不同聚合度殼寡糖單體在小鼠體內的吸收分布

王 斌，汪 玲，閆 華，姜啟興，于沛沛，夏文水

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫 214122）

甲殼素廣泛存在于蝦蟹殼、昆蟲的表皮和各種真菌的細胞壁中，是自然界中僅次于纖維素的第二大聚合物[1]。殼聚糖是甲殼素降解和脫乙酰得到的自然界中唯一的陽離子多糖，因為其良好的生物相容性、生物可降解性、無毒性和吸附性，作為功能材料得到廣泛的應用[2]。但是，甲殼素和殼聚糖都是高分子聚合物，在中性pH值條件下溶解性差，這種特性限制了它們在食品、醫藥和農業領域應用[3]。然而，殼聚糖水解得到的聚合度在2～20之間的低分子殼寡糖具有很好的水溶性，2014年被國家衛生計生委批準為新食品原料[4]。殼寡糖被證實有很多的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗腫瘤、抑菌、免疫調節、神經保護、降血壓、降血脂、降膽固醇、促進組織再生、增強藥物和DNA傳遞以及鈣的吸收等[5-7]，可有效治療和預防許多威脅生命的疾病，如癌癥、心臟病、糖尿病、肥胖和阿爾茨海默病等[8-10]。

在研究殼寡糖生理活性機制前，必須要明確殼寡糖在體內消化、吸收、分布和代謝等過程。而目前關于殼寡糖的體內消化吸收分布及其代謝途徑方面的研究還存在很多的爭議。陳佳祎[11]建立了體外靜態模型，首次發現聚合度2～5的殼寡糖不受胃腸道消化的影響，其結構和含量保持不變；而聚合度6～10的殼寡糖在胃和腸消化中會降解為聚合度2～5的殼寡糖。早在1999年，有研究就發現異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的50%脫乙酰度殼聚糖在小鼠腹腔給藥后，能夠快速移動到腎臟并通過尿液排出（大部分在14 h后通過尿液排出），幾乎不會分布到肝、脾、腹水和血漿中，排出的殼聚糖分子質量變小，證實了大分子殼聚糖的生物可降解和不蓄積的特性[12]。Zeng Lintao等[13]研究了不同分子質量和不同溶解度殼聚糖在小鼠體內的吸收分布排泄情況，發現殼聚糖能夠被小鼠小腸吸收，可以分布到肝、腎、脾、胸腺、心、血液和肺中，在肝中的濃度明顯高于其他組織，隨著殼聚糖分子質量減小，其水溶性增和腸道吸收率增加。王敏[14]的實驗結果進一步表明FITC標記的聚合度1～3的殼寡糖和8～11的殼寡糖混合物入血入腸比例分別為5.68∶1和9.84∶1，認為殼寡糖在腸道的吸收比與殼寡糖的分子質量呈負相關。無標記的殼寡糖單體（聚合度2～5）體內吸收研究結果顯示，只有殼二糖（chitobiose，COS2）和殼三糖（chitotriose，COS3）可以吸收入血，殼四糖（chitotetraose，COS4）和殼五糖（chitopentose，COS5）不能[15]。但是，Zhao Qini等[16]的研究表明，無標記的COS5、殼六糖、殼七糖和殼八糖均可在大鼠血清中檢測到，隨著聚合度的增加吸收量降低。Zhu Limeng等[17]通過體內體外實驗證實殼寡糖混合物（聚合度2～7）具有良好的血腦屏障穿透能力。

目前的相關研究表明，高分子殼聚糖和低分子殼寡糖在動物體內均可以被吸收，吸收量與分子質量和水溶性呈負相關，并且可以分布到心、肝、脾、肺、腎等器官中[18]，聚合度2～7的殼寡糖還可以跨過血腦屏障[17]。由于目前關于體內吸收分布的研究大多采用殼寡糖混合物，成分難以定性，導致實驗難以重現，而且實驗結果不能明確可以被吸收并分布到相應靶器官發揮作用的主要結構成分。同時由于殼寡糖口服給藥后經過首過效應，血藥濃度會降低，受不同檢測方法檢測靈敏度的影響，會導致實驗結果產生較大誤差，因此不同檢測方法得到的實驗結果存在差異性，甚至出現相悖的結果。綜上，當前對于不同聚合度殼寡糖單體的體內吸收和各組織中分布的差異性還不明確。

