發酵乳桿菌CQPC04減輕小鼠血栓形成和調節腸道菌群的效果

易若琨，劉 佳，馮 霞，趙 欣

（重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協同創新中心，重慶 400067）

近年來，血栓成為繼高血壓、心臟病之后的又一類老年人高發疾病。血栓形成是心血管疾病致命性的主要原因，然而，大多數心腦血管疾病在發病前并無明顯體征，發病突然且嚴重，如不能得到及時治療，有很高的死亡風險[1-3]。此外，最新研究表明，腺病毒載體新冠疫苗可能導致血小板數量減少，從而誘發血栓形成，增加了普通人群注射新冠疫苗后的健康風險[4]。腹腔注射角叉菜膠能引起炎癥反應，產生大量炎癥因子和自由基釋放到血液中，小鼠尾部的股動脈一旦栓塞，側支循環困難，會使小鼠尾部組織形成血栓[5]。因此，本研究使用角叉菜膠誘導小鼠尾部炎癥，形成尾靜脈血栓，以檢驗實驗對象的抗血栓效果。

炎癥是引起血栓形成的一個重要因素，同時血栓形成和發展過程中產生的炎癥反應常伴有氧化應激損傷，進一步加重了炎癥和血栓程度[6]。研究顯示腸道菌群處于健康的平衡狀態有利于機體排毒和增強機體免疫力[7]，從而預防多種炎性疾病并抑制體內的自由基異常增加[8-10]。因此，保持腸道健康是調節炎癥和氧化應激的有效方式，也有可能對血栓的形成和發展起到預防和抑制作用。

自然發酵四川泡菜含有豐富的微生物，從四川泡菜中分離得到的乳酸菌在腸道內具有較好的定植作用，對包括便秘、結腸炎在內的腸道疾病有很好的預防作用[11-14]。同時四川泡菜中的乳酸菌還具有良好的降血脂和減肥作用[15]，因此乳酸菌可能通過調節血脂和減輕體質量來降低血栓形成風險[16]。課題組前期從傳統自然發酵的四川泡菜中分離得到1 株發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）CQPC04（以下簡稱LFCQPC04）[17]，本研究以角叉菜膠建立小鼠血栓形成模型，利用LF-CQPC04干預模型小鼠，通過測定小鼠凝血情況、氧化應激水平、炎癥水平及腸道內容物菌群組成分析LF-CQPC04干預對小鼠血栓形成的影響，探索LFCQPC04在預防和清除血栓形成方面的效果。在臨床上常使用藥物肝素對易栓癥患者進行治療，因此，本研究選擇肝素作為陽性藥物對照。

1 材料與方法

1.1 菌株、動物、材料與試劑

LF-CQPC04為課題組前期分離得到[17]，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏號：CGMCC No.14493）。

6 周齡SPF級雄性昆明小鼠購于重慶醫科大學實驗動物中心（生產許可證號：SCXK（渝）2018-0003）。本研究中實驗經過重慶市功能性食品協同創新中心動物實驗倫理委員會批準（批準號：2021070010B）。

肝素 美國Sigma公司；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6、核因子（nuclear factor，NF）-κB酶聯免疫吸附試驗試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）生化試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑盒、SuperScript IV試劑盒 美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒、定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物美國Thermo Fisher Scientific公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PUN-2048A半自動血凝儀 北京普朗有限公司；BX43光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Varioskan LUX多功能酶標儀、StoponePlus qPCR儀 美國賽默飛世爾科技公司；2100生物分析儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備和動物分組

取甘油凍藏管中的LF-CQPC04菌種，按照1%（以體系體積計，后同）的接種量接種于5 mL MRS液體培養基，37 ℃培養16～24 h之后，按照1%的接種量傳代培養16～24 h。取5 mL活化后的LF-CQPC04培養液3000 r/min 離心10 min后收集菌體沉淀，用無菌生理鹽水洗滌2 次，重懸于生理鹽水中制成1h 108CFU/mL和1h 109CFU/mL LF-CQPC04菌懸液。

