不同貯藏條件及加工處理后大麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇膳食風險評估

婁雨豪，曹冬梅,3,4,*，張東杰，崔 航，王冀菲，楊 建，邵 懿

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江 大慶 163319；3.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；4.黑龍江省雜糧加工及質量安全工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；5.北大荒現代農業產業技術省級培育協同創新中心，黑龍江 大慶 163319；6.國家食品安全風險評估中心標準二部，北京 100022）

大麥為禾本科植物，其用途廣泛，可作飼料飼草，還可為啤酒、保健品等提供原料[1]。而大麥在生長及貯藏期間易被真菌所污染，使其品質下降，威脅食用人群的健康。真菌毒素是真菌在適宜條件下產生的次級代謝產物，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）作為真菌毒素中檢出率最高的一種毒素，已被世界衛生組織國際癌癥研究機構列為第3類致癌物[2]。當人體內蓄積大量DON時會導致厭食、嘔吐、消化系統紊亂，甚至會引起出血等癥狀[3]。有研究表明，DON對人或動物均具有急性或潛在的慢性毒害作用[4]，且還會聯合其他毒素發揮協同作用使毒性增加[5]。近年來研究還發現DON具有一定的遺傳毒性，可由母體遺傳給子代從而造成危害[6]。但在安全攝入限量范圍[7]內，DON并不會對人類健康構成風險。目前，已有大量關于DON污染糧食方面的報道，如李瑞園等[8]對200 份雜糧類樣品進行了檢測，發現其中的玉米、大麥、小麥、燕麥均有DON檢出，分別占樣本總數的51%、40%、32%、25%；陸晶晶等[9]以隨機抽樣的方法抽取了5678 份全國各大城市流通的小麥樣品，共有3335 份樣品檢測出DON殘留，其中有261 份樣品超過規定標準，平均含量為317 μg/kg。

在食品安全性分析方面，風險評估是指在某個特定的條件下，人體攝入風險源后對健康產生不良反應可能性的評估，整個過程一般包含危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險描述4 個環節。其中暴露評估是整個風險評估中最重要的環節，它能夠反映在各種條件下，危害物的含量水平以及在攝入不同含量危害物后出現不良反應的各種可能性，而危害識別與危害特征描述可以參考其他各國及世界衛生組織下達的各項標準及現有成果，對于真菌毒素來說各國人群的耐受劑量及攝入后出現的反應沒有明顯區別，但因為地域差異導致人群具有不同的膳食習慣，故需要結合當地飲食結構獲得相應膳食暴露量以進行風險評估。目前已有學者對真菌毒素進行了風險評估，如梁馨予等[10]對花生油中黃曲霉毒素進行了風險評估，發現其平均暴露量為7.76 ng/kg，暴露邊界值為52，具有較高的健康風險。Muhammad等[11]對零售谷類食品及其衍生物中的真菌毒素進行調查，得出每年每10萬 人中會有1.66 人因攝入含黃曲霉毒素的谷物而患肝癌。Tolosa等[12]采集了坎帕尼亞地區的84 個無麩質面食樣本，以監測霉菌毒素的暴露情況，發現兒童和青少年年齡組的雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和伏馬毒素暴露量較高，但多數研究主要集中在主糧上，有關大麥在不同貯藏環境及加工處理后DON膳食攝入風險的研究還鮮見報道。

因此，本研究將以大麥在不同溫度（5、15、25、35 ℃）和不同相對濕度（55%、65%、75%、85%）條件下貯藏360 d，采用酶聯免疫吸附試驗檢測不同貯藏條件及3 種加工處理（蒸制、煮制、發酵）后各樣本中DON含量，對其以點評估與概率評估的方法進行風險評估，為合理評價DON毒素在糧食貯藏中的健康風險提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘CK15’大麥由佳木斯農業科學院提供，采收后直接進行實驗；小麥粉、谷阮粉為市售。

