,*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州食品工程職業學院，貴州 貴陽 551400）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以腸黏膜損傷、潰瘍、炎癥為主要特征的炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）[1]，主要發病于直腸和結腸，在臨床上，常見的IBD還包括克羅恩病[2-3]。由于UC具有易發作、難治愈、病因病機尚不明確等特性，世界衛生組織將其列為難治病癥之一[4]。目前普遍認為UC的發病機制與遺傳、環境、免疫異常、腸道菌群紊亂等相關，由諸多因素相互作用引起[5-7]。其臨床癥狀表現為體質量減輕、腹痛、腹瀉、糞便帶血或嚴重血便，嚴重者可誘發結直腸癌[8]。據統計，我國UC的發病率逐年上升[9-10]。目前，常用的治療IBD的藥物種類主要以氨基水楊酸、免疫抑制劑、糖皮質激素等為主[3,11]。但長期服用副作用大、可引起諸多不良反應。一些傳統中草藥具有較好的抗炎效果，且中草藥具有高效、副作用小等特點，因此，從天然資源中開發新型藥物得到廣大研究者的關注[12]。

魚腥草（Houttuynia cordata）又名折耳根、蕺菜，含有豐富的營養物質，其味辛、性微寒，主要產于貴州、四川、云南等西南地區，作為貴州常見的藥食同源食物之一[13-14]，魚腥草主要含有多糖、脂肪酸、揮發油、多酚、生物堿、黃酮、萜類等生物活性物質[15]，具有清熱解毒、利尿通淋[16]、抗炎抗菌[17]、抗病毒[18]、抗腫瘤[19]等作用。

目前，魚腥草抗炎藥理療效已取得一定的研究成果，相關研究表明，魚腥草素可增加動脈粥樣硬化模型大鼠體內白細胞介素（interleukin，IL）-10水平，降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6及IL-1β水平，從而發揮抗炎療效[20]。魚腥草的水提物可以降低乙酰氨基酚誘導的小鼠肝損傷體內IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平[21]，吳蘋等[22]研究發現魚腥草多糖能降低結腸炎小鼠血清中促炎因子、血清肌酐、谷丙轉氨酶等的含量，調節腸道菌群紊亂及減輕腸道損傷，董晶等[23]證實魚腥草多酚可通過降低結腸炎小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子水平緩解腸道炎癥反應，根據現有報道，魚腥草在治療結腸炎方面的研究還比較少，故本實驗采用質量分數3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）溶液構建UC小鼠模型，評價魚腥草鮮汁對小鼠UC的緩解效果，以豐富魚腥草治療結腸炎的基礎研究，更好地驗證魚腥草對小鼠結腸炎的改善作用，為魚腥草功能性產品的開發提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6J雄性小鼠，8 周齡，體質量（22±2）g，SPF級，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。所有小鼠飼養于貴州大學釀酒與食品工程學院實驗動物中心，飼養條件：12 h/12 h明暗交替，溫度20～24 ℃，相對濕度60%～80%，動物實驗經貴州大學動物實驗倫理委員會批準（編號：EAE-GZU-2021-P008）。

小鼠基礎飼料、墊料購于重慶騰鑫生物技術有限公司；魚腥草產于貴陽市花溪區，洗凈后不添加水直接榨成魚腥草汁。

DSS 美國MP Biomedical公司；美沙拉嗪腸溶片葵花藥業集團佳木斯鹿靈制藥有限公司；糞便隱血試劑盒 江蘇艾迪生生物科技有限公司；質量分數4%多聚甲醛溶液 武漢賽維爾生物有限公司；TNF-α、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白質定量試劑盒（bicinchonininc acid，BCA）、D-乳酸（D-lactic acid，D-La）、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）試劑盒泉州市睿信生物科技有限公司；其他用于本實驗的化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CP114型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；GL-200G-II型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；SPECTRA MAX 190型酶標儀 昆明納瑞科技有限公司；RM2016型病理切片機 德國徠卡儀器有限公司；Pannoramic DESKP-MIDIP250型掃描儀 匈牙利3Dhistech公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