本研究通過FITC標記在消化道不被降解的殼寡糖單體（COS2、COS3、COS4和COS5），并灌胃昆明小鼠，借助小動物活體光學成像系統，直觀地觀察不同聚合度殼寡糖單體在小鼠體內和離體組織器官中的吸收分布情況，進一步解剖取得組織進行熒光定量檢測，分析不同聚合度殼寡糖在小鼠體內的吸收分布的差異性，為殼寡糖功能活性機制和構效關系的研究提供理論支撐和指導。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性昆明小鼠，體質量（39±2）g，7～8 周齡，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2021-0011。實驗小鼠自由飲食，在一個可控制的環境中飼養，控制溫度為（22±2）℃、相對濕度（50±5）%。光照黑暗各12 h，光照時間從早上8∶00到晚上22∶00。所有動物相關的實驗操作都通過江南大學實驗管理與動物福利委員會審核，審核編號為JN.No20210415c1080520[077]。

COS2、COS3、COS4和COS5（純度大于90%）由實驗自制；FITC（純度大于90%） 上海麥克林生化科技有限公司；TLC Silica gel 60 F254薄層硅膠板 德國Merck公司；其他相關試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

P型立式T216200層析缸（200 mmh 200 mm）上海信誼儀器廠有限公司；Scientz-10ND冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司；IVIS Spectrum型小動物活體光學成像系統 美國珀金埃爾默儀器公司；G9800A熒光分光光度汁 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 FITC標記殼寡糖單體的制備

稱取0.2 g制備的殼寡糖單體（COS2、COS3、COS4和COS5）溶解在20 mL二甲基亞砜中，配制為10 mg/mL的溶液；稱取0.5 g FITC（與殼寡糖單體質量比大于1∶2.42），溶解在無水甲醇中，配制為10 mg/mL溶液，用5 mol/L的NaOH溶液調pH值大于7.5（FITC溶液顏色為橙黃色后基本不再變化）；邊劇烈攪拌邊向殼寡糖溶液中緩慢滴加FITC溶液；避光攪拌反應12 h，離心，取上清液，加入5 倍體積的丙酮，離心，棄掉上清液，用無水乙醇洗滌沉淀，直到上清液中檢測不到FITC的熒光。將沉淀溶解在去離子水中，再次離心，取上清液冷凍干燥得到FITC標記的殼寡糖單體粉末。

1.3.2 FITC標記產物純度鑒定

通過薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法[18]對制備的FITC標記產物FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4、FITC-COS5進行純度鑒定。以V（異丙醇）∶V（氨水）∶V（水）＝15∶7.5∶1為展開劑，點樣量為1 μL。待薄層色譜展開結束，用吹風機吹干，在波長為365 nm的紫外燈下觀察發光情況，鑒定游離FITC的殘留量和合成熒光標記物。在硅膠板上噴灑0.2%的茚三酮顯色劑，熱風吹至顯色，放置1 h，顯色后觀察殼寡糖殘留情況。

1.3.3 FITC標記率的測定

參考文獻[19]測定FITC的標記率，準確稱取一定量FITC溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4，下同）溶液中，配制成1 μg/mL的FITC溶液，用PBS稀釋得到0.1、0.2、0.4、0.4、0.8 μg/mL一系列標準FITC溶液，于激發波長485 nm、發射波長520 nm、激發光狹縫寬度10 nm、發射光狹縫寬度2.5 nm條件下測定吸光度A，以A為縱坐標，FITC質量濃度/（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程。

準確稱取1～3mg的各FITC熒光標記物溶于500～1000 mL的PBS中，于激發波長485 nm、發射波長520 nm、激發光狹縫寬度10 nm、發射光狹縫寬度2.5 nm條件下測定吸光度A，帶入FITC的標準曲線方程中計算出FITC質量，根據下式計算各FITC標記產物的標記率。

