葡萄籽原花青素通過Nrf2信號通路拮抗高糖高脂誘導(dǎo)的MIN6細胞鐵死亡

張麗媛，劉丹丹，李海燕，王同玲，陸 恒，楊瑞瑞，王 浩，丁玉松,*

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆第二醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 克拉瑪依 834000）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一類以糖脂代謝紊亂為特征的代謝性疾病[1]，胰島β細胞功能衰竭是T2DM發(fā)展的核心機制，有研究發(fā)現(xiàn)長期暴露在高水平的游離脂肪酸和葡萄糖條件下，最終導(dǎo)致胰島β細胞受損引起胰島素的分泌減少[2]。然而，高糖高脂（high glucose and high fat，GP）環(huán)境下胰島β細胞受損的機制尚未完全闡明。

鐵死亡是由于鐵的過量累積導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)細胞死亡的一種新型調(diào)節(jié)性細胞死亡形式[3]，其主要表現(xiàn)形式為鐵沉積、ROS累積、谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)過量的鐵貯存與T2DM的高風(fēng)險有關(guān)[4]，體外實驗研究證實飼喂高脂飲食的大鼠補充給予鐵劑能夠加重大鼠胰腺組織的炎癥和氧化損傷[5]，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)高糖能夠誘導(dǎo)胰島β細胞鐵沉積[6]。Wei Sen等[7]的研究發(fā)現(xiàn)砷通過誘導(dǎo)細胞內(nèi)鐵沉積，增加脂質(zhì)過氧化物的濃度導(dǎo)致胰腺組織發(fā)生鐵死亡。因此，鐵死亡有望成為治療和預(yù)防T2DM的新靶點。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號通路是細胞抗氧化的關(guān)鍵通路，Nrf2信號通路被認為在T2DM中起著重要的抗氧化作用[8]，且已經(jīng)成為脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下，將Nrf2的基因特異性敲除后增加了細胞對鐵死亡的敏感性，非諾貝特治療通過上調(diào)Nrf2進而抑制細胞鐵死亡[10]。葡萄籽原花青素提取物（grape seed procyanidin extract，GSPE）是一種天然的多酚類化合物，具有抗氧化和降低血糖、血脂的能力，本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，GSPE能夠通過激活Nrf2信號通路降低糖尿病大鼠的血糖水平，增強組織的抗氧化能力[11]，綜上，GSPE是潛在的治療糖尿病的天然藥物。因此，本研究擬通過GP干預(yù)小鼠胰腺瘤細胞MIN6細胞，建立胰島β細胞損傷模型。以GSPE進行干預(yù)，探討GP是否通過抑制Nrf2信號通路導(dǎo)致細胞鐵死亡，進而探討GSPE是否通過調(diào)控Nrf2信號通路拮抗GP誘導(dǎo)的MIN6細胞鐵死亡。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠胰島β細胞MIN6細胞（XF0390）購自上海富恒生物科技有限公司。

G P 試劑盒 西安鯤鵬科技有限公司；G S P E北京索萊寶公司；ROS、MDA、GSH試劑盒 南京建成生物工程研究所；去鐵胺（deferoxamine，DFO）（10 μmol/L）、RAS選擇性致死（RAS-selective lethal，RSL3）（10 μmol/L）、Erastin（20 μmol/L）、壞死抑制劑壞死抑素1（necrostatin-1，Nec-1）（10 μmol/L）、泛Caspase抑制劑（pan caspase inhibitor，Z-VAD-FMK）（10 μmol/L）、自噬抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）（10 μmol/L） 美國Med Chem Express公司；細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8 assay，CCK8） 安徽白鯊生物公司；兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗血紅素氧化酶1（heme oxygenase-1，HO-1）單克隆抗體、兔抗醌氧化還原酶1（NADPH: quinone oxido-reductase-1，NQO1）單克隆抗體、鐵代謝指標(biāo)兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）單克隆抗體、兔抗二價金屬離子蛋白轉(zhuǎn)運體（divalent metal transporter 1，DMT1）單克隆抗體、兔抗鐵蛋白（ferritin）單克隆抗體、鐵死亡的指標(biāo)蛋白兔抗溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）單克隆抗體、兔抗谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）單克隆抗體、兔抗酰基合成酶長鏈家族成員4（acylcoa synthetase long-chain family member 4，ACSL4）單克隆抗體 英國Abcam公司；羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、羊抗鼠IgG 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗鼠β-actin單克隆抗體武漢博士得生物工程有限公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水 蘇州吉瑪基因股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FC酶標(biāo)儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；3111二氧化碳培養(yǎng)箱 世爾科技（阿什威爾）有限公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺、SSW-420-2S電熱恒溫水槽、GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司；101電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SCIENTZ超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司；Ti2-LAPP熒光顯微鏡尼康儀器（上海）有限公司；TDL-50B離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；MLS-530L立式壓力蒸汽滅菌器普和希健康醫(yī)療器械（上海）有限公司；5200化學(xué)發(fā)光儀 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與分組