所有小鼠適應性喂養一周后，隨機分為6 組：空白組、模型組、陽性組及魚腥草汁低、中、高劑量組，每組12 只。除空白組外，其余各組采用質量分數為3% DSS溶液建立UC小鼠模型，小鼠連續自由飲用7 d。于建模后第4天，按照0.1 mL/10 gmb的劑量開始灌胃不同試劑，其中空白組和模型組灌胃生理鹽水，陽性組灌胃美沙拉嗪（劑量200 mg/kgmb），低劑量組灌胃魚腥草汁（稀釋4 倍），中劑量組灌胃魚腥草汁（稀釋2 倍），高劑量組灌胃魚腥草原汁，連續灌胃10 d。

1.3.2 疾病活動指數評分

實驗期間，每天早上9∶00稱量小鼠體質量，并觀察小鼠糞便性狀及隱血情況，采用糞便隱血試劑盒測定糞便隱血分數，根據文獻[24]中的方法，計算疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分，具體評分標準見表1。DAI評分計算方法如公式（1）所示。

表1 DAI評分標準Table 1 Criteria for DAI evaluation

1.3.3 結腸長度的測定

解剖小鼠后，快速分離結腸，用鑷子輕輕水平拉直，用直尺測量長度并記錄。

1.3.4 免疫器官指數測定

解剖小鼠后，快速分離胸腺、脾臟，稱量并記錄其濕質量，按照公式（2）計算免疫器官指數。

1.3.5 血清LPS水平及D-La濃度測定

取小鼠血液靜置30 min后，3000 r/min離心15 min，取血清于離心管中備用，按照試劑盒說明書測定血清LPS水平及D-La濃度。

1.3.6 結腸組織炎癥因子的測定

用預冷的pH為7.2的0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液沖洗小鼠結腸組織并剪碎，在冰上研磨制成勻漿液，根據BCA試劑盒測定結腸組織蛋白質濃度后，再按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測步驟測定小鼠結腸組織中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10質量濃度。

1.3.7 結腸組織氧化應激水平的測定

根據試劑盒操作說明書測定小鼠結腸組織中SOD、MPO活力和MDA含量。

1.3.8 組織病理學檢查

解剖小鼠后，取距肛門處1～2 cm的結腸組織，置于質量分數為4%的中性甲醛溶液固定24 h后，經修剪、脫水浸蠟、包埋、切片（厚度4 μm）、蘇木精-伊紅染色法染色、封片后，在掃描儀下觀察各組的腸黏膜病理變化，并用相機采集圖像，參考文獻[24-25]中的方法進行組織病理學評分，具體評分標準見表2。

表2 結腸組織病理學評分標準Table 2 Criteria for histopathological evaluation of colon tissues

1.4 數據處理與分析

實驗數據用平均值±標準差表示，使用Origin 2021軟件作圖，利用SPSS 26.0軟件進行數據分析，使用單因素方差分析進行顯著性分析，P＜0.05表示數據具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 魚腥草汁對UC小鼠體質量及DAI評分的影響

空白組小鼠在飼養期間反應靈敏、精神狀況良好，糞便性狀無異常；與空白組相比，模型組小鼠從飼養第5天開始出現精神萎靡、稀便、血便等癥狀；與模型組相比，魚腥草汁低、中、高劑量組的小鼠精神狀態有所好轉且稀便和血便情況明顯改善。

如圖1所示，與空白組比較，模型組小鼠的體質量從第3天開始降低，持續降低至喂養結束，魚腥草汁低、中、高劑量組與模型組比較，雖從第3天開始仍呈現降低趨勢，但體質量均有所提高，DAI評分也有所降低；第14天，與模型組小鼠相比，魚腥草汁低、中、高劑量組及陽性組小鼠體質量分別增加了26.70%、30.14%、35.54%、39.82%（P＜0.01），DAI評分分別降低了26.54%、32.97%、53.99%、58.68%（P＜0.01），呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最好，效果接近陽性組。

圖1 小鼠體質量（A）和DAI評分（B）Fig.1 Body mass (A) and DAI score (B) of mice

DAI評分升高、體質量減輕、隱血、便血等是結腸炎重要特征[8]，相關研究發現魚腥草多糖可以降低結腸炎小鼠DAI評分，緩解腹瀉及便血程度[22]，本研究結果與此一致，與模型組比較，實驗末期魚腥草汁干預組均能減輕小鼠便血程度，中、高劑量干預組小鼠體質量極顯著增加（P＜0.01），DAI評分極顯著降低（P＜0.01），結果表明，魚腥草可以改善UC小鼠生存狀態及臨床癥狀，具有較好的緩解作用。