1.3.4 定性檢測

1.3.4.1 活體成像

17 只雄性昆明小鼠（38～42 g）提前一天進行剃毛。一只作為空白對照，灌胃等量的生理鹽水（0.1 mL/10 mg）。剩余16 只隨機分為4 組，每組4 只，每組分別灌胃FITC-COS2（210 mg/kgmb）、FITC-COS3（123 mg/kgmb）、FITC-COS4（107 mg/kgmb）和FITC-COS5（97 mg/kgmb），通過不同單體的標記率換算為COS2、COS3、COS4和COS5的劑量統一為65 mg/kgmb（殼寡糖的人體推薦劑量為低于0.5 g/d[4]，按照男性平均體質量70 kg[20]，轉化系數為9.1，得到小鼠劑量為65 mg/kgmb）。每組4 只小鼠分別在灌胃0.5、1、2 h和4 h，于激發波長485 nm、發射波長520 nm條件下，用IVIS SPECTRUM型小動物活體光學成像系統對熒光分布情況進行檢測。

1.3.4.2 離體組織成像

對灌胃1 h的小鼠活體成像后，在暗室內解剖，取血、腦、心、肝、脾、肺、腎、胃腸道，將組織放進檢測室內，用IVIS SPECTRUM型小動物活體光學成像系統檢測離體器官的熒光分布情況。

1.3.5 定量檢測

1.3.5.1 FITC-COS的標準曲線的繪制

分別稱取一定量的標記產物FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4、FITC-COS5，用PBS配制為1～3 μg/mL的溶液，進行梯度稀釋，得到一系列FITCCOS標準溶液，于激發波長485 nm、發射波長520 nm、激發光狹縫寬度10 nm、發射光狹縫寬度10 nm條件下測定熒光強度，以熒光強度為縱坐標，FITC-COS質量濃度/（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程。

1.3.5.2 動物組織采集

雄性KM小鼠（38～42 g）85 只，隨機分為17 組，每組5 只。分別為空白組、COS2（0.5、1、2 h和4 h各一組）4 組、COS3（0.5、1、2 h和4 h各一組）4 組、COS4（0.5、1、2 h和4 h各一組）4 組和COS5（0.5、1、2 h和4 h各一組）4 組。空白對照組灌胃等量的生理鹽水（0.1 mL/10 mg），實驗組各4 組小鼠灌胃FITC-COS2（210 mg/kgmb）、FITC-COS3（123 mg/kgmb）、FITCCOS4（107 mg/kgmb）和FITC-COS5（97 mg/kgmb），通過不同單體的標記率換算為COS2、COS3、COS4和COS5的劑量統一為65 mg/kgmb。4 組小鼠分別在灌胃0.5、1、2 h和4 h各解剖一組，眼球取血后，收集腦、心、肝、脾、肺、腎組織。全血在靜置1 h以后，3500 r/min離心10 min，取血清；其他組織分別稱質量后收集；所有樣品放置在－20 ℃避光保存，以備后續實驗操作。

1.3.5.3 各組織熒光強度測定

血清用PBS稀釋一定的倍數；收集的各組織取0.3 g左右，記錄準確質量，按照體積比1∶9添加預冷的PBS，加入兩顆小磁珠，使用高通量組織研磨機60 Hz運行90 s，重復3 次。10000 r/min離心10 min，取上清液；在激發波長485 nm、發射波長520 nm、激發光狹縫寬度10 nm、發射光狹縫寬度10 nm條件下，以空白組小鼠組織勻漿液為空白調零后，測定熒光強度，帶入對應的標準曲線方程計算各殼寡糖單體的質量濃度。

1.4 數據統計與圖表繪制方法

所有數據均采用平均值±標準偏差的形式表示，采用GraphPad Prism 8.0軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 FITC標記殼寡糖分析結果

2.1.1 產物純度鑒定結果

通過TLC分析定性鑒定了制備得到的熒光標記產物純度，結果如圖1所示。在FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITC-COS5的反應產物中均沒有檢測到游離的FITC（圖1A1、B1、C1、D1），說明未反應的FITC已經除凈；FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITC-COS5的反應產物中沒有檢測到游離的殼寡糖單體（圖1A2、B2、C2、D2），說明標記產物中沒有殼寡糖單體殘留，得到的均為FITC標記物，可用于后續體內分布實驗的研究。

圖1 不同聚合度殼寡糖單體FITC標記產物的TLC圖Fig.1 TLC profiles of FITC labeled COS monomers with different degrees of polymerization