硝酸鎂、亞硝酸鈉、氯化鈉、氯化鉀 廣東西隴科學試劑有限公司；酶聯免疫試劑盒（嘔吐毒素） 上海酶聯生物有限公司。

1.2 儀器與設備

TL-48R型粉碎研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；QL-901型旋渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司；H1850型離心機 湖南湘儀儀器有限公司；Infinite F50型酶標儀 山東博科再生醫學有限公司；HWS-150型恒溫恒濕培養箱 上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 貯藏條件設置

通過人工模擬貯藏環境濕度[13]，依次配制飽和硝酸鎂溶液、飽和亞硝酸鈉溶液、飽和氯化鈉溶液、飽和氯化鉀溶液，分別模擬相對濕度55%、65%、75%、85%環境。將300 g大麥樣品分裝在標記不同相對濕度的燒杯中，共16 份（每個相對濕度4 份），再將盛有大麥樣品的燒杯裝入帶有不同飽和溶液的大燒杯中，而后將其放入不同溫度（5、15、25、35 ℃）的恒溫培養箱中貯藏，分別模擬冷庫貯藏、低溫糧庫貯藏、常溫糧庫貯藏、南方高溫糧庫貯藏。在180、270、360 d進行取樣用于后續DON毒素檢測，取樣時在容器上中下層多點取樣以獲得較為準確的毒素含量，取樣完成后立即放入培養箱中，以免外界環境對樣品進行干擾。

1.3.2 不同加工工藝對DON的去除

1.3.2.1 原料預處理

因大麥中谷蛋白分子質量較小且醇溶蛋白含量較低，在和面時無法形成穩定的網狀結構，導致面團松散，單獨以其進行面制品加工時難以成型[14]，故需要與小麥粉配比使用且添加適量的品質改良劑。將大麥研磨成粉，過100 目篩，以1∶3的質量比加入小麥粉，再加入面粉總質量10%的谷阮粉得到復配后的雜糧面粉，混勻備用。

1.3.2.2 蒸制加工處理

將雜糧粉與40 ℃溫水按照質量體積比2∶1混合，添加1%（以體系質量計，下同）的酵母，進行和面。揉面5 min直至面團光滑、不黏手，而后將面團放入36 ℃的培養箱中醒發2.5 h，拿出分塊，每個50 g，揉成圓形后在室溫下進行2 次醒發（整個醒發過程20 min）。將水加熱至沸騰，放入蒸屜中蒸制20 min[15]。以無碳酸鈉面團為對照，加堿面團中碳酸鈉添加量設置為0.5%和1.0%。

1.3.2.3 煮制加工處理

將雜糧粉與40 ℃溫水按照2∶1的比例混合，和面5 min直至面團光滑、不粘手，靜置熟化30 min后，用面條機將其逐步壓延成厚1 mm、寬3 mm的面條[16]。稱取500 mL純水煮沸，分別加入碳酸鈉，碳酸鈉添加量為面團含量的0.20%、0.25%、0.30%、0.35%，待溶解后放入做好的雜糧面條50 g，煮制8 min。

1.3.2.4 啤酒釀造處理

啤酒釀造工藝：大麥→浸麥→發芽→除根→粉碎→糊化→糖化→過濾→煮浮→添加酒花→旋沉冷卻→發酵→過濾

選取適量優質大麥進行浸麥，使其相對含水量達到45%～50%左右進行發芽，除根后放入培養箱中干燥。取出粉碎進行糊化，在糊化鍋中加入適量的水加熱至40 ℃，進行攪拌投入麥芽，升溫至50 ℃保持20 min后升高至63 ℃繼續糊化30 min，在75 ℃下過濾，煮沸得到麥芽汁，酒花分3 次添加依次在10、50、80 min時加入10%、60%、30%，然后經過旋沉、冷卻至15 ℃，接種酵母后分別在14 ℃發酵4 d、8 ℃發酵4 d、4 ℃發酵7 d。最終經過過濾得到啤酒。