2.2 魚腥草汁對UC小鼠結腸外觀及長度的影響

如圖2所示，模型組小鼠結腸長度明顯縮短、嚴重充血、黏連。各干預組小鼠結腸仍有部分充血、潰瘍，但較模型組有所減輕，模型組小鼠結腸平均長度為4.60 cm，空白組平均長度為7.17 cm，模型組小鼠結腸平均長度較空白組縮減了2.57 cm，縮短了35.84%（P＜0.01）。與模型組小鼠相比，魚腥草汁低、中、高劑量組結腸長度極顯著增加（P＜0.01），因此，魚腥草汁可以抑制UC小鼠結腸縮短。

圖2 各組小鼠結腸長度Fig.2 Colon length of mice in each group

2.3 魚腥草汁對UC小鼠免疫器官指數的影響

胸腺和脾臟是機體中重要的免疫器官，在小鼠炎癥和免疫反應具有至關重要的作用[26]。如圖3所示，與空白組相比，模型組小鼠胸腺指數極顯著降低（P＜0.01）、脾指數極顯著升高（P＜0.01），經過魚腥草汁干預后，低、中、高劑量組胸腺和脾臟指數逐漸向空白組趨近，其中，高劑量組胸腺指數較模型組升高了59.25%（P＜0.01），脾指數較模型組降低了51.09%（P＜0.01），綜上，魚腥草汁對結腸炎小鼠免疫器官指數具有調節作用。

圖3 魚腥草汁對免疫器官指數的影響Fig.3 Effect of Houttuynia cordata juice on immune organ indexes

2.4 魚腥草汁對UC小鼠腸道黏膜滲透性的影響

血清D-La濃度和LPS水平可間接反應腸炎小鼠腸道黏膜滲透性[27]。如圖4所示，與空白組小鼠相比，模型組小鼠血清中D-La濃度和LPS水平極顯著升高（P＜0.01），表明腸黏膜屏障功能被破壞；與模型組相比，不同劑量的魚腥草汁均可降低由DSS引起的小鼠血清D-La濃度、LPS水平升高，其中高劑量組血清D-La濃度、LPS水平較模型組分別降低25.92%、45.24%（P＜0.01）。魚腥草有多種功能性成分，其揮發油、萜類化合物、多糖等物質都具有較好的抗炎抗菌效果[15,17]，本研究結果顯示，魚腥草汁能夠降低DSS誘導的UC小鼠腸黏膜的通透性，可能是魚腥草中各種成分相互協同作用，抵御有害病菌及毒物入侵結腸組織，從而減輕UC小鼠腸道黏膜損傷。

圖4 魚腥草汁對血清D-La濃度（A）和LPS水平（B）的影響Fig.4 Effect of Houttuynia cordata juice on serum D-La (A) and LPS levels (B)

2.5 魚腥草汁對UC小鼠結腸組織中炎癥因子的影響

TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10等炎癥因子分泌異常是導致腸道黏膜的炎性損傷的主要原因之一[28]。如圖5所示，與空白組相比較，模型組小鼠的結腸組織中促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平極顯著增加（P＜0.01），抗炎因子IL-4和IL-10分泌水平極顯著降低（P＜0.01），模型組小鼠結腸組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6含量較空白組分別增加了129.53%、126.25%、69.06%、85.49%；而IL-4和IL-10水平較空白組降低了58.27%、41.23%。與模型組小鼠相比，魚腥草汁中、高劑量組促炎因子分泌水平極顯著降低（P＜0.01），抗炎因子分泌水平極顯著升高（P＜0.01），其中，高劑量組TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6水平分別降低了33.21%、44.73%、32.88%、33.03%（P＜0.01）；IL-4、IL-10水平分別升高了76.10%、36.00%（P＜0.01）；前人研究表明DSS誘導的UC小鼠模型中TNF-α、IFN-γ、IL-1β等炎癥因子在血清、結腸組織中表達水平升高[25,29]，Lee等[30]研究發現，魚腥草提取物可以通過抑制促炎因子的表達減輕肥大細胞介導的炎癥反應；秦萍等[31]研究表明，魚腥草揮發油治療膝關節骨性關節炎大鼠后，能抑制血清中TNF-α、IL-1β及IL-6的表達；董晶等[23]研究發現魚腥草多酚抑制了TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子的分泌，本研究與前人研究結果一致。結果表明魚腥草能夠抑制促炎因子的釋放，促進抗炎因子的釋放，減輕結腸炎的炎性反應，保護結腸組織。