2.1.2 不同聚合度殼寡糖單體FITC標記率的測定

游離FITC 的標準曲線方程為y＝599.0486－4.0458，R2＝0.9995。通過測定并計算得到COS2的標記率為0.69，轉換為物質的量比為1.95∶1（n（FITC）∶n（COS2）），表明COS2的氨基反應率高；COS3、COS4和COS5的標記率分別為0.47、0.39和0.33，轉換為物質的量比分別為1.14∶1（n（FITC）∶n（COS3））、1.09∶1（n（FITC）∶n（COS4））和1.04∶1（n（FITC）∶n（COS5）），反應率比較低。FITC標記殼寡糖的標記率隨著聚合度增加而降低，糖鏈越長，反應效率越低。

2.2 定性檢測結果

2.2.1 活體成像檢測結果

給小鼠灌胃FITC-COS2～FITC-COS5，采用IVIS SPECTRUM型小動物活體光學成像系統檢測，結果如圖2所示。FITC-COS2快速分布到全身，1 h達到最大分布；FITC-COS3在0.5 h檢測信號強度很弱，在1 h和2 h能夠分布到全身，而FITC-COS4和FITC-COS5在小鼠體內檢測信號強度很弱，基本檢測不到。因為COS3、COS4和COS5的FITC標記率遠低于COS2，在寡糖的灌胃劑量一致的情況下，COS3、COS4和COS5的熒光信號強度遠低于COS2。

圖2 不同聚合度殼寡糖單體在小鼠體內的活體成像Fig.2 In vivo imaging of distribution of COS monomers with different DPs in mice

2.2.2 離體組織成像檢測結果

為了更進一步確定不同聚合度殼寡糖單體在小鼠體內的吸收和組織中的分布情況，根據文獻報道中血藥質量濃度最大的時間點對各組小鼠進行解剖[15]，取其主要器官，用IVIS Spectrum型小動物活體光學成像系統檢測各器官中的熒光分布情況，結果如圖3所示。給小鼠灌胃FITC-COS2～FITC-COS51 h后，FITC-COS2在腦、肝、肺、腎和胃腸道中均檢測到熒光信號，在心、脾和血清中幾乎檢測不到熒光信號；FITC-COS3在腦、肝、肺、腎和胃腸道中檢測到熒光信號，在心、脾和血清中沒有檢測到熒光信號；FITC-COS4在腦、肝、腎、血清和胃腸道中檢測到信號，在心、脾、肺和血清中沒有檢測到熒光信號；FITC-COS5在腦、肝、肺、腎和胃腸道中檢測到熒光信號，在心、脾和血清中沒有檢測到熒光信號。FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITCCOS5灌胃給小鼠1 h后，在腦、肝、腎和胃腸道均能檢測到熒光信號，而在心、脾和血清中則未檢測到明顯熒光信號，肺中僅FITC-COS4未檢測到熒光信號。

圖3 不同聚合度殼寡糖單體的離體組織成像Fig.3 In vitro imaging of distribution of COS monomers with different DPs in mouse tissues

2.3 定量檢測結果

2.3.1 不同聚合度殼寡糖單體FITC標記物標準曲線方程不同聚合度殼寡糖單體的熒光標記產物，根據熒光定量得到的標準曲線方程如表1所示。根據各組織上清液測定的熒光強度，通過對應組別的標準曲線方程計算得到該組織中的FITC-COS2～FITC-COS5的質量濃度，再根據不同聚合度殼寡糖單體的標記率轉換后可以得到該組織中COS2～COS5的質量濃度，進而可以實現不同聚合度殼寡糖單體吸收分布量的比較。

表1 不同聚合度殼寡糖單體熒光標記物的標準曲線方程Table 1 Standard curves for determination of fluorescence labelled COS monomers with different DPs

2.3.2 不同聚合度殼寡糖單體的吸收

殼寡糖的血清質量濃度一定程度上可以反映殼寡糖在體內被吸收的情況[13]。COS2、COS3、COS4和COS5在灌胃后不同時間點的血清質量濃度如圖4所示，在給藥后0.5 h和1 h，不同聚合度殼寡糖的血清質量濃度為COS2＞COS4＞COS3＞COS5；在給藥2 h時，不同聚合度殼寡糖的血清質量濃度為COS2＞COS3＞COS5＞COS4；在給藥4 h時，不同聚合度殼寡糖的血清質量濃度為COS2＞COS3＞COS4＞COS5。COS2和COS4在給藥后1 h血清質量濃度達到最大，而COS3和COS5在2 h血清質量濃度達到最大；血清中的峰值質量濃度為COS2＞COS4＞COS3＞COS5。