1.3.3 DON毒素含量測定

酶聯免疫吸附檢測試劑盒存放在低溫冰箱中，檢測時將其移入室溫環境（20～25 ℃），平衡1 h以上。準確稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL去離子水振蕩5 min，室溫下4000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL并加入0.5 mL試劑盒中的復溶液混勻后進行分析。取上述溶液50 μL于試劑盒各微孔中，每個樣本做兩孔平行，加入酶標記物、抗體工作液各50 μL在25 ℃下反應30 min。洗滌后加入50 μL底物液A、B，25 ℃避光反應15 min。最后加入50 μL終止液，使用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度，以標準液質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為y＝－0.2979x＋0.984（R2＝0.9980），通過標準曲線方程計算相應毒素大小。

1.3.4 風險評估

1.3.4.1 點評估法評估

點評估是指在暴露評估環節中的每一個參數都使用特定數值的方法，一般采用平均值代表人群暴露量的平均水平，以大麥中DON含量、調查對象大麥每日消費量及體質量，計算個體攝入DON的暴露風險。我國居民膳食指南中推薦每日大麥攝入量為50～150 g，人均體質量為50～72 kg，將以此作為評估特值估算膳食攝入量。本實驗將以聯合國糧農組織/世界衛生組織食品添加劑聯合委員會暫定的DON每日最大耐受攝入量（DON≤0.001 mg/kgmb）[17]作為評估標準。

長期膳食攝入及慢性風險評估計算[18]分別如公式（1）、（2）所示。

式中：EDI為每日估計攝入量/（μg/kgmb）；m1為食物中所含DON含量/（μg/kgmb）；m2為居民每日大麥消費量/kg；mb為體質量/kg；RQ為慢性風險評價指數；PMTDI為每日最大耐受攝入量/（μg/kgmb）。

DON的膳食攝入風險水平可由RQ進行量化分析，若RQ≤1表示攝入風險在可接受水平范圍內，不會對人體造成不良影響；反之亦然，且數值越大風險越高。

不同人群每日攝入大麥大份餐攝入量標準根據世界衛生組織要求（表1），短期膳食攝入量及急性風險評估計算公式[19]分別如式（3）、（4）所示。

表1 不同年齡人群攝入大麥大份餐攝入量及體質量Table 1 Daily intake of barley by people of different ages

式中：NESTI為國家估計短期攝入量/（μg/kgmb）；v為變異因子（本研究取3）；L P 為大麥大份餐消費量/kg；m為大麥單果質量/kg；HR為最高檢出值/kg；ArfD為急性參考劑量/（μg/kgmb）；HQ為急性風險評價指數。

1.3.4.2 概率評估法評估

其原理是根據隨機抽樣通過大規模的重復取樣，估算某件事件出現的概率[20]。采用Monte Carlo法，使用Crystal Ball軟件包@RISK6.0軟件計算居民通過大麥攝入途徑所得到毒素含量的暴露量[21]。與點評估相比，能夠有效克服局限性，使結果更加接近于現實。

1.4 數據處理與分析

數據表示為平均值±標準差。運用@RISK軟件進行暴露量及暴露風險的計算；運用SPSS軟件對數據進行T檢驗分析各樣本之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏條件下大麥中DON含量變化

由表2可知，在整個貯藏階段，DON含量整體呈現上升趨勢，由最初的0.435 mg/kg最高升至0.647 mg/kg，比貯藏前的大麥中DON含量高了0.212 mg/kg。其中貯藏180 d時DON含量上升趨勢較為緩慢，其DON含量為0.458～0.552 mg/kg，這是由于剛收獲的大麥通常處于休眠狀態，隨著貯藏時間的延長，大麥本身會逐漸脫離休眠狀態以抵御真菌毒素的進一步污染[22]。在貯藏270 d時DON含量上升幅度較大，DON含量為0.478～0.593 mg/kg。Mannaa等[23]發現鏈格孢屬與鐮刀菌屬在收獲前會附著在成熟的谷物上，而DON正是鐮刀菌屬的次級代謝產物，經過一段時間的貯藏后逐漸產生代謝產物導致毒素累積，DON含量上升。也有研究表明，毒素在某一階段含量較高可能是由于這種毒素的產毒真菌在這一貯藏時間達到了優良生長期，代謝量增大[24]。而在貯藏360 d時DON含量為0.502～0.647 mg/kg，較貯藏270 d時上升趨勢較慢，可能是由于貯藏環境已趨于穩定并且田間真菌逐漸過渡為貯藏真菌，優勢菌屬發生了更替，鐮刀菌屬相對豐度占比下降，已有研究發現糧食在貯藏過程中不同類型的微生物代謝產物之間會相互抑制[25]。