6 周齡SPF級雄性昆明小鼠經7 d的適應性喂養后隨機挑選50 只小鼠（體質量為（23±2）g）進行實驗。小鼠被隨機分為正常組、模型組、肝素組、低劑量LF-CQPC04（LF-CQPC04-L）組和高劑量LF-CQPC04（LF-CQPC04-H）組，每組10 只。正常組小鼠腹腔注射0.01 mL/（gmbg d）生理鹽水，其余各組小鼠腹腔注射0.01 mL/（gmbg d）0.2%（質量分數）角叉菜膠溶液，誘導血栓形成，連續注射10 d[18]。腹腔注射后6 h，正常組和模型組每只小鼠灌胃0.2 mL/（gmbg d）生理鹽水，肝素組小鼠灌胃0.2 mL/（gmbg d）的20 mg/mL肝素溶液，LF-CQPC04-L組和LF-CQPC04-H組小鼠分別灌胃0.2 mL/（gmbg d）不同濃度（1h 108CFU/mL和1h 109CFU/mL）的LF-CQPC04菌懸液。干預10 d后小鼠禁食、水12 h，采用頸椎脫臼法處死小鼠，然后觀察小鼠尾部黑尾情況并拍照，用皮尺測定小鼠黑尾長度，解剖取出結腸并收集腸道（結腸部位）內容物，－80 ℃保存并送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序。解剖后立即用注射器對小鼠進行心臟取血，取小鼠結腸組織，用生理鹽水沖洗后－80 ℃保存待用，其中一部分小鼠的尾部組織置于福爾馬林溶液用以制作切片，剩余小鼠尾部組織用生理鹽水沖洗后－80 ℃保存待用。

1.3.2 血液凝血情況測定

采用半自動凝血儀測定小鼠血液凝血情況。測定前，血液均37 ℃預熱3 min，其余試劑均37 ℃預熱10 min。凝血酶原時間（prothrombin time，PT）測定時加入100 μL血液和200 μL PT試劑；活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）測定時在測定儀中加入100 μL血液和APTT試劑，然后加入100 μL CaCl2飽和溶液；凝血酶時間（thrombin time，TT）測定時在測定儀中加入100 μL血液和100 μL TT試劑；纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）質量濃度測定時在測定儀中加入20 μL血液和180 μL FIB稀釋緩沖液，然后加入100 μL FIB試劑。

1.3.3 小鼠血清氧化指標測定

將小鼠血液4 ℃、4000 r/min離心10 min，收集上清液即為血清，分別取20 μL血清根據相應試劑盒說明書測定小鼠血清中的SOD、CAT活力和MDA濃度[18]。

1.3.4 小鼠血清炎癥細胞因子質量濃度測定

按1.3.3節方法制備小鼠的血清，分別取20 μL血清，使用細胞因子檢測試劑盒分別測定小鼠血清中的TNF-α、IL-6、NF-κB和IL-1β質量濃度[19]。

1.3.5 小鼠尾組織的病理學觀察

取解剖后小鼠的尾組織用質量分數10%福爾馬林溶液固定。脫水處理48 h，然后組織樣品在石蠟中進行包埋后切片，并用蘇木精-伊紅試劑對組織進行染色。最后在光學顯微鏡下觀察尾組織的病理學變化[18]，放大倍數100 倍。

1.3.6 qPCR實驗

分別取100 mg小鼠結腸中段組織和剝離出小鼠尾靜脈組織，用無菌生理鹽水洗凈后按1∶9（m/V）加入無菌生理鹽水，組織勻漿后加入1.0 mL TRIzol試劑提取小鼠組織中的RNA，再將提取到的RNA質量濃度調整到1 μg/μL。使用SuperScript IV試劑盒進行反轉錄得到cDNA，接著配制反應體系，體系溶液包含cDNA（1 μL）、SYBR Green PCR Master Mix（10 μL）、無菌蒸餾水（7 μL）、10 μmol/L PCR引物（上、下游引物各1 μL）。擴增條件：95 ℃，60 s；95 ℃，15 s，40 個循環；55 ℃，30 s；72 ℃，35 s；95 ℃，30 s；55 ℃，35 s。以GAPDH為內參基因，采用2?ΔΔCt法分析各表達基因相對表達量[20]，引物序列如表1所示。