圖4 不同聚合度殼寡糖單體的血清質量濃度Fig.4 Serum concentrations of COS monomers with different DPs at different times after administration

2.3.3 不同聚合度殼寡糖單體在不同組織中的分布

圖5顯示了COS2、COS3、COS4和COS5灌胃后不同時間點在所測各組織中的分布情況。可以看出，殼寡糖能分布到所有被檢測的組織中（腦、心、肝、脾、肺和腎）。COS2灌胃0.5 h后，在各組織器官中的分布量依次為肝＞腎＞心＞脾＞肺＞腦；在1 h和2 h時的分布趨勢一樣，由高到底依次為腎＞脾＞心＞肝＞肺＞腦；在4 h時各組織器官中依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦中未檢測到熒光信號；在各組織器官中峰值含量依次為腎＞脾＞心＞肝＞肺＞腦。COS3灌胃0.5 h后，在各組織器官中的分布量依次為肝＞腎＞心≈脾≈肺＞腦；在1 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺＞腦；在2 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺，腦組織中未檢測到熒光信號；在4 h時各組織器官中的分布量依次為腎＞肝＞心≈脾，肺和腦中未檢測到熒光信號；在各組織器官中的峰值含量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺＞腦。COS4灌胃0.5 h后，在各組織器官中的分布量依次為肝＞腎＞心＞脾＞肺＞腦；在1 h的分布量依次為腎＞肝＞脾＞心＞肺＞腦；在2 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦組織中未檢測到熒光信號；在4 h時各組織器官中的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦中未檢測到熒光信號；在各組織器官中的峰值分布量依次為腎＞肝＞脾＞心＞肺＞腦。COS5灌胃0.5 h后，在各組織器官中的分布量依次為肝＞腎＞心≈脾＞肺＞腦；在1 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺＞腦；在2 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦組織中未檢測到熒光信號；在4 h時各組織器官中的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦中未檢測到熒光信號；在各組織器官中的峰值分布量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺＞腦。

圖5 不同聚合度殼寡糖單體在小鼠腎（A）、肝（B）、心（C）、脾（D）、肺（E）和腦（F）中的含量Fig.5 Concentrations of COS monomers with different DPs in kidney(A),liver (B),heart (C),spleen (D),lung (E) and brain (F) tissues at different times after administration

COS2、COS3、COS4和COS5灌胃后0.5～4 h在腎、心、脾、肺和腦組織中的分布量總體呈先升高后降低的趨勢，且在1 h達到最大峰值。但是，COS2、COS3、COS4和COS5在肝中的分布量在0.5 h最高，隨著時間的延長緩慢下降。COS2、COS3、COS4和COS5在心、脾、肺和腦組織中1 h的分布趨勢和血清的峰值濃度趨勢具有重合性，均為COS2＞COS4＞COS3＞COS5。而COS2、COS3、COS4和COS5在肝和腎中的分布，不同時間點均為COS5＞COS4＞COS3＞COS2，隨著聚合度增加而增加。