表2 不同貯藏條件下DON含量Table 2 Change in DON content of barley under different storage conditions mg/kg

2.2 不同加工工藝下DON含量分析結果

以天然污染的大麥與小麥粉為原料，探究各加工方式對DON的去除效果，并以此研究人群攝入DON的慢性與急性暴露風險。由表3可知，經過不同加工工藝處理后食品的DON含量都明顯降低，其中蒸制工藝的去除效果較弱，DON含量下降了0.086～0.211 mg/kg，其原因可能是蒸制時面團所接觸水分較少，且沒有達到破壞DON結構的溫度；DON去除效果較好的工藝為煮制，其充分利用了DON溶于水、在堿性條件下不穩定的特點[26]，DON一部分受熱分解，另一部分溶于水中，從而轉移了樣本中的部分毒素，以此達到去除的效果，煮制處理下DON含量下降了0.441～0.615 mg/kg，隨著碳酸鈉添加量的增加毒素的去除效果也增強，而添加0.30%碳酸鈉和0.35%碳酸鈉去除效果并無顯著差異（P＞0.05），表明高濃度的堿性溶液對DON的去除效果也是有限的，當達到一定限值后，降解效果將會降低；在啤酒釀造過程中DON含量先由0.915 mg/kg降低至0.534 mg/kg，隨后升高至1.035 mg/kg，呈現先降低后上升的趨勢，原因可能為在浸麥過程中部分毒素溶于水，且在發芽時生成了毒性較低的代謝產物DON-3-葡萄糖苷與乙酰基DON，從而導致整體毒素含量降低[27]；而在發酵過程中毒素大幅度增加已超過初始大麥中DON含量，這可能是由于之前制麥發芽過程中生成的DON-3-葡萄糖苷與乙酰基DON通過酶的作用進一步轉化為DON[28]，并且經過長時間適宜環境的培養，導致整體DON含量增加。

表3 不同加工工藝下DON含量Table 3 Change in DON content of barley products during processing

2.3 膳食風險評估結果

2.3.1 點評估

2.3.1.1 基于貯藏實驗中DON含量膳食風險評估

大麥經各條件貯藏后，分別以貯藏180、270、360 d大麥所檢出的DON含量（表2）作為評估特值，代入式（1）、（2）中進行慢性膳食攝入風險評估。由表4可知，攝入貯藏前初始大麥中DON的EDI為0.00030～0.00130 mg/kg、RQ為0.30～1.31；攝入貯藏180 d大麥中DON的EDI為0.00031～0.00170 mg/kg，RQ為0.31～1.66；攝入貯藏270 d大麥中DON的EDI為0.00033～0.00180 mg/kg，RQ為0.33～1.78；攝入貯藏360 d大麥中DON的EDI為0.00035～0.00190 mg/kg，RQ為0.35～1.94。可見，經過360 d的貯藏后，攝入DON的暴露風險均有一定程度上的升高，RQ最高增加0.63。而由于人體對真菌毒素DON的耐受量較低，且DON在糧食作物中易被大量檢出、污染程度較高，因此DON在中國攝入人群中存在一定的暴露風險。

表4 基于大麥貯藏實驗中DON含量的慢性風險評估Table 4 Chronic intake risk assessment of DON from barley under different storage conditions