表1 所研究基因引物序列[21]Table 1 Primer sequences used in this study[21]

1.3.7 小鼠腸道內容物的高通量測序分析

將小鼠腸道內容物用AMPure XP磁珠進行純化并去除擴增產物中的游離引物和引物二聚體。使用Illumina平臺對待測樣品進行文庫構建。測序前用Qubit 2.0 Green雙鏈DNA測定法測定各PCR產物的DNA濃度，并使用生物分析儀進行質量控制。將小鼠腸道內容物DNA中16S rRNA的V3～V4可變區：338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）；806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）進行擴增，根據擴增子的濃度，將它們以等物質的量混合，采用Illumina MiSeq系統進行測序，最后使用在線Majorbio云平臺分析數據[22]。

1.4 數據統計與分析

實驗設置3 次平行實驗，結果以平均值±標準差表示。采用SAS 9.1軟件進行單因素方差分析，采用SNK（Student-Newman-Keuls）多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Excel 2016軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 小鼠黑尾長度

小鼠腹腔注射角叉菜膠后，除正常組外，其余各組小鼠尾尖逐步出現黑色區域，提示尾部形成血栓，造成黑尾（圖1）。其中模型組小鼠的黑尾長度（（9.4±0.4）c m）明顯長于其他組。LF-CQPC04-H組小鼠黑尾長度（（3.2±0.4）cm）與肝素組（（3.0±0.2）cm）相似，且無明顯差異。而L F-C Q P C 04-H 組和肝素組的黑尾長度明顯短于LF-CQPC03-L組（（7.8±0.5）cm）。

圖1 血栓小鼠的黑尾形態Fig.1 Black-tail morphology in thrombotic mice

2.2 小鼠的APTT、TT、FIB質量濃度和PT

正常組小鼠APTT（（183.6±10.8）s）顯著高于其他組（圖2），TT（（22.6±2.9）s）、FIB質量濃度（（50.6±5.5）g/L）和PT（（4.5±0.6）s）則顯著低于其他組（P＜0.05）。而模型組的APTT（（59.7±6.9）s）顯著低于其他組，TT（（89.7±6.6）s）、FIB質量濃度（（122.6±11.3）g/L）、PT（（23.1±3.1）s）則顯著高于其他組（P＜0.05）。LF-CQPC04-H組的APTT（（133.5±8.8）s）明顯高于LF-CQPC04-L組（（91.3±4.6）s）；TT（（43.1±5.1）s）、FIB質量濃度（（71.6±6.7）g/L）、PT（（13.3±2.5）s）均顯著低于LF-CQPC04-L組（P＜0.05）。LF-CQPC04-H組APTT、TT、FIB質量濃度、PT與肝素組相似，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 血栓小鼠的APTT（A）、TT（B）、FIB質量濃度（C）和PT（D）Fig.2 APTT (A),TT (B) and blood FIB concentration (C) and PT (D)in thrombotic mice

2.3 小鼠血清的SOD、CAT活力和MDA濃度

如圖3 所示，正常組小鼠血清中的SOD（（420.06±30.35）U/mL）和CAT（（83.54±4.10）U/mL）活力顯著高于其他組（P＜0.05），MDA 濃度（（20.54±2.21）nmol/mL）顯著低于其他組（P＜0.05）。肝素組和LF-CQPC04-H組的SOD、CAT活力低于正常組，但均顯著高于LF-CQPC04-L組（P＜0.05）。模型組小鼠SOD活力（（177.89±18.97）U/mL）和CAT活力（（22.57±2.22）U/mL）顯著低于其他組（P＜0.05）。模型組MDA 濃度（（90.36±5.09）nmol/mL）最高，LF-CQPC04-L組MDA濃度顯著低于模型組（P＜0.05），但顯著高于肝素組和LF-CQPC04-H組（P＜0.05）。