3 討論

殼寡糖的單體結構簡單，與體內的多種單糖（葡萄糖、半乳糖等）結構相似，缺乏特征的官能團，經過口服吸收入血含量極低且內源性糖類對其測定也會產生一定的干擾[21]。熒光探針標記操作簡單，且熒光的檢測敏感性比傳統紫外-可見光譜法高3～4 個數量級[22]，熒光標記以后，殼寡糖在熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀和雙光子激發熒光成像技術等熒光檢測儀器下變得“可視化”，從而能夠在細胞、組織乃至活體水平上對其進行定位檢測[21]。FITC最大吸收光波長為490～495 nm，最大發射光波長為520～530 nm，因具有溫度系數低、壽命長、光穩定性好、量子產率高和標記效率高等優點，被用作蛋白質和核酸等生物大分子的熒光探針，在生物醫學研究領域已得到廣泛的應用，是熒光標記分析方法中常見的方法之一；在堿性條件下，FITC分子中的異硫氰基可通過親核加成反應與本身具有活性氨基基團的多糖直接共價偶聯，完成多糖的FITC熒光標記[23]。FITC作為目前應用最廣泛的熒光標記方法之一，已實現了對殼聚糖、麥冬多糖、當歸多糖、枸杞多糖、灰樹花多糖等多種多糖的標記[24]。已有研究證明FITC標記對殼寡糖的體內吸收代謝幾乎沒有影響[19]，并且FITC在胃腸道消化道內不會從殼寡糖分子上脫落[14]。本研究采用FITC對不同聚合度殼寡糖單體進行標記，每一個聚合度的殼寡糖都有一個游離的氨基，殼寡糖連接FITC的最大結合數即為殼寡糖的聚合度。FITC分子質量為389.4 Da，殼寡糖單糖分子質量為161 Da，故0.2 g殼寡糖可共價結合0.484 g的FITC，即殼寡糖與FITC的質量比為1：2.42[14]。因此選擇0.2 g殼寡糖，加入0.5 g FITC進行反應，以保證FITC過量，從而保證殼寡糖單體的標記率。最后，得到4 個標記后的產物FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITCCOS5，標記率以質量比公式計算分別為0.69、0.47、0.39和0.33，結果表明隨著聚合度增加，殼寡糖的標記率降低，這可能與殼寡糖單體的空間結構有一定的相關性。如果要統一各組殼寡糖單體COS2、COS3、COS4和COS5的灌胃劑量均為65 mg/kgmb，那么每組FITC標記物FITCCOS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITC-COS5的灌胃劑量分別為65/（1－0.69）＝210 mg/kgmb、65/（1－0.47）＝123 mg/kgmb、65/（1－0.39）＝107 mg/kgmb和65/（1－0.33）＝97 mg/kgmb。

給小鼠灌胃后，活體成像結果顯示FITC-COS4、FITC-COS5的熒光信號基本檢測不到。而離體組織成像結果顯示，FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITC-COS5灌胃小鼠1 h后，在腦、肝、腎和胃腸道均能檢測到熒光信號，而在心、脾和血清中則未檢測到明顯熒光信號，肺中僅FITC-COS4未檢測到熒光信號。但是，對解剖的組織處理以后，熒光分光光度計定量檢測的結果顯示，聚合度2～5的殼寡糖單體均可以吸收入血，能分布到腎、肝、心、脾、肺和腦組織中。這三者實驗結果存在矛盾之處。研究表明，動物組織中的成分如水、脂肪、氧血紅蛋白、脫氧血紅蛋白和黑色素等在200～650 nm波長范圍的紫外-可見光區域具有很強的吸收和散射特性，導致FITC熒光染料其組織穿透深度有限，光只可以穿透幾百微米到一毫米的深度，組織自身熒光信號強度和攝入食物引起的背景信號強度也比較高，從而可能導致“可視化”水平的檢測存在一定的偏差[25-26]。因此，采用活體成像很難進行定量分析，但是采用活體成像技術對離體組織進行觀察，可以直觀地看到4 個殼寡糖單體均可以跨過血腦屏障分布到腦組織，而實際上進行熒光分光光度計檢測時，腦組織中的分布量是最低的。而對于心、脾、血清等血紅色的組織，由于濃度低且背景熒光強而導致殼寡糖單體在離體組織成像時檢測不到。但是，本實驗通過解剖組織進行勻漿處理以后得到澄清透明的液體，不僅可以除去組織和血液中的氧血紅蛋白、脫氧血紅蛋白，而且可以避免因為穿透深度不夠以及背景熒光而導致的結果偏差，進一步確定殼寡糖單體在組織中的分布情況，并進行不同聚合度單體的比較。