在貯藏360 d 后，根據大麥中DON 最高檢出量（0.647 mg/kg）、大份餐攝入量、急性參考劑量，以及世界衛生組織數據庫中規定DON的急性參考劑量（8 μg/kgmb[29]）和大麥單果質量（0.0346 g），代入式（3）、（4）中進行急性膳食攝入風險評估。由表5可知，4～6 歲兒童攝入DON的NESTI為0.0055 mg/kg，HQ為0.69；而孕期女性攝入DON的NESTI為0.0026 mg/kg，HQ為0.33；一般人群攝入DON的NESTI為0.0042 mg/kg；HQ為0.52。其上表明短期急性暴露量均超過每日最大耐受攝入量，但若不長期保持此類飲食習慣，則尚不存在急性暴露風險，兒童由于體質量較輕，耐受量較低其暴露風險高于孕期女性與一般人群，需額外關注。

表5 基于大麥貯藏實驗中DON含量的急性風險評估Table 5 Acute intake risk assessment of DON from barley under different storage conditions

2.3.1.2 基于加工處理后DON含量膳食風險評估

由表6可知，人群攝入初始面團中DON的EDI為0.00060～0.00260 mg/kg、RQ為0.60～2.60，而經過蒸制后EDI降低為0.00046～0.00230 mg/kg，RQ最高降低了0.63；經過煮制后EDI降低為0.00018～0.00130 mg/kg，RQ最高降低了1.84。人群攝入大麥中DON的EDI為0.00064～0.00280 mg/kg，經過發芽制得麥芽后EDI降低為0.00037～0.00160 mg/kg，RQ降低了1.23；經過發酵工藝制成啤酒后EDI升高為0.00072～0.00310 mg/kg，RQ升高了0.19。可以發現不同的加工工藝均會改變其膳食攝入風險水平，其中蒸制、煮制及發芽均會降低DON的攝入風險，而由于在發酵制啤過程中毒素含量增加從而導致膳食攝入風險上升。

表6 基于加工處理后DON含量的慢性風險評估Table 6 Chronic intake risk assessment of DON from barley subjected to different processing treatments

由表7可知，4～6 歲兒童攝入初始面團及大麥中DON的NESTI分別為0.0074、0.0078 mg/kg，HQ分別為0.92、0.97，經過蒸制后NESTI降低為0.0056～0.0067 mg/kg、HQ最高降低了0.22，經過煮制后NESTI降低為0.0021～0.0036 mg/kg，HQ最高降低了0.65，經過發芽制得麥芽后NESTI為0.0045 mg/kg，HQ降低了0.4，而經過發酵制得啤酒后NESTI升高為0.0088 mg/kg，HQ提高了0.13，達到1.10，已超過安全限值，存在一定急性暴露風險；孕期女性攝入初始面團及大麥中DON的NESTI分別為0.0035、0.0037 mg/kg，HQ分別為0.44、0.46，經過蒸制后NESTI降低為0.0027～0.0032 mg/kg，HQ最高降低了0.11，經過煮制后NESTI降低為0.0010～0.0017 mg/kg，HQ最高降低了0.31，經過發芽制得麥芽后NESTI為0.0022 mg/kg，HQ降低了0.19，而經過發酵制得啤酒后NESTI升高為0.0042 mg/kg，HQ提高0.07；一般人群攝入初始面團及大麥中DON的NESTI分別為0.0056、0.0059 mg/kg，HQ分別為0.70、0.74，經過蒸制后NESTI降低為0.0042～0.0051 mg/kg，HQ最高降低了0.17，經過煮制后NESTI降低為0.0016～0.0028 mg/kg，HQ最高降低了0.50，經過發芽制得麥芽后NESTI為0.0035 mg/kg，HQ降低了0.31，而經過發酵制得啤酒后NESTI升高為0.0067 mg/kg，HQ提高0.10。當原料DON含量過高制成啤酒后容易引起急性中毒，需特別關注。經過上述工藝加工后，其暴露風險除發酵工藝外均有一定程度的下降，煮制工藝效果最好，其次為發芽制麥與蒸制工藝。

表7 基于加工處理后DON含量的急性風險評估Table 7 Acute intake risk assessment of DON from barley subjected to different processing treatments

2.3.2 概率評估

利用@RISK6軟件對64 份大麥中的DON含量、11 份經加工處理后大麥中DON含量、不同人群攝入量及體質量進行分布擬合，從Chi-Squared、Anderson-Darling和Kolmogorov-Smirnov 3 種檢驗方法中選擇最優的擬合分布作為模型數據[30]，擬合圖像如圖1所示。