將細胞培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基（由10%（體積分數(shù)，下同）胎牛血清、體積分數(shù)1%青霉素鏈霉素以及體積分數(shù)0.1%β-巰基乙醇配制），放置于37 ℃和5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中，待細胞密度達至80%～90%下進行后續(xù)操作。

在GP誘導(dǎo)MIN6細胞發(fā)生鐵死亡時，用25 mmol/L葡萄糖和200 μmol/L棕櫚酸鈉混合作為GP試劑，分別干預(yù)細胞0、12、24、48 h，測定細胞活性，篩選GP干預(yù)細胞最佳時間；將細胞分為對照組（Control組）（僅添加1640完全培養(yǎng)基）、GP組（25 mmol/L葡萄糖和200 μmol/L棕櫚酸鈉）以及不同試劑（10 μmol/L DFO、10 μmol/L RSL3、20 μmol/L Erastin、10 μmol/L Nec-1、10 μmol/L Z-VAD-FMK、10 μmol/L CQ）分別聯(lián)合GP干預(yù)組，干預(yù)細胞24 h，測定細胞活性。

在測定GSPE對GP誘導(dǎo)MIN6細胞毒性損傷的影響時，通過不同質(zhì)量濃度0、10、20、30、40、50、75、100 mg/L GSPE分別干預(yù)細胞24 h，篩選GSPE適宜干預(yù)細胞的質(zhì)量濃度；然后用質(zhì)量濃度10、20、30 mg/L GSPE聯(lián)合GP分別處理MIN6細胞24 h，測定細胞活性。

在測定不同質(zhì)量濃度GSPE對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞內(nèi)鐵沉積、脂質(zhì)過氧化、鐵死亡以及通過Nrf2/HO-1對細胞發(fā)揮保護作用的影響時，將細胞分為Control（僅添加1640完全培養(yǎng)基）、GP、10 mg/L GSPE＋GP（L-GSPE）、20 mg/L GSPE＋GP（M-GSPE）組和30 mg/L GSPE＋GP（H-GSPE）組，分別測定細胞活性。

1.3.2 細胞活性檢測

將MIN6細胞按照7000 個/孔接種于96 孔板，在無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，進行實驗操作。根據(jù)CCK8說明書，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基和10 μL CCK8試劑，置于培養(yǎng)箱1～3 h，檢測450 nm波長處每孔的吸光度，以1640完全培養(yǎng)基為空白組，細胞存活率計算公式如下所示，以細胞存活率表示細胞活性。

1.3.3 MDA、GSH含量測定

MDA、GSH含量按照相應(yīng)試劑盒說明書進行測定。

1.3.4 ROS水平測定

使用2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）作為探針評估細胞ROS水平。將MIN6細胞以每孔2 mL接種于6 孔板中，與1 μmol/L DCFH-DA孵育30 min，然后用2 mL磷酸鹽緩沖液洗滌3 次。用熒光顯微鏡拍攝細胞的所有熒光圖像，放大倍數(shù)200，用熒光強度表征ROS水平。