胡錦珍[27]的研究結果顯示，FITC標記后的殼聚糖，通過熒光分光光度計進行檢測，產物在各組織中的決定系數均大于0.9950，在血清和組織樣品中的回收率符合藥物體內分析的技術要求；標記的產物在各組織液中冷藏24 h和室溫貯藏4 h，熒光強度雖然有所下降，但是相對標準偏差均在10%以內，符合藥物分析技術要求。因此，本實驗根據熒光分光光度計進行定量分析，研究結果顯示COS2、COS3、COS4和COS5均能被小腸吸收，但是在血清中的濃度卻很低（相比腎、肝、脾和心），這主要與血清高效的殼聚糖清除作用有關。Ricardson等[28]研究發現，125I標記的殼聚糖樣品經過靜脈注射后很快被血清清除。Chen Ping[29]的研究表明，COS2、COS3、COS4和COS5在腸道的表觀滲透系數均大于1h 10－6cm/s，表明殼寡糖在小腸內通過多種方式吸收，被動擴散以及載體蛋白轉運并存；COS2、COS3、COS4和COS5的表觀滲透系數由高到低依次為COS2＞COS4＞COS3＞COS5，與本次實驗各聚合度殼寡糖在血清中峰值濃度趨勢表現出一致性。Chen Anshu等[15]研究發現給大鼠口服30 mg/kgmb殼寡糖后，只有COS2和COS3能被小腸吸收入血，并且在給藥1 h后血藥濃度達到最大，而其他聚合度殼寡糖無法被胃腸道吸收。與本實驗結果有一定的矛盾，可能是因為灌胃后COS4和COS5的吸收量低，血液濃度較低，液相色譜的檢測方法檢出限達不到，也有可能是因為血清中其他雜蛋白和寡糖的影響，屏蔽了殼寡糖信號。陳佳祎[11]在研究殼寡糖體外消化時發現，體外模擬的小腸消化液中，COS2的出峰被影響而不能進行定量。魏鵬等[30]采用高效陰離子交換色譜結合脈沖安培檢測器檢測非翻轉腸囊中殼寡糖吸收，發現COS5和殼六糖檢測受到影響，而無法實現檢測。而體內實驗中，血清和各組織中的組分更加復雜，更加容易受影響。

據文獻報道，尿液排出是殼寡糖的主要清除方式[31]；本研究表明灌胃1、2 h和4 h后，COS2、COS3、COS4和COS5在腎的分布量最高，在1 h達到峰值后，分布量緩慢降低，表明殼寡糖確實有可能通過尿液在緩慢排泄。肝臟是外源化合物進入體內吸收的第一道屏障[32]，因此，殼寡糖在肝臟中的分布是反映吸收情況的一個重要參數[33]。COS2、COS3、COS4和COS5在灌胃后，0.5 h迅速到達肝，隨著時間的延長，在肝的含量逐漸降低，各聚合度殼聚糖在肝的含量與聚合度成正比；各聚合度殼寡糖在肝的分布量與其他組織相比明顯偏高，說明殼寡糖在肝有一定的累積效應，隨著分子質量增加，累積效應增強。這與Zeng Lintao等[13]研究發現殼聚糖在肝中的濃度明顯高于其他組織，隨著殼聚糖分子質量降低，水溶性增加和腸道吸收率增加。COS2、COS3、COS4和COS5均可以分布到腦組織，這與之前研究所報道低分子質量殼寡糖有良好的血腦屏障通透性[17]是一致的。COS2、COS3、COS4和COS5在心、脾和肺中分布量很少，甚至檢測不到，與文獻中報道的殼寡糖主要分布在有大血管分布的器官（肝和腎）中[34]具有一致性。

4 結論

本研究通過體內研究發現聚合度2～5的殼寡糖單體均可以吸收入血，分布到腎、肝、心、脾、肺和腦組織中，在肝和腎中的分布與聚合度呈正相關，在其他組織中和血清中的峰值分布呈現出相同的趨勢（COS2＞COS4＞COS3＞COS5）。此外，本研究表明聚合度2～5的殼寡糖可以跨越血腦屏障這一障礙，在中樞神經系統相關疾病的研究中有著天然的優勢和潛力。聚合度2～5的殼寡糖在腎臟中的分布量最高，且在1 h到達峰值以后，含量下降緩慢，有一定的蓄積趨勢；在肝臟的分布量隨著聚合度的增加而增加。本實驗可為預防脂肪肝、肝癌、腎癌等肝臟和腎臟相關的疾病提供一定的理論參考。明確不同聚合度殼寡糖單體的體內吸收分布的差異性，對于殼寡糖的構效關系以及功能活性機制研究具有一定的指導意義，有助于促進殼寡糖在食品功能性食品的開發和應用。