圖3 血栓小鼠血清的SOD（A）、CAT（B）活力和MDA濃度（C）Fig.3 SOD (A) and CAT (B) activities and MDA concentration (C) in serum of thrombotic mice

2.4 小鼠血清的TNF-α、IL-6、NF-κB和IL-1β質量濃度

實驗結果表明，正常組、肝素組、LF-CQPC04-H、LF-CQPC04-L和模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、NF-κB和IL-1β質量濃度呈現出由低到高的趨勢（圖4）。其中，肝素組和LF-CQPC04-H組TNF-α、IL-6、NF-κB、IL-1β質量濃度顯著低于LF-CQPC04-L組（P＜0.05），而與LF-CQPC04-H組之間無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 血栓小鼠血清中TNF-α（A）、IL-6（B）、NF-κB（C）和IL-1β（D）質量濃度Fig.4 TNF-α (A),IL-6 (B),NF-κB (C) and IL-1β (D) contents in serum of thrombotic mice

2.5 小鼠尾組織的病理學觀察

小鼠尾組織染色切片結果如圖5所示，正常組小鼠尾部血管圓潤干凈，血管壁光滑；模型組小鼠尾血管有炎性細胞滲出、出血性病變、血小板聚集且血管內有血栓（箭頭處）形成；LF-CQPC04和肝素干預均能減輕小鼠尾部血管的病變，其中LF-CQPC04-H和肝素的干預效果相似，且均優于LF-CQPC04-L。

圖5 血栓小鼠尾部組織病理學觀察結果Fig.5 H&E-stained sections of tail tissue of thrombotic mice

2.6 小鼠結腸組織的相關mRNA相對表達水平

如圖6所示，正常組小鼠結腸組織中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的mRNA相對表達水平最高，而模型組上述mRNA的相對表達水平最低。LF-CQPC04-H組和肝素組小鼠結腸組織中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的mRNA相對表達水平接近，且高于LF-CQPC04-L組。正常組小鼠結腸組織中NF-κB p65、IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA相對表達水平明顯低于于其他組，而模型組上述mRNA相對表達水平則顯著高于其他組（P＜0.05）。LF-CQPC04和肝素均能顯著下調血栓小鼠結腸組織中NF-κB p65、IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA相對表達水平，其中LF-CQPC04-H與肝素的效果相似，兩者的效果均顯著優于LF-CQPC04-L（P＜0.05）。

圖6 血栓小鼠結腸組織中Cu/Zn-SOD（A）、Mn-SOD（B）、CAT（C）、NF-κB p65（D）、IL-6（E）、TNF-α（F）和IFN-γ（G）的mRNA相對表達水平Fig.6 Relative mRNA expression levels of Cu/Zn-SOD (A),Mn-SOD (B),CAT (C),NF-κB p65 (D), IL-6 (E),TNF-α (F) and IFN-γ (G) in colon tissues of thrombotic mice

2.7 小鼠尾靜脈組織的相關mRNA相對表達水平

qPCR實驗結果顯示，模型組小鼠尾靜脈血管中NF-κB p65、細胞間黏附分子（cell adhesion molecule，ICAM）-1、血管細胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）-1和E-選擇素（E-selectin）的mRNA相對表達水平最高（圖7）。LF-CQPC04-L、LF-CQPC04-H和肝素可顯著下調血栓小鼠尾靜脈血管中NF-κB p65、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的mRNA相對表達水平（P＜0.05）。同時，LF-CQPC04-H和肝素組小鼠上述mRNA相對表達水平沒有顯著差異（P＞0.05），且高于正常組。