1.3.5 Nrf2小干擾RNA轉(zhuǎn)染

為了探究鐵死亡是否被Nrf2信號通路調(diào)控，用5 μL/孔Nrf2小干擾RNA（Nrf2 small interfering RNA，Nrf2 siRNA）轉(zhuǎn)染MIN6細胞培養(yǎng)5 h后，用不同質(zhì)量濃度GSPE（10、20、30 mg/L）聯(lián)合GP培養(yǎng)MIN6細胞24 h后進行后續(xù)實驗。將細胞接種于6 孔板中，使其均勻鋪于板底部。取Nrf2 siRNA于10000 r/min離心5 min，將粉末離心至管底，加入62.5 μL的DEPC水，充分溶解。取1.5 mL的離心管。首先配制Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染液，分為A液和B液，A液：取5 μL的Nrf2 siRNA溶液，加入250 μL的無血清的1640完全培養(yǎng)基，孵育5 min。B液：5 μL的脂質(zhì)體（lipofectamine，Lip）2000溶液，加入250 μL的無血清的1640完全培養(yǎng)基，孵育5 min。將A液和B液混合，超凈臺中靜置20 min后，加入6 孔板中，放置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 h后吸出，加入pH 7.4、10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，之后加入GSPE或GP進行干預(yù)，Nrf2基因序列：GCAGGACAUGGAUUUGAUUTT（目的RNA序列5’-3’），AAUCAAAUCCAUGUCCUGCTT（目的RNA互補序列5’-3’），分別檢測Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4、SLC7A11的蛋白表達水平。

1.3.6 Western blot分析

用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的冰冷RIPA裂解緩沖液（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）提取蛋白，煮沸在－20 ℃?zhèn)溆谩Ｅ渲品蛛x膠和濃縮膠后在每孔中加入各組的細胞蛋白，用不同的恒壓電輻電泳，采用恒壓電輻“三明治”法轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，洗膜，孵一抗過夜，洗膜，孵二抗，洗膜，進行曝光，用Image J軟件定量分析蛋白灰度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。多組間的比較采用單因素方差分析，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GP誘導(dǎo)MIN6細胞發(fā)生鐵死亡

用25 mmol/L葡萄糖和200 μmol/L棕櫚酸鈉聯(lián)合分別處理細胞12、24、48 h，結(jié)果如圖1A所示，相較于0 h組，隨著時間的延長，細胞活性逐漸下降，呈現(xiàn)出時間效應(yīng)關(guān)系，綜合考慮選取24 h作為后續(xù)實驗條件。使用不同的試劑（10 μmol/L DFO、10 μmol/L RSL3、20 μmol/L Erastin、10 μmol/L Nec-1、10 μmol/L Z-VAD-FMK、10 μmol/L CQ）分別聯(lián)合GP干預(yù)MIN6細胞24 h，DFO是一種小分子鐵螯合劑，被認為是一種有效的鐵死亡抑制劑。RSL3是一種通過抑制GPX4活性來誘導(dǎo)鐵死亡的小分子化合物，被認為是一種有效的鐵死亡觸發(fā)劑，Erastin抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體活性，同時也是一種有效的鐵死亡誘導(dǎo)劑。Nec-1是一種細胞壞死抑制劑、Z-VAD-FMK是泛Caspase抑制劑、CQ是一種自噬抑制劑。圖1B顯示，與GP組相比，DFO能夠緩解GP誘導(dǎo)的MIN6細胞死亡（P＜0.05），RSL3和Erastin加重了GP誘導(dǎo)MIN6細胞死亡（P＜0.05），同時發(fā)現(xiàn)凋亡抑制劑Nec-1、壞死抑制劑Z-VAD-FMK、自噬抑制劑CQ對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞存活沒有顯著改善作用（P＞0.05），結(jié)果表明，鐵死亡可能存在于GP誘導(dǎo)的MIN6細胞死亡。

圖1 不同培養(yǎng)時間（A）和試劑（B）干預(yù)對MIN6細胞活性的影響Fig.1 Effect of culture time (A) and drug (B) interventions on the cell viability of MIN6 cells

2.2 GSPE對GP誘導(dǎo)MIN6細胞毒性損傷的影響

用不同質(zhì)量濃度（0、10、20、30、40、50、75、100 mg/L）的GSPE干預(yù)MIN6細胞24 h后，結(jié)果如圖2A所示，與0 mg/L組相比，GSPE質(zhì)量濃度在10～30 mg/L時細胞存活率無顯著差異（P＞0.05），表明質(zhì)量濃度10～30 mg/L的GSPE對MIN6細胞存活率沒有顯著影響。因此，為了研究GSPE處理對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞是否具有保護作用，進一步用質(zhì)量濃度10、20、30 mg/L GSPE聯(lián)合GP處理MIN6細胞24 h（后同），結(jié)果如圖2B所示，GSPE能夠減輕GP誘導(dǎo)MIN6細胞的毒性損傷，H-GSPE組（質(zhì)量濃度30 mg/L GSPE）相較于GP單獨干預(yù)組，細胞存活率顯著升高（P＜0.05）。