圖5 魚腥草汁對炎癥因子分泌水平的影響Fig.5 Effect of Houttuynia cordata juice on inflammatory cytokine levels

2.6 魚腥草汁對UC小鼠氧化應激水平的影響

氧化應激和氧化細胞損傷是結腸炎的重要標志之一[32]，為評價魚腥草汁對小鼠結腸組織氧化應激水平的影響，本實驗測定了小鼠結腸組織中MDA含量和MPO、SOD活力。如圖6所示，與空白組相比，模型組小鼠結腸組織中的MDA含量、MPO活力極顯著升高（P＜0.01），SOD活力極顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，魚腥草汁中、高劑量組小鼠結腸組織中MDA含量較模型組分別降低45.27%、56.16%（P＜0.01），MPO活力分別降低了16.84%、34.05%（P＜0.01），SOD活力分別增加了48.82%、76.37%（P＜0.01）。有相關文獻報道，魚腥草多糖、黃酮具有較強的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基能力[33-34]，馬新方等[35]證明魚腥草多糖可降低衰老小鼠體內MDA含量，提高SOD活力，具有較強的體內抗氧化活性。本研究表明，魚腥草中能調節UC小鼠體內氧化應激水平，與前人研究結果[35]一致，應該是魚腥草中多種功能性成分共同發揮作用減輕UC小鼠結腸組織炎癥反應。

圖6 魚腥草汁對小鼠氧化應激水平的影響Fig.6 Effect of Houttuynia cordata juice on oxidative stress levels of mice

2.7 魚腥草汁對UC小鼠結腸組織病理學及病理學評分的影響

如圖7、8所示，空白組小鼠結腸黏膜結構完整，隱窩結構完整、腺體排列有序、杯狀細胞清晰可見、無炎性細胞浸潤；模型組小鼠結腸黏膜結構被嚴重破壞、嚴重充血、糜爛、隱窩及杯狀細胞減少，大量炎性細胞浸潤。前人研究表明，DSS對小鼠結腸組織結構破壞性較大，引起結腸充血、病菌浸染健康組織，導致大量上皮細胞凋亡[29,32]，本研究模型組結腸病理分析與此結果一致。與空白組相比，模型組病理學評分極顯著升高（P＜0.01）。經過魚腥草汁治療，低劑量組對結腸組織隱窩結構有所修復，炎性細胞較模型組有所減少；中劑量組結腸組織結構較完整，但仍可見部分黏膜結構被破壞、隱窩結構部分丟失，仍有炎癥細胞浸潤；高劑量組小鼠結腸組織損傷較輕、炎性細胞明顯減少、杯狀細胞數量增多、隱窩結構較完整，病理學評分較模型組極顯著降低（P＜0.01），表明魚腥草能保護結腸炎小鼠結腸黏膜不被破壞，對其結腸損傷有緩解作用。

圖7 各組小鼠結腸組織病理切片Fig.7 Pathological sections of colon tissues of mice in each group

圖8 各組小鼠結腸組織病理學評分Fig.8 Pathological score of colon tissue in each group

3 結論

IBD是一種病因不明、難治愈、易復發的慢性腸道炎癥性疾病，以體質量減輕、便血、腸道炎癥及腸黏膜損傷為主要特征[36-37]。研究表明魚腥草具有較好的抗炎作用[38]，本研究發現，魚腥草可以降低DSS誘導的UC小鼠便血頻率、DAI評分，抑制結腸縮短，降低促炎因子分泌水平，增加抗炎因子分泌水平，降低血清中D-La濃度和LPS水平，魚腥草汁高劑量組較模型組分別降低了25.92%、45.24%（P＜0.01），還可以通過調節UC小鼠體內的氧化應激水平及緩解腸道損傷；與模型組相比，魚腥草汁中、高劑量組小鼠結腸組織中MDA含量較模型組分別降低45.27%、56.16%（P＜0.01），MPO活力分別降低了16.84%、34.05%（P＜0.01），SOD活力分別增加了48.82%、76.37%（P＜0.01）。綜上，魚腥草可通過調節小鼠體內的氧化應激水平，降低腸炎小鼠腸道通透性及緩解腸道損傷，對小鼠UC起到緩解及保護作用，本研究可為魚腥草預防UC等相關保健品的開發提供理論參考。但魚腥草治療UC小鼠的適宜劑量以及發揮抗炎作用的機制還有待進一步研究。