圖7 血栓小鼠尾靜脈組織中NF-κB p65（A）、ICAM-1（B）、VCAM-1（C）和E-selectin（D）的mRNA相對表達水平Fig.7 Relative mRNA expression levels of NF-κB p65 (A),ICAM-1 (B),VCAM-1 (C),and E-selectin (D) in tail vein tissues of thrombotic mice

2.8 小鼠腸道內容物菌群α-多樣性分析結果

通過α-多樣性指數分析得到了小鼠腸道內容物菌群中菌群的豐富度、多樣性等信息。如表2所示，各組測序深度均高于0.999，說明測序深度已飽和，實驗數據合理可用。其中Ace指數、Chao指數反映菌群總數，越高表明菌群豐富度越高；Shannon指數和Simpson指數能夠反映菌群的多樣性，較大的Shannon指數與較小的Simpson指數可以反映更高的菌群多樣性。正常組、LF-CQPC04組和肝素組的Ace、Chao和Shannon指數均顯著高于模型組，Simpson指數顯著低于模型組，表明正常組、LFCQPC04組和肝素組小鼠糞便中菌群的豐度和多樣性更高。并且除Simpson指數外，不同劑量LF-CQPC04組間的菌群豐度和多樣性存在明顯差異，LF-CQPC04-H組的菌群豐度和多樣性高于LF-CQPC04-L組。同時，LFCQPC04-H組Ace、Chao和Shannon指數均高于正常組和陽性對照肝素組，Simpson指數低于正常組和陽性對照肝素組，提示在灌胃高劑量LF-CQPC04后，小鼠腸道內容物菌群豐度和多樣性顯著上升。

表2 α-多樣性指數Table 2 α-Diversity indices

2.9 小鼠腸道內容物菌群β-多樣性

β-多樣性分析可反映不同樣本菌群間是否存在差異性。本研究通過主成分分析（principal component analysis，PCA）來反映樣本之間的多樣性距離關系。如圖8所示，通過ANOSIM法進行組間差異檢驗后發現，不同組別的物種組成存在顯著性差異（R2＝0.4148，P＝0.001）。其中與模型組相比，正常組、LF-CQPC04干預組和肝素組的腸道菌群組成結構均發生了偏移，而LF-CQPC04干預組與正常組的物種組成具有一定的相似性，并且LF-CQPC04-H組與正常組物種組成最為接近，LF-CQPC04-H組在調節小鼠腸道菌群方面效果較為顯著。

圖8 血栓小鼠腸道內容物菌群PCA結果Fig.8 Principal component analysis of microbiomes in intestinal contents of thrombotic mice

2.10 小鼠腸道內容物菌群組成

根據微生物分類學分析結果可以觀察到不同組小鼠腸道內容物中在各分類水平上的群落結構組成情況。如圖9所示，5 組菌群組成在門水平上以擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）2 個菌門為主。其中，正常組中厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度比值（F/B）為1.28。與模型組相比，LF-CQPC04干預后F/B明顯下降，LF-CQPC04-L組F/B為0.82，LF-CQPC04-H組F/B為0.78，陽性對照肝素組F/B為0.40，各組存在明顯差異。并且與LF-CQPC04-L組相比，LF-CQPC04-H組F/B更低。

圖9 血栓小鼠腸道內容物中細菌的相對豐度（門水平）Fig.9 Relative abundance of bacteria in intestinal contents of thrombotic mice (phylum level)

屬水平上的物種相對豐度如圖10 所示。正常組主要由norank_f_Muribaculaceae（22.07%）、LachnospiraceaeNK4A136（12.37%）、Bacteroides（11.05%）、unclassified_f__Lachnospiraceae（8.20%）和Lactobacillus（7.18%）構成。模型組中的菌群主要包含Candidatus_Arthromitus（63.13%）、Lactobacillus（17.88%）、Bacillus（11.33%）等。肝素組中菌群包含norank_f_Muribaculaceae（39.86%）、Bacteroides（12.17%）、Lactobacillus（5.92%）。LF-CQPC04組中菌群主要包含norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus、Bacteroides、Lachnospiraceae NK4A136、unclassified_f__Lachnospiraceae，與正常組的菌群構成最為相似。