圖1 各參數的擬合比較Fig.1 Comparison of fitting of various parameters

表8匯總了整個膳食暴露評估過程中各參數的分布數值，使用@RISK6軟件利用其模型參數對僅通過食用大麥途徑攝入的DON含量進行人體健康風險評價，以此進行模擬運算，將每日攝入量作為輸出項，模型進行10000 次迭代、100 次模擬，模擬過程中將使用Latin Hypercube抽樣方法，在多個變量的概率分布之間隨機抽取一個數值進行交叉運算，得出所有可能的結果，以此呈現出DON攝入風險的所有概率可能。常選取第95百分位數或第97.5百分位數來表示高消費人群的暴露情況[31]。

表8 暴露評估中各參數匯總Table 8 Summary of parameters in the exposure assessment

不同消費人群通過食用大麥長期每日攝入DON的平均量為0.00086 mg/kgmb，最高值為0.00240 mg/kgmb（圖2），高攝入個體（P90、P95、P99）DON暴露量為0.00134～0.00183 mg/kgmb（表9）。所得暴露量均大于PMTDI（DON≤0.001 mg/kgmb），即大麥經貯藏后DON暴露量對于成人有32.7%的暴露風險。而復配的天然污染雜糧粉（P50）經加工處理后攝入DON的平均值由0.00142 mg/kgmb降低為0.00068 mg/kgmb；高消費個體（P90、P95、P99）DON暴露水平由0.00222～0.00287 mg/kgmb變為0.00156～0.00312 mg/kgmb，其最大值升高是因發酵處理后原料中毒素含量上升，繼而導致總體風險提升。總體暴露風險也由76.8%降為27.2%，這也與之前點評估結果較為相似。

圖2 通過食用大麥途徑攝入DON的暴露分布Fig.2 Distribution of dietary exposure to DON through consumption of barley

表9 不同消費人群的DON暴露量Table 9 DON exposure for consumer groups of different ages

3 結論

本研究對不同貯藏條件及3 種加工方式處理（蒸制、煮制、發酵）下的大麥中的DON含量進行了檢測，發現大麥經過360 d的貯藏后，所含DON含量明顯上升，會對人體健康造成威脅，進一步探究不同人群攝入后的暴露量及風險值，通過點評估研究結果發現，經過貯藏后RQ最高增加0.63，而HQ為0.33～0.69，不存在急性暴露風險；經過加工處理后，RQ和HQ最高可降低1.84、0.64。通過蒙特卡洛概率評估分析發現，通過食用大麥而每日攝入DON的暴露量大于PMTDI，即大麥經貯藏后，DON暴露量對于攝入人群來說有32.7%的暴露風險；大麥經過蒸煮處理后能夠有效降低攝入風險，而發酵工藝則會加大攝入風險。并且不同人群攝入同一物質后的膳食攝入風險也有所不同，其風險大小與攝入量成正比，與自身耐受度成反比，因此往往兒童膳食暴露量較高，存在較大的安全隱患。

對于貯藏大麥中DON風險評估來說，大麥中DON含量及攝入量是整個風險評估過程中最為重要的兩個參數。在整個過程中存在的不確定性，主要包括樣本檢測時與攝入量統計時的誤差，以及建立各參數擬合分布的誤差，這些誤差的產生無法避免，只能通過人為地利用大量數據及模擬次數來減少對最終結果的影響，例如采集更多、更為分散的樣本點來檢測其含量，擴大覆蓋人群面積等。本實驗所得到的結果僅為理論上通過食用貯藏后的大麥從而攝入DON的健康風險評價，并未通過社會調查來獲取當地居民的膳食習慣。谷物類食品作為膳食結構中的主要組成部分，其消費量較高，食品安全問題意義重大，應認真執行國家制定的檢出標準，根據DON的特性加強對原糧的質量控制及脫毒，杜絕高污染食品，從源頭上降低人體攝入DON的暴露風險。