圖2 不同質(zhì)量濃度GSPE對MIN6細胞活性的影響Fig.2 Effect of GSPE on the cell viability of MIN6 cells

2.3 不同質(zhì)量濃度GSPE對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞內(nèi)鐵沉積的影響

圖3顯示，與Control組相比，GP組中的TfR1、DMT1、Ferritin蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），經(jīng)過GSPE的處理后，與GP組相比，TfR1、DMT1、Ferritin蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05）。以上結(jié)果表明GP誘導(dǎo)MIN6細胞死亡過程中伴隨著鐵水平的升高，經(jīng)過GSPE處理后能夠減少細胞內(nèi)的鐵水平。

圖3 不同質(zhì)量濃度GSPE對MIN6細胞內(nèi)鐵代謝指標(biāo)Ferritin、DMT1、TfR1蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of GSPE on protein expression levels of Ferritin,DMT1 and TfR1 in MIN6 cells

2.4 不同質(zhì)量濃度GSPE對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的影響

如圖4A所示，與GP組相比，質(zhì)量濃度20、30 mg/L的GSPE干預(yù)組MDA含量顯著下降（P＜0.05），GSH含量顯著升高（P＜0.05）（圖4B）。相較于Control組，GP組的綠色熒光增強，GSPE處理后細胞內(nèi)的熒光強度減弱（圖4C），這表明GSPE可能是通過提高細胞內(nèi)GSH含量，從而增加細胞內(nèi)的抗氧化能力，降低MDA含量和ROS水平。本實驗進一步研究了SLC7A11和GPX4、ACSL4的蛋白表達水平變化，結(jié)果顯示，與Control組相比，GP組的SLC7A11和GPX4的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），ACSL4的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。經(jīng)過GSPE處理后，與GP組相比，中、高劑量GSPE組的SLC7A11蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），低、中、高劑量GSPE組的GPX4蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；中、高劑量GSPE組的ACSL4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，GP誘導(dǎo)MIN6細胞死亡的過程中會引起脂質(zhì)過氧化，這可能是因為MIN6細胞發(fā)生鐵死亡的過程中存在脂質(zhì)過氧化。因此，GP誘導(dǎo)MIN6細胞死亡的機制是鐵死亡，GSPE能夠通過減輕細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，抑制MIN6細胞鐵死亡。

圖4 不同質(zhì)量濃度GSPE對MIN6細胞內(nèi)MDA含量、GSH含量、ROS熒光強度和鐵死亡指標(biāo)GPX4、SLC7A11、ACSL4蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of GSPE on levels of MDA and GSH,fluorescence intensity of ROS,and protein expression of GPX4,SLC7A11 and ACSL4 in MIN6 cells

2.5 不同質(zhì)量濃度GSPE通過Nrf2/HO-1對MIN6細胞發(fā)揮保護作用

由圖5可知，與GP組相比，低、中、高劑量組的GSPE的NQO1蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），中、高劑量組GSPE的HO-1蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），高劑量組的GSPE的Nrf2蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），這表明GSPE能夠激活Nrf2，從而提高下游的抗氧化酶HO-1、NQO1蛋白表達水平，增加MIN6細胞的抗氧化能力，改善細胞的損傷，GSPE可能是通過Nrf2信號通路來拮抗GP誘導(dǎo)的MIN6細胞鐵死亡。

圖5 MIN6細胞內(nèi)Nrf2信號通路水平Fig.5 Expression levels of proteins associated with Nrf2 signaling pathway in MIN6 cells