圖10 血栓小鼠腸道內容物中細菌的相對豐度（屬水平）Fig.10 Relative abundance of bacteria in intestinal contents of thrombotic mice (genus level)

3 討論

角叉菜膠能夠引起小鼠尾部血管內炎癥相關血栓的形成，使小鼠尾部血管充滿混合血栓，進而導致尾部組織缺血性壞死，形成明顯的黑尾[23]。因此小鼠黑尾的長度是直觀判斷血栓形成程度的重要實驗指標。本研究也證明了角叉菜膠可以在小鼠尾部形成明顯的黑尾。肝素和LF-CQPC034均能減輕血栓引起的尾部發黑，且高劑量LF-CQPC04效果優于低劑量LF-CQPC04。此外，LFCQPC03-H可以達到與常用抗血栓藥物肝素相近的效果。

在血栓形成過程中大量凝血因子被消耗，從而使PT延長，而凝血因子含量下降將會導致APTT縮短。同時，在凝血酶的作用下，FIB不斷轉化為纖維蛋白，后者作為血栓的主要成分促使血液處于高凝狀態。由于血液持續保持高凝狀態，且血液中纖維蛋白含量也持續增加，機體被迫加強纖溶作用，使纖維蛋白不斷降解，從而使TT延長[24-27]。本研究中LF-CQPC04和肝素均能調節APTT、TT、FIB質量濃度和PT，特別是LF-CQPC04-H和肝素干預后這些指標接近正常水平，改善血栓小鼠凝血異常。

自由基積累是誘發和加劇血栓形成的重要因素，活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以直接激活血小板，增加血栓形成的風險[28]。ROS還可激活NF-κB信號通路，促進血栓分子分泌，導致靜脈血栓的形成[29]。研究表明自由基清除劑可以預防鐵離子誘發的血栓形成，體現了氧化應激在血栓形成中的重要作用。SOD可催化超氧陰離子自由基歧化生成氧氣和過氧化氫，在體內平衡氧化和抗氧化方面起著至關重要的作用[30]。Cu/Zn-SOD和Mn-SOD是哺乳動物中存在的兩種重要的SOD類型。CAT可促進過氧化氫分解為氧氣和水，是機體抵御氧化的重要酶系之一[31]。作為抗氧化酶，SOD和CAT既是防止ROS對機體造成損害的重要酶，也是抑制氧化應激引起血栓形成的有效活性物質[32]。在生物體中，自由基引起脂質引起過氧化，從而形成MDA，能夠間接反映機體受到氧化應激損傷的程度，因此MDA濃度也是判斷血栓形成的重要指標[33]。本研究中，血栓形成后小鼠體內氧化應激水平升高，SOD和CAT活力及mRNA相對表達水平降低，MDA濃度升高。這些結果表明血栓形成與氧化應激密切相關。高劑量LF-CQPC04干預可以促使這些與氧化相關的指標接近正常狀態的水平，且LF-CQPC04-H的干預效果與抗血栓藥物肝素相似。

炎癥在血栓的形成過程中有相互促進的循環作用，機體出現炎癥后，TNF-α、IL-6、NF-κB和IL-1β等炎癥介質大量產生，其中TNF-α可以調節下游NF-κB信號通路，然后促進巨噬細胞釋放IL-6、IL-1β和IFN-γ等炎癥因子，從而加劇血管內皮細胞損傷，促使血栓的逐步形成[34]。本研究中小鼠血栓形成后TNF-α、IL-6、NF-κB、IL-1β和IFN-γ的質量濃度或mRNA相對表達水平也出現大幅度提升，LF-CQPC04顯示出明顯的炎癥細胞因子抑制效果，且與肝素干預的效果相似。小鼠體內的炎癥和氧化應激反應導致尾部出現血栓，同時也可能引起腸道炎癥，導致腸道內皮細胞損傷[35]。因此，觀察腸道損傷程度也是判斷角叉菜膠所引起實驗性血栓形成程度的一種手段。本研究結果表明，小鼠尾部血栓形成后，小鼠結腸組織的炎癥因子表達也發生變化，再次證明小鼠尾部血栓形成與腸道病變密切相關。藥物肝素和LF-CQPC04都可以抑制這些變化。因此，具有益生菌潛力的LF-CQPC04可以發揮與肝素相近的抗炎作用。

血栓形成和發展的過程中NF-κB作為炎癥關鍵因子具有非常重要的作用，NF-κB能夠促進血小板的大量積累和炎癥的加劇，使機體中的凝血平衡被打破，從而誘發血栓的形成[36]。ICAM-1在調節細胞基質的黏附中有很重要的作用[37]，而VCAM-1能夠進一步促進血小板的積累[38]，ICAM-1和VCAM-1的激活和過表達都能夠加劇炎癥和誘發血栓。E-selectin的激活能夠加劇內皮細胞的炎癥，導致內皮細胞出現損傷和影響其通透性，同時對血液中的總白細胞數產生影響，還可以調控血管內皮細胞之間的黏附性[39]，這些影響均直接與血栓的形成相關。而NF-κB則是ICAM-1、VCAM-1和E-selectin關鍵調節基因，從而關聯相關基因的表達，影響血栓的形成[40]。本研究也顯示LF-CQPC04對NF-κB、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表達具有明顯的調控作用，從而調控血栓的發展。

研究顯示腸道菌群與炎癥和氧化應激反應密切相關，臨床數據顯示腸炎和關節炎患者的腸道菌群與健康人群的腸道菌群存在較大差異，這些患者腸道菌群中的有害菌增加，菌群的豐度相比正常狀態會出現較大變化[41]。腸道菌群失衡與心血管疾病密切相關，高脂血癥、肥胖、2型糖尿病等疾病的發病過程中腸道菌群都出現明顯變化[42]。本研究顯示血栓導致小鼠腸道菌群豐度發生變化，LF-CQPC04可以調節血栓小鼠的細菌豐度，恢復腸道健康，這可能在抑制血栓形成中發揮積極作用。

副擬桿菌屬（Parabacteroides）是與促進肥胖有關的微生物[43]；克雷伯氏菌屬（Klebsiella）是腸道中僅次于大腸桿菌的第二大有害菌[44]。本實驗結果表明，模型小鼠腸道內的有害細菌較多，包括副擬桿菌和克雷伯氏菌。乳桿菌屬（Lactobacillus）是可用作益生菌的一類微生物，正常小鼠的腸道中含有較多有益的乳桿菌[45]。另支菌屬（Alistipes）已被證明具有干擾炎癥的作用[46]，而毛螺菌科（Lachnospiraceae）已顯示出對造血系統和腸道系統的保護作用[47]。乳桿菌屬、另支菌屬和毛螺菌科微生物都是人體中重要的有益菌，LF-CQPC04能夠增加血栓小鼠腸道中這些有益菌的相對豐度，從而恢復腸道健康，減輕炎癥，進而抑制血栓形成。

本研究分析LF-CQPC04對小鼠血栓形成的抑制作用。結果表明，LF-CQPC04能有效調節小鼠的凝血功能、血清和組織中的氧化應激和炎癥水平。腸道菌群分析結果表明LF-CQPC04可以調節血栓小鼠腸道微生物組成，可能通過增加有益菌相對豐度促進腸道健康，改善血栓造成的腸道菌群失調。但是，LF-CQPC04進一步的應用需要開展臨床研究和人體實驗。