2.6 Nrf2 siRNA與GSPE對MIN6細胞的作用

以上結(jié)果表明，GSPE可能是通過Nrf2信號通路改善GP誘導(dǎo)的MIN6細胞鐵死亡，為了進一步研究Nrf2信號通路與鐵死亡的關(guān)系，用siRNA法對MIN6細胞轉(zhuǎn)染，特異性地沉默Nrf2，對MIN6細胞轉(zhuǎn)染5 h后，用GP與質(zhì)量濃度30 mg/L GSPE單獨或者聯(lián)合干預(yù)24 h。由圖6可知，在相同條件下，與GSPE siNrf2組細胞相比，GSPE組細胞中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4、SLC7A11的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），結(jié)果表明抑制Nrf2后細胞的抗氧化能力降低，GSPE的保護作用減弱，從而增強了GP誘導(dǎo)MIN6細胞鐵死亡的敏感性。

圖6 抑制Nrf2信號通路后MIN6細胞內(nèi)GPX4、NQO1、HO-1、SLC7A11、Nrf2蛋白表達水平Fig.6 Protein expression levels of GPX4,NQO1,HO-1,SLC7A11 and Nrf2 in MIN6 cells after Nrf2 signaling pathway inhibition

3 討論

高血糖和脂質(zhì)代謝紊亂可能誘導(dǎo)胰島β細胞功能障礙和細胞死亡[12]，研究表明，在長期高水平的葡萄糖以及脂肪酸作用下，能夠?qū)е乱葝uβ細胞失代償，即胰島β細胞出現(xiàn)胰島素分泌不足，無法維持機體正常的血糖水平，胰島β細胞損傷是T2DM的關(guān)鍵標(biāo)志[13]。Shu Tingting等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下誘導(dǎo)的胰島β細胞死亡是由于細胞內(nèi)鐵沉積導(dǎo)致ROS過度產(chǎn)生發(fā)生氧化應(yīng)激，細胞內(nèi)過量的鐵沉積以及脂質(zhì)過氧化物的增加是誘發(fā)鐵死亡的主要原因[14]。Bruni等[15]研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin和RSL3處理能夠損傷胰島組織的功能和活力，但在使用DFO處理后能夠改善這種損傷。在本次研究中首先建立胰島β細胞損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，GP對MIN6細胞的損傷加重，細胞存活率不斷下降。加入DFO后改善細胞損傷，加入RSL3和Erastin加重了細胞損傷，但是加入Nec-1、Z-VAD-FMK、CQ并沒有對細胞存活率有改善作用，并且發(fā)現(xiàn)GP能夠?qū)е翿OS水平、MDA含量升高，這提示GP可能誘發(fā)MIN6細胞鐵死亡。

鐵死亡是鐵依賴的，以脂質(zhì)過氧化為特征的程序性死亡，其形態(tài)學(xué)變化主要是線粒體嵴消失，線粒體膜密度增加，且已被證實與多種疾病有關(guān)[16]。血清鐵蛋白升高是T2DM的危險因素，能夠作為T2DM的早期診斷指標(biāo)之一[17-18]。Yasumura等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病模型中腎Ferritin蛋白表達水平升高；然而，Varghese等[20]研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)的雄性鼠中肝臟Ferritin蛋白表達水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)GP會導(dǎo)致MIN6細胞Ferritin蛋白表達水平升高。TfR1和DMT1是鐵的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，TfR1是一種跨膜的糖蛋白，是鐵進入細胞必需的蛋白，并能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鐵的濃度，TfR1的上調(diào)是細胞鐵死亡的顯著特征[21]。研究表明，DMT1上調(diào)會導(dǎo)致T2DM小鼠胰腺組織β細胞ROS水平升高和鐵的沉積[22]。研究發(fā)現(xiàn)，GP能夠誘導(dǎo)鐵代謝指標(biāo)TfR1、DMT1、Ferritin蛋白表達水平升高，因此，以上結(jié)果表明GP誘導(dǎo)MIN6細胞發(fā)生鐵沉積。

GSH是細胞中主要的非酶抗氧化劑，GSH是由谷氨酸、半胱氨酸以及甘氨酸縮合而成，具有直接的抗氧化作用，也是GPX4的合成底物[23]，MDA作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物。胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)（cystine/glutamate transporter system，XCT）的表達也可用于鑒定鐵死亡的生物標(biāo)志物[24]。XCT是由溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）和溶質(zhì)載體家族3成員2（solute carrier family 3 member 2，SLC3A2）組成的異二聚體，其功能是將胱氨酸導(dǎo)入進細胞內(nèi)進行GSH的合成和發(fā)揮抗氧化作用[25]。Wang Guoyan等[26]研究發(fā)現(xiàn)T-2毒素通過增加ROS的水平以及下調(diào)SLC7A11蛋白表達誘導(dǎo)細胞發(fā)生鐵死亡。ACSL4被證明是監(jiān)測鐵死亡的一個有用的生物標(biāo)志物，通過產(chǎn)生5-羥基二十基四烯酸介導(dǎo)的脂肪毒性來促進鐵死亡發(fā)展[27]。下調(diào)抗氧化酶GSH、GPX4、SLC7A11表達，上調(diào)ACSL4蛋白表達水平表達，這表明GP會導(dǎo)致MIN6細胞鐵沉積，降低細胞的抗氧化能力。

GSPE屬于多酚化合物，含有低聚物和單體黃酮聚合物，除了具有強的抗氧化能力，還具有抗病毒、抗菌、抗炎的作用，既往的研究表明GSPE能夠通過發(fā)揮其強的抗氧化能力減輕GP飲食誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂肪沉積，改善大鼠的血糖和脂代謝紊亂[28]。天然產(chǎn)物角鯊烯通過下調(diào)細胞中TfR1、ACSL4蛋白表達，上調(diào)SLC7A11和GPX4蛋白表達，增加細胞GSH含量，降低ROS熒光強度和MDA水平，拮抗Erastin誘導(dǎo)細胞鐵死亡[29]。Li Dan等[30]研究發(fā)現(xiàn)，天然多酚類化合物槲皮素通過抑制胰腺鐵沉積和胰島β細胞鐵死亡改善T2DM的病理發(fā)展過程。在本研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度10～30 mg/L GSPE對MIN6細胞活性沒有影響，GSPE可以提高GP誘導(dǎo)的MIN6細胞的活性，能夠逆轉(zhuǎn)GP干預(yù)下MIN6細胞的鐵死亡特征，其中包括降低MDA含量、ROS水平，下調(diào)TfR1、DMT1和Ferritin、ACSL4蛋白表達水平表達，上調(diào)GSH、GPX4、SLC7A11蛋白表達水平表達。以上結(jié)果證實，GSPE能夠抑制GP誘導(dǎo)的MIN6細胞鐵死亡。

Nrf2是細胞關(guān)鍵的維持氧化穩(wěn)定的調(diào)節(jié)因子，有證據(jù)表明Nrf2和鐵死亡有關(guān)，且鐵超載相關(guān)基因和脂質(zhì)過氧化基因是Nrf2的靶基因[31]。在氧化應(yīng)激或其他刺激下，能夠促進Nrf2積累和核易位當(dāng)進入細胞核后，Nrf2與一種小的Maf蛋白結(jié)合啟動抗氧化酶基因調(diào)控區(qū)的抗氧化/親電反應(yīng)元件（antioxidant/electrophile response elements，ARE）激活下游的II相解毒酶基因[32]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2可通過調(diào)節(jié)SLC7A11、HO-1蛋白表達抑制酒精性肝病鐵死亡[33]。經(jīng)動物實驗發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因特異性敲除地小鼠中肝臟和脾臟含鐵含量增加以及ROS水平升高，進而加劇小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)[34]，Liu Zixuan等[35]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因特異性敲除會降低SLC7A11表達，抑制GPX活性進而加強Erastin誘導(dǎo)的PC12細胞鐵死亡的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，MIN6細胞在受到GP刺激下，Nrf2表達水平升高，GSPE能夠通過激活Nrf2信號通路發(fā)揮其抗氧化能力，從而抑制GP誘導(dǎo)的細胞鐵死亡，此外，在抑制Nrf2后，GSPE抗氧化能力降低，下游的抗氧化酶HO-1、NQO1、GPX4、SLC7A11蛋白表達水平表達降低，細胞鐵死亡加速。

本研究結(jié)果表明，GSPE可能是通過激活MIN6細胞內(nèi)的Nrf2信號通路，上調(diào)抗氧化酶表達，進而減輕GP誘導(dǎo)的細胞鐵死亡，提高細胞存活率。